分子生物學(xué)蛋白質(zhì)ppt課件

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1、第二章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 StructureandFunctionofProtein 任何一個蛋白質(zhì)分子 在其天然狀態(tài)或活性形式下 都具有特定的基本結(jié)構(gòu)和獨特而穩(wěn)定的空間構(gòu)象 這是蛋白質(zhì)分子在結(jié)構(gòu)上的一個最顯著的特征 我們要研究蛋白質(zhì)的功能 就必需要研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 不僅要研究其一級結(jié)構(gòu) 還要了解其空間構(gòu)象 這樣才能全面而深入的闡明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系 自然界中存在著數(shù)千種蛋白質(zhì) 他們各具有不同的生物學(xué)功能 這是由不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)所決定的 StructureandFunctionofProtein 一 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)與功能 一 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu) 二 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 某些蛋

2、白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中有一些特定的序列能阻礙蛋白質(zhì)表現(xiàn)出生物功能 只有將其切除后才能形成有活性的蛋白質(zhì) 也有些蛋白質(zhì)因一級結(jié)構(gòu)序列的差異可能影響蛋白質(zhì)的正常功能而引起疾病 是指蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸的排列順序 是由基因上的遺傳密碼所決定的 又稱蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu) 是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ) 它決定蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的所有層次 一 活性蛋白質(zhì)與前體 許多活性蛋白質(zhì)都有一個不具有生物活性的前體 需經(jīng)專一性蛋白酶的限制性水解 切去一個或幾個肽段 才能轉(zhuǎn)變成有活性的蛋白質(zhì) 許多激素 如 胰島素 甲狀腺素 生長激素和胰高血糖素等均存在激素前體 另有多種蛋白水解酶和凝血酶也都是由其前體 酶原轉(zhuǎn)變而來 前體蛋白均無生物活性 胰

3、島素前體及其激活 人的胰島素最初由胰腺細(xì)胞合成時 是一條由110個氨基酸殘基組成的前胰島素原肽鏈 其N端有一個約24個氨基酸殘基組成的信號肽 富含疏水氨基酸 因此可穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜 將新生肽鏈輸送到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔 經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的信號肽酶作用 剪去信號肽序列 形成胰島素原 proinsulin 胰島素原是一條有86個氨基酸殘基組成的多肽鏈 B鏈在前 A鏈在后 C鏈 連接肽 插在中間當(dāng)胰島素原在高爾基體包裝并分泌時 A B鏈間的C鏈才被切除 生成由A鏈與B鏈組成的具有生物活性的胰島素 胰島素前體的激活 前胰島素原 1 24 110 信號肽酶 胰島素原 1 86 31 32 胰蛋白酶 64 65 信號肽 B鏈

4、 C鏈 A鏈 A鏈 B鏈 S S S S 21 30 C鏈 31 C肽 無活性 類羧肽酶H 胰島素 有活性 高爾基體 胰島 細(xì)胞核糖核蛋白體 二 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與分子病 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變 甚至只有一個氨基酸殘基發(fā)生改變 即可使蛋白質(zhì)功能發(fā)生改變 嚴(yán)重時可導(dǎo)致疾病 這種由于基因突變而導(dǎo)致蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)改變后表現(xiàn)出生理功能異常 使機(jī)體出現(xiàn)病態(tài)現(xiàn)象 稱為分子病 鐮刀狀紅細(xì)胞貧血病是最早被認(rèn)識的一種分子病 1949年P(guān)auling發(fā)現(xiàn)鐮刀狀紅細(xì)胞貧血病是由于患者紅細(xì)胞中含有一種異常血紅蛋白 HbS 所致 1956年Ingram采用指紋圖譜分析其一級結(jié)構(gòu) 發(fā)現(xiàn)HbS與正常人HbA的一級結(jié)構(gòu)僅有一個

5、氨基酸的差異 正常HbA的 鏈N端第六位氨基酸為谷氨酸 在病人HbS中 N端第六位谷氨酸被纈氨酸所取代 谷 纈 其他完全相同 這種Hb分子一級結(jié)構(gòu)的微小改變 使原來處于分子表面的含有可解離基團(tuán)側(cè)鏈的谷氨酸被具有疏水性側(cè)鏈的纈氨酸取代 從而使HbS的 亞基表面形成局部疏水區(qū) 稱為粘斑 這種Hbs在氧分壓低的情況下進(jìn)行線形締合 形成纖維狀沉淀 導(dǎo)致與氧的親和力降低 并使RBC被扭曲成鐮刀狀 可塑性下降 容易破裂溶血 蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)包括 二級結(jié)構(gòu) secondarystructure 三級結(jié)構(gòu) tertiarystructure 四級結(jié)構(gòu) quaternarystructure 二 蛋白質(zhì)的空間結(jié)

6、構(gòu)與功能 一 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu) 是指多肽鏈骨架中各原子的局部空間排布 也就是多肽鏈中氨基酸殘基的相對空間位置 是多肽鏈主鏈骨架中的若干肽段所形成的有規(guī)則的空間排布 如 螺旋 折疊 轉(zhuǎn)角和無規(guī)則的空間排布 顯然 它只關(guān)系到蛋白質(zhì)分子主鏈原子的空間排布 而不涉及側(cè)鏈的構(gòu)象以及與其他肽段的關(guān)系 二 超二級結(jié)構(gòu) 是蛋白質(zhì)構(gòu)象中二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)之間的一個層次 是指在多肽鏈內(nèi) 一些二級結(jié)構(gòu)單元在三維折疊中彼此靠近 相互作用 從而形成有規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)聚合體 可作為結(jié)構(gòu)域的組成單位或直接充作三級結(jié)構(gòu)的 建筑塊 這種二級結(jié)構(gòu)聚合體稱為超二級結(jié)構(gòu) 目前發(fā)現(xiàn)的超二級結(jié)構(gòu)有三種基本結(jié)構(gòu)形式 1 螺旋組合體 是由2個

7、相鄰的 螺旋聚集而成 這種組合非常穩(wěn)定 主要存在于 角蛋白和原肌球蛋白等纖維狀蛋白中 2 折疊組合體 是由3個或3個以上相鄰的 折疊聚集而成 他們之間互相以短鏈相連 若由多條 折疊所構(gòu)成的 折疊片 可卷曲成圓筒狀結(jié)構(gòu) 如超氧化物歧化酶的 折疊筒含8條 折疊 3 螺旋 折疊組合體 是由一個 螺旋和與之首尾相鄰的兩個 折疊聚集而成 有時可由兩組 聚合在一起 形成更復(fù)雜的超二級結(jié)構(gòu) 主要存在于球蛋白中 如LDH 三 結(jié)構(gòu)域 在一些相當(dāng)大的蛋白質(zhì)分子中 由于多肽鏈上相鄰的超二級結(jié)構(gòu)緊密聯(lián)系 形成在三維空間上明顯區(qū)別的局部區(qū)域 稱為結(jié)構(gòu)域 結(jié)構(gòu)域一般由100 200個氨基酸殘基組成 具有獨特的空間結(jié)構(gòu)

8、并具有不同的生物學(xué)功能 較大的蛋白質(zhì)分子可含有兩個或多個結(jié)構(gòu)域 如木瓜蛋白酶含有2個結(jié)構(gòu)域 IgG含有12個結(jié)構(gòu)域 一個蛋白質(zhì)分子中的幾個結(jié)構(gòu)域有的是相同的 如硫氰酸酶的2個結(jié)構(gòu)域是相同的 有的則是不同的 如木瓜蛋白酶的2個結(jié)構(gòu)域不相同 不同蛋白質(zhì)中也可有相似的結(jié)構(gòu)域 如LDH和蘋果酸脫氫酶都以NAD 為輔酶 都由2個不同的結(jié)構(gòu)域組成 其中與NAD 結(jié)合的結(jié)構(gòu)域是基本相同的 五 蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu) 是指一條多肽鏈中所有原子的空間排布 這條多肽鏈可以是完整的蛋白質(zhì)分子 也可以是多亞基蛋白質(zhì)的亞基 也可以說 具有二級結(jié)構(gòu) 超二級結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)域的一條多肽鏈 由于順序上相隔較遠(yuǎn)的氨基酸殘基側(cè)鏈的相互作用

9、而進(jìn)行范圍廣泛的盤曲和折疊 形成包括主 側(cè)鏈在內(nèi)的空間排布 這種由一條多肽鏈所形成的三維空間的整體排布稱為三級結(jié)構(gòu) 六 模序 模體motif 隨著蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)研究的進(jìn)展 在許多蛋白質(zhì)分子中 可發(fā)現(xiàn)2個或3個具有二級結(jié)構(gòu)的肽段 在空間上相互接近 形成立體形狀或拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)頗為類似的 具有特殊功能的局部區(qū)域 被稱為模序 每個模序都有特征性的氨基酸序列 并發(fā)揮特殊功能 如 鈣結(jié)合模序 鋅指模序 亮氨酸拉鏈 都具有結(jié)合DNA的功能 鈣結(jié)合蛋白中結(jié)合鈣離子的模序 鋅指模序 堿性亮氨酸拉鏈 七 蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu) 許多蛋白質(zhì)分子作為一個活性單位時 是由兩條以上的多肽鏈組成 這些多肽鏈都有各自的三級結(jié)構(gòu) 稱為蛋

10、白質(zhì)分子的亞基 有二個或二個以上亞基借非共價鍵聚合在一起就形成蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu) 分子量在55000以上的蛋白質(zhì)幾乎都有亞基 亞基雖然具有三級結(jié)構(gòu) 但單獨存在時均無生物活性 只有聚合成完整的四級結(jié)構(gòu)才具有生物活性 是指亞基的立體排布 亞基間相互作用和接觸部位的布局 八 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的折疊 蛋白質(zhì)翻譯的產(chǎn)物多肽鏈必須正確的折疊才能形成具有天然構(gòu)象的蛋白質(zhì) 新生肽鏈的折疊在肽鏈合成中 合成后完成 新生肽鏈N 端在核蛋白體上一出現(xiàn) 肽鏈的折疊即開始 可能隨著序列的不斷延伸肽鏈逐步折疊 產(chǎn)生正確的二級結(jié)構(gòu) 模序 結(jié)構(gòu)域到形成完整空間構(gòu)象 蛋白質(zhì)折疊的研究 比較狹義的定義就是研究蛋白質(zhì)特定三維空間結(jié)構(gòu)形

11、成的規(guī)律 穩(wěn)定性和與其生物活性的關(guān)系 在概念上有熱力學(xué)和動力學(xué)的問題 幾種有促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊功能的大分子 1 分子伴侶 molecularchaperon 2 蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶 proteindisulfideisomerase PDI 3 肽 脯氨酰順反異構(gòu)酶 peptideprolyl cis transisomerase PPI 細(xì)胞中大多數(shù)天然蛋白質(zhì)折疊都不是自動完成 而需要其他酶和蛋白質(zhì)輔助 指導(dǎo)新生蛋白質(zhì)按特定方式進(jìn)行正確的折疊 1 分子伴侶 molecularchaperon 分子伴侶 molecularchaperon 是細(xì)胞內(nèi)一類可識別肽鏈的非天然構(gòu)象 促進(jìn)各功能域和整體蛋白

12、質(zhì)的正確折疊的保守性蛋白質(zhì) 分子伴侶有以下功能 封閉待折疊蛋白質(zhì)所暴露的疏水區(qū)段 創(chuàng)建一個隔離的環(huán)境 可以使蛋白質(zhì)的折疊互不干擾 促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊和去聚集 遇到應(yīng)激刺激 使已折疊的蛋白質(zhì)去折疊 1 熱休克蛋白 heatshockprotein HSP 2 伴侶蛋白 chaperonin 分子伴侶主要有 1 熱休克蛋白 heatshockprotein HSP 性質(zhì) 熱休克蛋白屬于應(yīng)激反應(yīng)性蛋白質(zhì) 高溫應(yīng)激可誘導(dǎo)該蛋白質(zhì)合成 種類 大腸桿菌的熱休克蛋白包括 HSP70 HSP40和GrpE三族 作用 可促進(jìn)需要折疊的多肽折疊為有天然空間構(gòu)象的蛋白質(zhì) 它有兩個主要功能域 一個是存在于N 端的高度保守

13、的ATP酶結(jié)構(gòu)域 能結(jié)合和水解ATP 另一個是存在于C 端的多肽鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域 蛋白質(zhì)的折疊需要這兩個結(jié)構(gòu)域的相互作用 在蛋白質(zhì)的折疊過程中 HSP70還需2個輔助因子HSP40和GrpE 大腸桿菌的HSP70 DnaK 基因DnaK編碼 可激活DnaK中的ATP酶 生成穩(wěn)定的DnaJ DnaK ADP 被折疊蛋白質(zhì)復(fù)合物 以利于DnaK發(fā)揮分子伴侶作用 在ATP存在的情況下 DnaJ和DnaK的相互作用能抑制蛋白質(zhì)的聚集 GrpE 核苷酸交換因子 與DnaK的ATP酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合 使DnaK的構(gòu)象發(fā)生改變 ADP從復(fù)合物中釋放出來并由ATP代替ADP 從而控制DnaK的ATP酶活性 HSP40

14、DnaJ 大腸桿菌中的HSP70反應(yīng)循環(huán) 伴侶蛋白 2 伴侶蛋白 chaperonin 伴侶蛋白是分子伴侶的另一家族 如大腸桿菌的GroEL和GroES 真核細(xì)胞中同源物為HSP60和HSP10 等家族 其主要作用是為非自發(fā)性折疊蛋白質(zhì)提供能折疊形成天然空間構(gòu)象的微環(huán)境 當(dāng)待折疊肽鏈進(jìn)入GroEL的桶狀空腔后 GroES可作為 蓋子 瞬時封閉GroEL空腔出口 封閉后的桶狀空腔提供了能完成該肽鏈折疊的微環(huán)境 GroEL GroES復(fù)合物 14個相同亞基構(gòu)成多聚體 每7個亞基圍成一圈 上下兩圈堆砌成桶狀空腔 頂部是空腔出口 可作為 蓋子 瞬時封閉GroEL空腔出口 GroEL GroES反應(yīng)循環(huán)

15、 九 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 酶是具有催化活性的蛋白質(zhì) 同樣具有一 二 三級結(jié)構(gòu) 有些酶還具有四級結(jié)構(gòu) 自然界的酶有數(shù)千種 各種酶都具有特異的催化功能 這是由于各種酶的空間結(jié)構(gòu) 特別是酶活性中心的空間構(gòu)像不同所決定的 酶活性中心的空間構(gòu)象是酶表現(xiàn)活性的關(guān)鍵部位 不同酶活性中心的空間構(gòu)象不同 因而具有特異的催化活性 酶活性中心空間構(gòu)像的維持依賴于酶蛋白的二 三級結(jié)構(gòu)的完整性 當(dāng)酶受到各種變性因素作用時 酶蛋白空間結(jié)構(gòu)破壞 活性中心的構(gòu)像改變 酶失去催化活性 1 酶的空間結(jié)構(gòu)與催化功能的關(guān)系 天然狀態(tài) 有催化活性 尿素 巰基乙醇 去除尿素 巰基乙醇 非折疊狀態(tài) 無活性 核糖核酸酶的變性和復(fù)性

16、2 與蛋白質(zhì)錯誤折疊有關(guān)的疾病 有些蛋白質(zhì)肽鏈錯誤折疊后會相互聚集 形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀 對機(jī)體產(chǎn)生毒性而發(fā)病 如 紋狀體脊髓變性病 老年癡呆癥 瘋牛病 柏金森氏病等 有許多神經(jīng)性疾病 淀粉樣蛋白聚集在腦中 最常見的是老年性癡呆癥 在患有老性癡呆病人的腦中 塞滿了由錯誤折疊蛋白質(zhì)形成的雜亂的蛋白質(zhì)簇 1 蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病 若蛋白質(zhì)的肽鏈折疊發(fā)生錯誤 盡管其一級結(jié)構(gòu)不變 但蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變 仍可影響其功能 嚴(yán)重時可導(dǎo)致疾病發(fā)生 此類疾病被稱為蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病 又稱為 折疊病 2 瘋牛病的發(fā)病機(jī)理 瘋牛病可以通過食用病肉而被感染 它是由一種被稱為朊病毒的蛋白質(zhì) prionprotein

17、 PrP 感染引起的人和動物神經(jīng)系統(tǒng)疾病 這類疾病具有傳染性 遺傳性或散在發(fā)病的特點 其在動物間的傳播是由PrP組成的傳染性顆粒 不含核酸 完成的 PrP是染色體基因編碼的蛋白質(zhì) 人類PrP基因位于20號染色體短臂上 編碼253個氨基酸 正常人和動物PrP為分子量33 35kD的蛋白質(zhì) 其中 螺旋結(jié)構(gòu)占整個分子的40 片層結(jié)構(gòu)很少甚至沒有 其水溶性強(qiáng) 對蛋白酶敏感 稱為PrPc 富含 螺旋PrPc在某種X蛋白 可能是一種伴侶蛋白 幫助介導(dǎo)蛋白質(zhì)折疊 的作用下可轉(zhuǎn)變成全為 折疊的致病性PrP 稱為PrPsc 在正常機(jī)體中 PrP是神經(jīng)活動所需的蛋白質(zhì) 而致病PrP與正常PrP的一級結(jié)構(gòu)完全相同

18、僅空間結(jié)構(gòu)不同 說明由正常狀態(tài)向致病狀態(tài)轉(zhuǎn)化涉及到蛋白質(zhì)構(gòu)象變化或翻譯后修飾 重新折疊 在體內(nèi) 外源的或新生的PrPsc可作為模板 通過復(fù)雜的機(jī)制使細(xì)胞內(nèi)正常的僅含 螺旋的PrPc重新折疊成為僅含 折疊的致病性PrPsc 以瘋牛病為代表的多種折疊病的發(fā)病機(jī)理足以證明蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與其功能的密切關(guān)系 PrPsc能抗蛋白水解酶 水溶性差 對熱穩(wěn)定 可以相互聚集 最終形成淀粉樣纖維沉淀 而導(dǎo)致疾病發(fā)生 三 蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)相互作用 在生物體內(nèi) 相同或不同蛋白質(zhì)分子之間以及蛋白質(zhì)與配體之間存在著相互作用 這對于機(jī)體的生理活動具有重要意義 一 分子與亞基的聚合 有些蛋白質(zhì)其分子或亞基能進(jìn)一步締合 如胰島素

19、單體 Ins 在溶液中能發(fā)生下列聚合反應(yīng) 2Ins Ins2 二聚體 2Ins2 2Ins2 四聚體 3Ins2 3In2 六聚體 單體不同于亞基 因而聚合體不屬于四級結(jié)構(gòu) 多聚體分子形式的存在具有一定的意義 如胰島素六聚體不易被蛋白酶水解失活 蛋白質(zhì)分子或亞基因聚合方式不同 形成4種不同形式的聚合體 4 螺旋狀聚合體 聚合體呈螺旋狀 如 煙草花葉病毒 TMV 外殼蛋白由2130個亞基組成 亞基排列成右手螺旋 每圈含16 3個亞基 螺距2 5nm 螺旋長度300nm 1 線性聚合體 分子成線性聚合 聚合度可很大 線性聚合與許多蛋白質(zhì)的生理功能有關(guān) 例如 機(jī)動蛋白與肌球蛋白 各自線性聚合成細(xì)絲和

20、粗絲 細(xì)絲和粗絲的相互作用 引起肌肉收縮 2 環(huán)狀聚合體 聚合體呈環(huán)狀 具有對稱性 例如 電鏡下觀察到鉬鐵蛋白四個亞基呈環(huán)狀對稱排列 3 多面體聚合體 蛋白質(zhì)分子的各個亞基排列在多面體的各個頂點或邊上 形成一種多面體結(jié)構(gòu) 三 不同蛋白質(zhì)分子間的聚合 不同蛋白質(zhì)分子間的聚合在生物學(xué)上有著重要的意義 例如 抗原與抗體結(jié)合產(chǎn)生免疫反應(yīng) 蛋白質(zhì)類激素與相應(yīng)受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng) 功能相關(guān)的酶分子聚合在一起 形成具有一定結(jié)構(gòu)的多酶復(fù)合體 發(fā)揮重要催化作用 如 丙酮酸脫氫酶復(fù)合體 五 分子識別 在不同的生物大分子之間 普遍存在著一種專一性結(jié)合現(xiàn)象 例如 酶與底物 激素與受體 抗原與抗體以及調(diào)節(jié)蛋白與DNA

21、之間的專一性結(jié)合 生物大分子之間的這種專一性結(jié)合稱為分子識別 四 分子自我裝配 某些細(xì)胞器 細(xì)胞器碎片以及病毒 在拆散成各組分 蛋白質(zhì) 核酸 糖類以及其它成分后 在特定條件下 又能自動裝配成具有原來生物學(xué)功能的細(xì)胞器 細(xì)胞器碎片和病毒 這種過程稱為自我裝配 四 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)和功能 所以測定其一級結(jié)構(gòu)具有重要意義 自1955年英國科學(xué)家F sanger首次完成牛胰島素氨基酸序列測定至今 已有上千種蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)被測出 一 蛋白質(zhì)測序的策略 1 確定蛋白質(zhì)的純度在97 以上 2 測定多肽鏈的數(shù)目 3 拆分多肽鏈 4 分析每一條多肽鏈的氨基酸組成 5

22、鑒定多肽鏈的N 末端和C 末端氨基酸殘基 6 用兩種以上方法裂解多肽鏈成較小的肽段 7 測定各肽段的氨基酸序列 8 拼接各肽段成完整的多肽鏈 9 確定二硫鍵的位置 二 蛋白質(zhì)測序的方法 1 樣品的處理 測序蛋白質(zhì)的純化 測序蛋白質(zhì)首先要采用合適的方法進(jìn)行純化 如 凝膠層析 例子交換層析 離心等 使其雜蛋白不超過5 測定蛋白質(zhì)的分子量 采用電泳 層析或離心等方法測出測序蛋白質(zhì)的分子量 以估算其氨基酸的數(shù)目 2 氨基酸組成分析 為了確定蛋白質(zhì)的氨基酸組分 先要將蛋白質(zhì)樣品水解 然后定量分析其氨基酸種類和數(shù)目 由于沒有一種能使肽鏈完全水解而所有氨基酸不被破壞的方法 因而常采用幾種不同的水解方法 以確

23、保每種氨基酸能正確測定 常用的水解法有酸 堿和酶解法三種 酸解法 該方法一般采用6mol LHCl在真空條件下于110 水解24 72小時 水解后除去過量的酸 大部分氨基酸可定量回收 此法優(yōu)點是 水解完全 不引起氨基酸發(fā)生旋光異構(gòu) 缺點是 色氨酸 TrP 和半胱氨酸 Cys 全部破壞 Asn和Gln轉(zhuǎn)變成Asp和Glu 因而需用其他方法彌補(bǔ)其缺點 堿解法 一般采用2 4mol LNaoH100 水解4 8小時 優(yōu)點是不破壞色氨酸 缺點是氨基酸可發(fā)生異構(gòu) 酶解法 由于酶的水解具有特異性 所以常用混合酶進(jìn)行水解 常用的酶有外切酶 內(nèi)切酶或鏈霉蛋白酶等 優(yōu)點是 條件溫和 設(shè)備簡單 不破壞氨基酸 不發(fā)

24、生異構(gòu)化 缺點是 時間長 水解不易完全 中間產(chǎn)物多 分析 水解后所得的氨基酸混合物 可用電泳法 離子交換層析法和高壓液相層析法分離鑒定 從而可知多肽鏈氨基酸種類和數(shù)目 目前多采用氨基酸自動分析儀定量測定 儀器由分離和分析兩大系統(tǒng)組成 分離系統(tǒng)應(yīng)用聚苯乙烯陽離子交換樹脂 通過離子交換柱層析使各種氨基酸得到分離 分析系統(tǒng)應(yīng)用分光分析法測定 3 肽鏈末端氨基酸的分析 2 4二硝基氟苯在pH8 9的弱堿性條件下與肽鏈N 端氨基酸的 氨基結(jié)合 形成二硝基苯肽鏈 稱為DNP 肽鏈 然后用酸水解 肽鏈中的肽鍵全部斷裂 生成游離氨基酸 由于二硝基氟苯與N 端氨基縮合形成的鍵十分穩(wěn)定 不受酸解破壞 所以水解后生

25、成DNP 氨基酸 黃色的DNP 氨基酸可用乙醚抽提出來 用層析法鑒定即可知道N 末端是哪種氨基酸 N 端氨基酸分析 二硝基氟苯法 DNFB法 DNFB法原理 丹磺酰氯法 丹磺酰氯 DNS Cl 在pH9 5的堿性條件下能專一性的與肽鏈N端的氨基結(jié)合生成氨磺酰衍生物DNS 肽 經(jīng)鹽酸水解 得到DNS 氨基酸 用乙酸乙酯提取后 用聚丙烯酰胺薄層層析可分離到DNS 氨基酸 由于DNS 氨基酸在紫外線下產(chǎn)生強(qiáng)烈綠色熒光 故可用熒光分析法測出N 端氨基酸 DNS Cl法原理 異硫氰酸苯酯法 在弱堿性條件下 異硫氰酸苯酯 PITC 與肽鏈N 端氨基結(jié)合后 形成苯氨基硫甲酰 肽 PTC 肽 經(jīng)弱酸水解 N

26、端氨基酸殘基的肽鍵斷裂 生成苯乙內(nèi)酰硫脲氨基酸 PTH 氨基酸 PTH 氨基酸可用乙酸乙酯提取出來 然后用層析法鑒定 即可確定N 端氨基酸 C 端氨基酸的分析 羧肽酶是一種外肽酶 它可專一性的切斷C 端氨基酸的肽鍵 使C 端氨基酸游離下來 分離并鑒定游離氨基酸 即C 端氨基酸 常用的羧肽酶有A B C和Y四種 他們各具有特性 羧肽酶A可水解芳香族氨基酸與側(cè)鏈較大的脂肪族氨基酸所構(gòu)成的C 端肽鍵 羧肽酶B水解由堿性氨基酸構(gòu)成的C 端肽鍵 羧肽酶C專一切C 端脯氨酸的肽鍵 羧肽酶Y能水解各種氨基酸在C 端的肽鍵 這是一種最適用的羧肽酶 羧肽酶法 肼解法 將蛋白質(zhì)和無水肼在100 反應(yīng)5 10小時后

27、 除C 端氨基酸外 其它所有的氨基酸殘基都轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酰肼化合物 酰肼可與苯甲醛作用形成不溶性的二亞芐基衍生物而除去 剩下的氨基酸就是C 端氨基酸 可用層析法鑒定出是哪一種氨基酸 肼解法原理 4 肽鏈的分離 靠非共價鍵結(jié)合的常用酸 堿 變性劑 去污劑等使其破壞 靠共價結(jié)合的 因比較牢固 需用特殊的化學(xué)的作用二硫鍵斷裂法有 過甲酸氧化法 二硫鍵與過甲酸反應(yīng)生成磺酸 同時二硫鍵斷裂 巰基還原法 二硫鍵在過量巰基乙醇 半胱氨酸 二巰基蘇糖醇等存在下被還原為巰基而被打斷 經(jīng)過解析開來的單鏈 可應(yīng)用各種層析或電泳法予以分離 由二條以上肽鏈組成的蛋白質(zhì) 肽鏈間的結(jié)合可能是靠非共價鍵結(jié)合 也可能是靠共價鍵結(jié)

28、合 進(jìn)行肽鏈順序分析時 首先要將它們分離開來 5 肽鏈的部分水解及肽段分離 蛋白酶水解法 水解肽段常用的蛋白酶有胰蛋白酶 胰凝乳蛋白酶 胃蛋白酶 木瓜蛋白酶等 它們各有其專一性 例如 胰蛋白酶能專一性水解由精氨酸 Arg 和賴氨酸 Lys 的羧基構(gòu)成的肽鍵 生成的肽段C末端為Arg和Lys 胰凝乳蛋白酶主要水解芳香族氨基酸 Phe Tyr 羧基形成的肽鍵 生成的肽段C末端是Phe和Tyr 分離得到單鏈后 一般由于太長 需水解成適當(dāng)大小的肽段后再作順序分析 水解肽段的方法有酶水解法和化學(xué)水解法兩大類 化學(xué)水解法 最常采用的是鹽酸水解法 但因?qū)Ｒ恍圆?同時產(chǎn)物不易分離 現(xiàn)已很少采用 目前最常用的方

29、法是溴化氰水解法 溴化氰能專一性水解蛋氨酸 Met 羧基形成的肽鍵 通過以上酶解法和化學(xué)水解法 可以使長的肽鏈斷裂成小的肽段 水解后的肽段混合物可用凝膠過濾 離子交換層析 薄層層析及電泳等方法將其分離開來 6 肽段氨基酸序列測定 常用Edman降解法 其基本原理是將肽段與異硫氰酸苯酯 PITC 反應(yīng) 使PITC先與肽段的N 端氨基結(jié)合 并在酸性條件下環(huán)化斷裂 生成穩(wěn)定的PITC衍生物 稱為PTH 氨基酸 用層析法鑒定出N端氨基酸 剩余的肽段再作第二輪循環(huán)分析 用于鑒定末端的第二個氨基酸 如此反復(fù)循環(huán)可確定出肽鏈氨基酸順序 現(xiàn)已將Edman降解程序引入自動系統(tǒng) 稱為順序分析儀 7 肽鏈氨基酸序列

30、的確定 將每個小肽段的氨基酸序列測出后 可用肽鏈重疊法確定出整條肽鏈的氨基酸順序 現(xiàn)用一個16肽為例 通過測定推測出氨基酸順序 2 分別用胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶水解后 所得肽段經(jīng)Edman降解法測出氨基酸順序 用胰凝乳蛋白酶水解得4個肽段其各自順序是 C 1 Thr Arg PheC 2 Asn Gly Ser TyrC 3 Asp Gln AspC 4 Gly Ala lys leu Ala Tyr 1 末端分析 N 端 AsnC 端 Asp 用胰蛋白酶水解得3個肽段 其各自順序為 T 1 Asn Gly Ser Tyr Thr ArgT 2 Leu Ala Tyr Asp Gln AspT

31、 3 Phe Gly Ala Lys 3 確定全部肽鏈序列 綜合以上兩種酶水解肽段順序 找出關(guān)鍵重疊序列 從而推出此多肽鏈的氨基酸序列 c 2 Asn Gly Ser TyrT 1 Asn Gly Ser Tyr Thr ArgC 1 Thr Arg PheT 3 Phe Gly Ala LysC 4 Gly Ala lys leu Ala TyrTyrT 2 Leu Ala TyrTyr Asp Gln AspC 3 Asp Gln Aspaa序列 Asn Gly Ser Tyr Thr Arg Phe Gly Ala Lys Leu Ala Tyr Asp Gln Asp 多肽鏈中氨基酸序

32、列分析 分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成 測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸殘基 把肽鏈水解成片段 分別進(jìn)行分析 測定各肽段的氨基酸排列順序 一般采用Edman降解法 一般需用數(shù)種水解法 并分析出各肽段中的氨基酸順序 然后經(jīng)過組合排列對比 最終得出完整肽鏈中氨基酸順序的結(jié)果 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)測定方法及數(shù)量 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)測定年增長圖 第一節(jié) X 射線衍射技術(shù)用于蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)測定 原理基本過程優(yōu)缺點應(yīng)用實例 一 相關(guān)原理 光的衍射現(xiàn)象X射線的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用本質(zhì)的爭論X射線衍射的發(fā)現(xiàn)晶體學(xué)基礎(chǔ)知識X射線晶體衍射 光線 拐彎了 1 光的衍射現(xiàn)象 衍射現(xiàn)象 光波偏離直線傳播而出現(xiàn)光

33、強(qiáng)不均勻分布的現(xiàn)象 當(dāng)縫的大小 或障礙物的大小 跟波長相差不多時就發(fā)生明顯的衍射現(xiàn)象 如果縫很寬 其寬度遠(yuǎn)大于波長 則波通過縫后基本上是沿直線傳播的 衍射現(xiàn)象就很不明顯了 惠更斯 菲涅耳原理 菲涅耳補(bǔ)充 從同一波陣面上各點發(fā)出的子波是相干波 1818年 惠更斯 光波陣面上每一點都可以看作新的子波源 以后任意時刻 這些子波的包跡就是該時刻的波陣面 1690年 解釋不了光強(qiáng)分布 2 X射線的發(fā)現(xiàn)歷程及應(yīng)用 失之交臂1836法拉第發(fā)現(xiàn)陰極射線1861克魯克斯陰極射線管在放電時會產(chǎn)生亮光干版和光片有問題 1890古德斯柏德洗出了一張X射線的透視底片照片的沖洗藥水或沖洗技術(shù)發(fā)現(xiàn)X射線本質(zhì)的爭論X射線衍射

34、 2 X射線的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用 1895年倫琴 Roentgen 發(fā)現(xiàn)故稱為倫琴射線 倫琴夫人的手的X射線照片 X射線在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用 倫琴的新發(fā)現(xiàn)轟動了全世界 不到三個月 維也納的一家醫(yī)院便拍出了應(yīng)用于醫(yī)療的X射線照片 從此 X射線拍片和射線透視成為醫(yī)學(xué)診療中常用的手段 為了防止各臟器成像發(fā)生的重疊給診療帶來不便 科學(xué)家們進(jìn)一步研究了成像更清晰 靈敏度更高的儀器 1972年 英國科學(xué)家漢斯菲爾德運(yùn)用計算機(jī)和圖像重建理論 制成了電子計算機(jī)射線斷層掃描成像裝置 也就是已被廣泛應(yīng)用的CT X射線與諾貝爾獎 物理學(xué)獎 倫琴因發(fā)現(xiàn)X射線而獲得第一屆諾貝爾物理學(xué)獎 1903年諾貝爾物理學(xué)獎 1906年的諾貝爾物

35、理學(xué)獎 勞厄獲得了1914年諾貝爾物理學(xué)獎 英國的布拉格父子1915年的諾貝爾物理學(xué)獎 英國的巴克拉1917年的諾貝爾物理學(xué)獎 瑞典物理學(xué)家西格班1924年諾貝爾物理學(xué)獎 美國的康普頓1927年諾貝爾物理學(xué)獎 前蘇聯(lián)的切連科夫1958年諾貝爾物理學(xué)獎 美國的霍夫斯塔特1961年諾貝爾物理學(xué)獎 瑞典的西格巴恩1981年的諾貝爾物理學(xué)獎 化學(xué)獎 荷蘭的物理化學(xué)家德拜1936年諾貝爾化學(xué)獎 美國著名化學(xué)家鮑林1954年諾貝爾化學(xué)獎 英國生物學(xué)家肯德魯與佩魯茨1962年諾貝爾化學(xué)獎 英國女化學(xué)家霍奇金1964年諾貝爾化學(xué)獎 美國化學(xué)家利普斯科姆1976年諾貝爾化學(xué)獎 英國化學(xué)家桑格和美國化學(xué)家吉爾伯特

36、1980年諾貝爾化學(xué)獎 英國生物化學(xué)家克盧格因1982年諾貝爾化學(xué)獎 美國化學(xué)家豪普特曼和卡爾1985年諾貝爾化學(xué)獎 1988年 米歇爾等三位德國生物化學(xué)家諾貝爾化學(xué)獎 3 X射線本質(zhì)的爭論 X射線本質(zhì)的爭論 波動說 巴克拉 X射線波動性標(biāo)識譜線 不管元素已化合成什么化合物 它們總是發(fā)射一種硬度的X射線 當(dāng)原子量增大時 標(biāo)識X射線的穿透本領(lǐng)會隨著增大 這說明X射線具有標(biāo)識特定元素的特性 X射線本質(zhì)的爭論 微粒說 X射線微粒論者粒子具有旋轉(zhuǎn)性 布拉克父子 4 X射線衍射 X射線衍射的獲得 波長范圍 10 0 1埃欲觀察其衍射現(xiàn)象則衍射線度應(yīng)與其波長差不多 晶體的晶格常數(shù)恰是這樣的線度衍射波的兩個

37、基本特征 衍射線 束 在空間分布的方位 衍射方向 和強(qiáng)度與晶體內(nèi)原子分布規(guī)律 晶體結(jié)構(gòu) 密切相關(guān) X射線晶體結(jié)構(gòu)分析 使用X射線作為物理工具 依賴X射線衍射現(xiàn)象為物理原理 以晶體作為研究對象 晶體結(jié)構(gòu)作為研究結(jié)果的一種分析方法 5 X射線的獲得 X射線管 激光等離子體 同步輻射 X射線激光 6 晶體基礎(chǔ) 什么是晶體晶體的周期排布晶體的對稱性 3 1什么是晶體 固體物質(zhì)晶體相當(dāng)罕見的東西 非晶體晶體 Crystal 指離子 原子或分子這些微粒在三維空間中周期性重復(fù)排列形成的 能夠給出明銳衍射的固體結(jié)構(gòu) 晶體什么樣 1 晶體什么樣 2 晶體什么樣 3 晶體什么樣 4 2 晶體和點陣結(jié)構(gòu) 晶體的周期

38、性結(jié)構(gòu)使得我們可以把它抽象成 點陣 來研究 一維周期性結(jié)構(gòu)與直線點陣二維周期性結(jié)構(gòu)與平面點陣三維周期性結(jié)構(gòu)與空間點陣 一維周期性結(jié)構(gòu)與直線點陣 二維周期性結(jié)構(gòu)與平面點陣 三維周期性結(jié)構(gòu)與空間點陣 晶胞 Unitcell 空間點陣的單位 大小和形狀完全相同的平行六面體 是晶體結(jié)構(gòu)的最小單位 同一個空間點陣 劃分平行六面體的方式是多種多樣的 選擇平行六面體的原則 所選平行六面體的對稱性應(yīng)符合整個空間點陣的對稱性 選擇棱與棱之間直角關(guān)系為最多的平行六面體 所選平行六面體之體積應(yīng)最小 當(dāng)對稱性規(guī)定棱間的交角不能為直角關(guān)系時 應(yīng)選擇結(jié)點間距小的行列作為平行六面體的棱 且棱間的交角接近于直角的平行六面體

39、單位平行六面體 a b c 是表征它本身形狀 大小的一組參數(shù) 稱為格子參數(shù)或點陣參數(shù) 單位平行六面體與坐標(biāo)軸的關(guān)系 棱交角 坐標(biāo)軸之間交角 a b c 軸單位 a b c 關(guān)系有七種情況 與單位平行六面體七種格子相對應(yīng) 立方格子a b c 90o 三方格子a b c 90o 60 109o28 16 菱面體格子中 為特殊角度時 演變成的三種立方體格子 四方格子a b c 90o 六方格子a b c 90o 120o 正交格子a b c 90o 單斜格子a b c 90o 90o 三斜格子a b c 90o 按結(jié)點位置 可有四種不同的類型 P 原始格子 角頂 C 底心格子 角頂 頂?shù)酌?I 體心

40、格子 角頂 體心 F 面心格子 角頂 每個面 P 原始格子 角頂 C 底心格子 角頂 頂?shù)酌?I 體心格子 角頂 體心 F 面心格子 角頂 每個面 結(jié)構(gòu)中代表各類等同點的結(jié)點在空間的排列方式來說 格子的種類有 且只有十四種 衍射方向 二 X射線晶體結(jié)構(gòu)測定基本過程 蛋白質(zhì)獲取 提純 晶體生長并經(jīng)冷凍技術(shù)處理 重原子衍生物制備 衍射數(shù)據(jù)收集 衍生數(shù)據(jù)分析和改進(jìn) 結(jié)構(gòu)模型的獲取 包括修正 2 晶體生長過程及影響因素 晶核 盡量少 微晶 可用作晶種 晶體在數(shù)小時至數(shù)月后出現(xiàn)2個問題 是鹽晶嗎 能給出有用的衍射嗎 多晶 雙晶 影響因素物理因素 溫度 壓力 震動 溶劑清潔度 試劑純度 重力 外加物理場等

41、生物化學(xué)因素 pH 離子強(qiáng)度 沉淀劑 添加劑的類型和濃度等其他 溶液過飽和度 純度等 經(jīng)驗 機(jī)器人 2 晶體生長過程及影響因素 3 結(jié)晶方法 批量結(jié)晶法batchcrystallization透射法crystallizationbydialysis液相擴(kuò)散法liquiddiffusion氣相擴(kuò)散法vapordiffusion氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)Enhancedamidehydrogen deuterium exchangemassspectrometry DXMS生物玻璃bioglass 4 晶體的初步鑒定 5 衍射數(shù)據(jù)收集 晶體的處理 低溫液氮氣冷流技術(shù)數(shù)據(jù)收集儀 底片 面探測器 衍射分析儀器的

42、發(fā)展 射線種類 連續(xù)射線特征射線電子衍射中子衍射 探測技術(shù) 膠片閃爍體計數(shù)器 點 IP CCD探測器 面 圖2 22石英的衍射儀計數(shù)器記錄圖 部分 右上角為石英的德拜圖 衍射峰上方為 hkl 值 代表K 衍射 底片 外森堡相機(jī) 徘循相機(jī) 優(yōu)點 多點同時收集容易保存價格便宜缺點存在 化學(xué)霧 背景和X射線散射背景費時 費力 計數(shù)管 四圓衍射儀 將X射線光子強(qiáng)度轉(zhuǎn)換為電信號 信號放大后再轉(zhuǎn)換成數(shù)字存入計算機(jī)隨時調(diào)用逐點收集數(shù)據(jù)優(yōu)缺點與底片相反 面探技術(shù) SMARTAPEX CCD衍射儀 SmartCCDOverview SMARTAPEX CCD探測器 金屬絲構(gòu)成的面板 可同時多點收集將X射線光子強(qiáng)

43、度轉(zhuǎn)換為電信號集計數(shù)管的精確和底片的多點收集效率 面探技術(shù) SMARTAPEX CCD衍射儀 圖像板imageplate 面探測器的改進(jìn)由化學(xué)材料構(gòu)成 整塊板子密度一致高分辨率可見光下可測量集底片和面探測器的優(yōu)點于一身 6 數(shù)據(jù)分析 電子密度修飾電子密度圖詮釋結(jié)構(gòu)模型精化數(shù)據(jù)處理軟件 Denzo Scalepack 三 X射線晶體結(jié)構(gòu)測定優(yōu)點 分辨率高不損傷樣品無污染相對快捷能得到晶體完整性的大量信息 晶體構(gòu)象是靜態(tài)的 不能測定不穩(wěn)定的過渡態(tài)的構(gòu)象 很多蛋白質(zhì)很難結(jié)晶 或者很難得到用于結(jié)構(gòu)分析的足夠大的單晶 瓶頸 X射線晶體衍射的工作流程較長 四 X射線晶體結(jié)構(gòu)測定存在問題 Lastupdat

44、e TuesdayOct20 2009at5PMPDT 于1971年和1972年分別得到分辨率為2 5埃和1 8埃的豬胰島素晶體測定 這是中國闡明的第一個蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu) 豬胰島素 蛋白質(zhì)編號4ins 的兩條小鏈 中國蛋白質(zhì)晶體學(xué)研究水平和世界發(fā)達(dá)國家一樣高 胰島素晶體最好的電子密度圖在北京 不在牛津 多蘿西 霍奇金 1972 五 應(yīng)用實例1 胰島素 2 菠菜捕光蛋白LHCII 膜 疏水 2 72 Nature 2004 Mar LHC II是綠色植物中含量最豐富的主要捕光復(fù)合物 這種復(fù)雜的分子體系鑲嵌在生物膜中 具有很強(qiáng)的疏水性 難以分離和結(jié)晶 對其晶體結(jié)構(gòu)的測定是國際公認(rèn)的高難課題 也是一

45、個國家結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究水平的重要標(biāo)志 03年利用北京同步輻射實驗室生物大分子晶體學(xué)線站獲得了該晶體的高分辨率衍射數(shù)據(jù) 最終獲得2 72 分辨率的晶體結(jié)構(gòu) 發(fā)表于 Nature 2004年3月18日作為封面文章 Changetal Nature428 287 2004 意義 發(fā)現(xiàn)了膜蛋白結(jié)晶的第三種類型 提供了近3萬個獨立 精確的原子坐標(biāo) 復(fù)習(xí)思考題 簡述X射線晶體結(jié)構(gòu)測定的基本過程 了解晶體鑒定的基本要點 熟悉X射線晶體結(jié)構(gòu)測定的優(yōu)缺點 第三章 蛋白質(zhì)工程技術(shù) Proteinengineering 蛋白質(zhì)工程的崛起 第一節(jié) 一 蛋白質(zhì)工程崛起的緣由 通過基因工程能夠大規(guī)模生產(chǎn)生物體內(nèi)微量存在的活

46、性物質(zhì) 并借助轉(zhuǎn)基因而改變動植物性狀 得以在人類醫(yī)療保健中進(jìn)行基因診斷和基因治療 然而在廣泛利用自然界各種蛋白質(zhì)的過程中就發(fā)現(xiàn) 這些蛋白質(zhì)只是適應(yīng)生物自身的需要 而對它們進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化開發(fā)往往不合意 需要加以改造 1983年Ulmer首先提出蛋白質(zhì)工程 它是指按照特定的需要 對蛋白質(zhì)進(jìn)行分子設(shè)計和改造的工程 自此以后 蛋白質(zhì)工程迅速發(fā)展 已成為生物工程的重要組成部分 基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì) 這些天然蛋白質(zhì)是生物在長期進(jìn)化過程中形成的 它們的結(jié)構(gòu)和功能符合特定物種生存的需要 卻不一定完全符合人類生產(chǎn)和生活的需要 基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)工程就是為了生

47、產(chǎn)出符合人類生產(chǎn)和生活需要的蛋白質(zhì) 甚至是自然界不存在的蛋白質(zhì) 滿足人類生產(chǎn)和生活的需要 玉米中賴氨酸含量比較低 天冬氨酸激酶 352位的蘇氨酸 二氫吡啶二羧酸合成酶 104位的天冬酰胺 天冬氨酸激酶 異亮氨酸 二氫吡啶二羧酸合成酶 異亮氨酸 玉米中賴氨酸含量可提高數(shù)倍 例如 胰島素改造天然胰島素制劑在儲存中易形成二聚體和六聚體 延緩胰島素從注射部位進(jìn)入血液 從而延緩了其降血糖作用 也增加了抗原性 這是胰島素B23 B28氨基酸殘基結(jié)構(gòu)所致 利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)改變這些殘基 則可降低其聚合作用 使胰島素快速起作用 該速效胰島素已通過臨床實驗 1 基因工程的應(yīng)用 1 基因工程的實質(zhì) 將一種生物的轉(zhuǎn)

48、移到另一種生物體內(nèi) 使后者產(chǎn)生本不能產(chǎn)生的 進(jìn)而表現(xiàn)出新的 2 基因工程的不足 在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的 2 天然蛋白質(zhì)的不足天然蛋白質(zhì)是生物在長期過程中形成的 它們的符合特定物種的需要 卻不一定完全符合人類生產(chǎn)和生活的需要 3 蛋白質(zhì)工程的目的生產(chǎn)符合人類生產(chǎn)和生活的需要的 蛋白質(zhì)工程崛起的緣由 基因 蛋白質(zhì) 性狀 蛋白質(zhì) 進(jìn)化 結(jié)構(gòu)和功能 生存 蛋白質(zhì) 二 蛋白質(zhì)工程的基本原理 1 目標(biāo) 根據(jù)人們對蛋白質(zhì)功能的特定需求 對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子設(shè)計 蛋白質(zhì)的功能是DNA決定的 那么要制造出新的蛋白質(zhì) 就要改造DNA 所以蛋白質(zhì)工程的原理應(yīng)該是中心法則的逆推 中心法則 天然的蛋白質(zhì)合成過

49、程按照中心法則進(jìn)行 基因 表達(dá) 轉(zhuǎn)錄和翻譯 形成氨基酸序列的多肽鏈 形成具有高級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì) 行使生物功能 2 原理 中心法則的逆推 3 基本途徑 從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā) 設(shè)計預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 推測應(yīng)有的氨基酸序列 找到相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列 基因 蛋白質(zhì)工程的基本原理 基因DNA 氨基酸序列多肽鏈 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu) 預(yù)期功能 生物功能 mRNA 轉(zhuǎn)錄 翻譯 折疊 DNA合成 分子設(shè)計 蛋白質(zhì)工程流程圖 基因DNA 氨基酸序列多肽鏈 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu) 預(yù)期蛋白質(zhì)功能 蛋白質(zhì)工程的主要步驟通常包括 1 從生物體中分離純化目的蛋白 2 測定其氨基酸序列 3 借助核磁共振和X射線晶體衍射等手段 盡可能地

50、了解蛋白質(zhì)的二維重組和三維晶體結(jié)構(gòu) 4 設(shè)計各種處理條件 了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化 包括折疊與去折疊等對其活性與功能的影響 5 設(shè)計編碼該蛋白的基因改造方案 如點突變 6 分離 純化新蛋白 功能檢測后投入實際使用 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定一級結(jié)構(gòu)測定 直接法 直接測定多肽鏈的氨基酸順序 間接法 從編碼蛋白質(zhì)的基因的核苷酸順序來推導(dǎo)蛋白質(zhì)的氨基酸順序 三級結(jié)構(gòu)測定 X 射線晶體衍射 研究處在晶體狀態(tài)下的蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)核磁共振 NMR 光譜 研究處在溶液狀態(tài)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) X 射線衍射技術(shù) 用于蛋白質(zhì)及核酸三維結(jié)構(gòu)的確定 至今已有數(shù)百種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)被確定 蛋白質(zhì)工程的主要手段以重組DNA技術(shù)為核心的基因工程技

51、術(shù)改造蛋白質(zhì) 位點特異性突變 基于結(jié)構(gòu)生物學(xué) 信息生物學(xué)基因突變隨機(jī)突變 基于高通量篩選法基因內(nèi)部的剪接基因剪接5 或3 端的剪接 基因定點誘變技術(shù)的常用方法是PCR法 突變點 人工合成的引物上 手段 PCR技術(shù) 目的 獲得定點突變的基因 位點特異性突變 通過特異地改變編碼核苷酸 而替代蛋白質(zhì)中的某個氨基酸 可高效 準(zhǔn)確地得到蛋白質(zhì)突變體 但這種方法得到的突變體數(shù)量有限 因此在 操作技術(shù)的帶動下 發(fā)現(xiàn)了隨機(jī)突變法 高通量篩選法 從巨大數(shù)目的突變體庫中篩選到具有期望功能的突變體 基因剪接 在酶分子的編碼基因上剪去或接上一段核苷酸 蛋白質(zhì)工程的基本原理 1 目標(biāo) 根據(jù)人們對功能的特定需求 對蛋白質(zhì)

52、的進(jìn)行分子設(shè)計 2 原理 改造基因 基因或基因 3 流程 預(yù)期蛋白質(zhì)功能 設(shè)計 推測應(yīng)有的序列 找到對應(yīng)的序列 蛋白質(zhì) 結(jié)構(gòu) 修飾 合成 預(yù)期的蛋白質(zhì) 氨基酸 脫氧核苷酸 蛋白質(zhì)工程的主要步驟通常包括 1 從生物體中分離純化目的蛋白 2 測定其氨基酸序列 3 借助核磁共振和X射線晶體衍射等手段 盡可能地了解蛋白質(zhì)的二維重組和三維晶體結(jié)構(gòu) 4 設(shè)計各種處理條件 了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化 包括折疊與去折疊等對其活性與功能的影響 5 設(shè)計編碼該蛋白的基因改造方案 如點突變 6 分離 純化新蛋白 功能檢測后投入實際使用 蛋白質(zhì)工程的概念 蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ) 通過

53、基因修飾或基因合成 對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造 或制造一種新的蛋白質(zhì) 以滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求 蛋白質(zhì)工程的實質(zhì)是對編碼蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行改造 三 蛋白質(zhì)工程的基本原理 基因DNA 氨基酸序列多肽鏈 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu) 預(yù)期功能 生物功能 mRNA 轉(zhuǎn)錄 翻譯 折疊 DNA合成 分子設(shè)計 中心法則 蛋白質(zhì)工程 目的基因 預(yù)期的蛋白質(zhì)功能 基因表達(dá)載體 基因 獲取目的基因 構(gòu)建表達(dá)載體 導(dǎo)入受體細(xì)胞 目的基因的檢測與表達(dá) 預(yù)期蛋白質(zhì)功能 設(shè)計蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 推測氨基酸序列 推測核苷酸序列 合成DNA 表達(dá)出蛋白質(zhì) 定向改造生物的遺傳特性 獲得人類所需的生物類型或生物產(chǎn)品 定向改造或生產(chǎn)人類所需的蛋白質(zhì) 生產(chǎn)

54、自然界中已有的蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上 延伸出來的第二代基因工程 因為對現(xiàn)有蛋白質(zhì)的改造或制造新的蛋白質(zhì) 必須通過基因的修飾或基因的合成 生產(chǎn)自然界沒有的蛋白質(zhì) 你知道人類基因組計劃嗎 由美國科學(xué)家于1985年率先提出 于1990年正式啟動的 美國 英國 法蘭西共和國 德意志聯(lián)邦共和國 日本和我國科學(xué)家共同參與了這一計劃 2000年完成了人類基因組 工作框架圖 2001年公布了人類基因組圖譜及初步分析結(jié)果 它是指對人類基因組進(jìn)行堿基對的測序 因為人類體細(xì)胞中有22對常染色體 每對染色體中的兩個DNA分子結(jié)構(gòu)基本相同 又由于X和Y這兩個性染色體中DNA分子結(jié)構(gòu)有較大差異 需要各自單

55、獨測序 所以對人類基因組測序?qū)嶋H上是指對人類體細(xì)胞中一套常染色體 22個 和X Y這兩個性染色體中共24個DNA分子的測序 人類蛋白質(zhì)組計劃是繼人類基因組計劃之后 生命科學(xué)乃至自然科學(xué)領(lǐng)域中的一項重大的科學(xué)命題 2001年 國際人類蛋白質(zhì)組組織宣告成立 之后 該組織正是提出啟動兩項重大國際合作行為 一項是有中國科學(xué)家牽頭執(zhí)行的 人類肝臟蛋白質(zhì)組計劃 另一項是以美國科學(xué)家牽頭執(zhí)行的 人類血漿蛋白質(zhì)組計劃 溫故知新蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其多樣性 蛋白質(zhì)多樣性原因 氨基酸數(shù)目成百上千 肽鏈結(jié)構(gòu)不同 肽鏈空間結(jié)構(gòu)千差萬別 蛋白質(zhì)種類不同 蛋白質(zhì)的功能 1 構(gòu)成細(xì)胞和生物體結(jié)構(gòu)的重要物質(zhì) 2 絕大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)

56、 催化細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)反應(yīng) 3 有些具有運(yùn)輸載體功能 4 信息傳遞作用 調(diào)節(jié)機(jī)體的生命活動 5 免疫功能 二 蛋白質(zhì)工程的概念 蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ) 通過基因修飾或基因合成 對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造或制造一種新的蛋白質(zhì) 以滿足人類對生產(chǎn)和生活的需求 前提 原理 目的 了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能 改造基因 基因修飾或基因合成 定向改造或制造蛋白質(zhì) 三 蛋白質(zhì)工程的進(jìn)展與前景 蛋白質(zhì)工程目前的現(xiàn)狀 成功的例子不多 主要是因為蛋白質(zhì)發(fā)揮其功能需要依賴于正確的空間結(jié)構(gòu) 而科學(xué)家目前對大多數(shù)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)了解很少 你知道酶工程嗎 絕大多數(shù)酶都是蛋白質(zhì) 酶工程與蛋白質(zhì)工程

57、有什么區(qū)別 酶工程就是指將酶所具有的生物催化作用 借助工程學(xué)的手段 應(yīng)用于生產(chǎn) 生活 醫(yī)療診斷和環(huán)境保護(hù)等方面的一門科學(xué)技術(shù) 概括地說 酶工程是由酶制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用兩方面組成的 酶工程的應(yīng)用主要集中于食品工業(yè) 輕工業(yè)以及醫(yī)藥工業(yè)中 通常所說的酶工程是用工程菌生產(chǎn)酶制劑 而沒有經(jīng)過由酶的功能來設(shè)計酶的分子結(jié)構(gòu) 然后由酶的分子結(jié)構(gòu)來確定相應(yīng)基因的堿基序列等步驟 因此 酶工程的重點在于對已存酶的合理充分利用 而蛋白質(zhì)工程的重點則在于對已存在的蛋白質(zhì)分子的改造 當(dāng)然 隨著蛋白質(zhì)工程的發(fā)展 其成果也會應(yīng)用到酶工程中 使酶工程成為蛋白質(zhì)工程的一部分 異想天開 能不能根據(jù)人類需要的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 設(shè)計相應(yīng)的基

58、因 導(dǎo)入合適的細(xì)菌中 讓細(xì)菌生產(chǎn)人類所需要的蛋白質(zhì)食品呢 理論上講可以 但目前還沒有真正成功的例子 一些報道利用細(xì)菌生產(chǎn)人類需要的蛋白質(zhì)往往都是自然界已經(jīng)存在的蛋白質(zhì) 并非完全是人工設(shè)計出來而自然不存在的蛋白質(zhì) 主要原因是蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜 人類對蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)和在生物體內(nèi)如何行使功能知之甚少 很難設(shè)計出一個嶄新而又具有生命功能作用的蛋白質(zhì) 而且一個嶄新的蛋白質(zhì)會帶來什么危害也是人們所擔(dān)心的 蛋白質(zhì)工程的進(jìn)展和前景 1 前景誘人 如用此技術(shù)制成的 具有 耗電少和的特點 2 難度很大 主要是目前科學(xué)家對大多數(shù)蛋白質(zhì)的的了解還很不夠 電子元件 體積小 效率高 高級結(jié)構(gòu) 胰島素改造 天然胰島

59、素制劑在儲存中易形成二聚體和六聚體 延緩胰島素從注射部位進(jìn)入血液 從而延緩了其降血糖作用 這是胰島素B23 B28氨基酸殘基結(jié)構(gòu)所致 利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)改變這些殘基 則可降低其聚合作用 使胰島素快速起作用 該速效胰島素已通過臨床實驗 四 蛋白質(zhì)工程改造的實際應(yīng)用1 枯草桿菌蛋白酶1 增強(qiáng)抗氧化性枯草芽胞桿菌蛋白酶已被發(fā)展為商用的紡織品洗滌劑 但實踐中發(fā)現(xiàn)早期生產(chǎn)的枯草芽胞桿菌蛋白酶的洗滌劑無法與漂白劑共同使用 因為漂白劑會使蛋白酶失活 造成這種失活的分子本質(zhì)是 枯草芽孢桿菌蛋白酶的第222位的甲硫氨酸殘基 Met 222 發(fā)生了氧化作用 它可使該酶的活性喪失90 為解決這一問題 科學(xué)家用其它1

60、9種氨基酸置換第222位的甲硫氨酸 得到19種蛋白質(zhì)工程蛋白酶 蛋白酶活性檢測顯示 以Cys取代Met 其活性超過野生型 遺憾的是它同樣會被漂白劑所氧化 若以Ale取代Met 222 雖然其活性僅為野生型的53 但其抗氧化性大大增強(qiáng) 可以同漂白劑聯(lián)合使用 2 改變底物特異性作為洗衣粉蛋白酶 其分解蛋白的種類無疑是多多益善 通過改變枯草芽胞桿菌蛋白酶兩個特異性口袋S及S4 能夠提高酶的底物特異性 2 溶菌酶 Lysozyme 1 抗菌范圍的擴(kuò)大溶菌酶只對G 有抗菌作用 而對大多數(shù)G 無抗菌作用 因為G 外膜阻礙溶菌酶接觸底物 在溶菌酶的C端融合疏水性短肽片段可提高抗菌能力 因疏水性短肽能瞄定到細(xì)

61、菌外膜 提高接觸肽聚糖的機(jī)會 2 熱穩(wěn)定性的提高 酶的穩(wěn)定性1 酶穩(wěn)定的分子原因1 共價鍵 肽鍵 peptidebond 穩(wěn)定蛋白質(zhì)和酶主鏈的核心力量 二硫鍵 disulfidebond 由兩個Cys的側(cè)鏈 SH氧化而成 是某些蛋白質(zhì)維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的主要因素 2 非共價鍵 疏水相互作用 hydrophobicinteraction 是維持蛋白質(zhì)分子穩(wěn)定的主要的作用力 氫鍵 hydrogenbond 是穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu) 特別是二級結(jié)構(gòu)的重要力量 靜電相互作用 electrostaticinteraction 又稱離子鍵 鹽鍵 鹽橋 是正負(fù)電荷間的作用力 對酶分子穩(wěn)定性有關(guān)的鹽鍵大部分形成

62、于分子表面上 范德華力 在電中性分子之間的非共價結(jié)合 分子間形成的范德華力越大越穩(wěn)定 金屬離子 Ca2 Mg2 和Zn2 等高價陽離子與多肽鏈不穩(wěn)定的彎曲部分結(jié)合 可顯著增加酶分子的穩(wěn)定性 2 穩(wěn)定酶的方法 1 改造酶分子酶的穩(wěn)定性從本質(zhì)上講是氨基酸組成和各種作用力綜合的結(jié)果 蛋白質(zhì)工程 用DNA水平上設(shè)計酶分子化學(xué)修飾 通過化學(xué)試劑特異性修飾酶分子的某個氨基酸 從而穩(wěn)定蛋白質(zhì)的構(gòu)象 提高耐熱性或其它穩(wěn)定性 固定化 通過化學(xué)或物理方法 將溶解性的酶與不溶性的固體支持物結(jié)合或用固體包埋 交聯(lián)酶晶體 無載體穩(wěn)定酶的技術(shù) 穩(wěn)定性增加的主要原因 酶分子的晶體結(jié)構(gòu)及共價交聯(lián) 制備的兩個步驟 酶的分批結(jié)晶

63、和晶體的化學(xué)交聯(lián) 2 微環(huán)境改良 1 添加穩(wěn)定劑A 防腐劑和蛋白酶抑制劑添加防腐劑可抑制微生物的生長 起到穩(wěn)定酶的作用 添加蛋白酶抑制劑是通過抑制蛋白酶的活性來保護(hù)與之共存的酶 B 緩沖溶液極端PH是酶分子不穩(wěn)定的重要原因 C 共溶劑糖 多元醇 氨基酸及其衍生物 甘油 PEG等一般稱蛋白質(zhì)的共溶劑 機(jī)制各不相同 D 抗氧化劑和還原劑E 底物 輔酶和活化離子 2 改變反應(yīng)介質(zhì) 非水介質(zhì) 有機(jī)溶劑中穩(wěn)定性提高 第二節(jié)蛋白質(zhì)組學(xué) 背景 基因數(shù)量有限性和基因結(jié)構(gòu)的相對穩(wěn)定性vs生命現(xiàn)象的復(fù)雜性和多變性 從genomic到proteome 對蛋白質(zhì)的數(shù)量 結(jié)構(gòu) 性質(zhì) 相互關(guān)系和生物學(xué)功能進(jìn)行全面深入的研

64、究已成為生命科學(xué)研究的迫切需要和重要任務(wù) 一 蛋白質(zhì)組學(xué)的概念 蛋白質(zhì)組學(xué) Proteomics 定義1 闡明生物體各種生物基因組在細(xì)胞中表達(dá)的全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式及功能模式的學(xué)科 包括鑒定蛋白質(zhì)的表達(dá) 存在方式 修飾形式 結(jié)構(gòu) 功能和相互作用等 所屬學(xué)科 生物化學(xué)與分子生物學(xué) 一級學(xué)科 總論 二級學(xué)科 定義2 研究基因組編碼的全部蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 性質(zhì)和功能的學(xué)科 所屬學(xué)科 細(xì)胞生物學(xué) 一級學(xué)科 總論 二級學(xué)科 定義3 研究細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的組成 結(jié)構(gòu)與功能的學(xué)科 所屬學(xué)科 遺傳學(xué) 一級學(xué)科 總論 二級學(xué)科 蛋白質(zhì)組學(xué) proteomics 指應(yīng)用各種技術(shù)手段來研究蛋白質(zhì)組的一門新興科學(xué) 其目的

65、是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份 表達(dá)水平與修飾狀態(tài) 了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系 揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動規(guī)律 蛋白質(zhì)組 蛋白質(zhì)組是澳大利亞學(xué)者Williams和Wilkins于1994年首先提出 源于蛋白質(zhì) protein 與基因組 genome 兩個詞的雜合 意指proteinsexpressedbyagenome 即 一個細(xì)胞或一個組織基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì) 熒光染色的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì) 對應(yīng)于基因組的所有蛋白質(zhì)構(gòu)成的整體 不是局限于一個或幾個蛋白質(zhì) 同一基因組在不同細(xì)胞 不同組織中的表達(dá)情況各不相同 在空間和時間上動態(tài)變化著的整體 蛋白質(zhì)組是 主要研究內(nèi)容 了解某種

66、特定的細(xì)胞 組織或器官制造的蛋白質(zhì)種類 明確各種蛋白質(zhì)分子是如何形成類似于電路的網(wǎng)絡(luò)的 描繪蛋白質(zhì)的精確三維結(jié)構(gòu) 揭示其結(jié)構(gòu)上的關(guān)鍵部位 如與藥物結(jié)合并且決定其活性的部位 二 蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生與發(fā)展 背景 基因組時代 后基因組時代研究重點的轉(zhuǎn)移及其標(biāo)志 mRNA水平的基因表達(dá)研究取得進(jìn)展 但mRNA與蛋白質(zhì)間的相關(guān)系數(shù)僅為0 4 0 5蛋白質(zhì)自身特點難以從DNA和mRNA水平得到解答 進(jìn)展 各國政府支持 國際著名研究和商業(yè)機(jī)構(gòu)加盟 1996年澳大利亞建立了世界上第一個蛋白質(zhì)組研究中心 AustraliaProteomeAnalysisFacility APAF 美國國立癌癥研究院 NCI 投資1000萬美元建立肺 直腸 乳腺 卵巢腫瘤的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫 NCI和FDA共同投資數(shù)百萬美元建立癌癥不同階段的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫 英國建立三個蛋白質(zhì)組研究中心對已完成或即將完成全基因組測序的生物體進(jìn)行蛋白質(zhì)組研究 Celera公司投資上億美元獨自啟動了全面鑒定和分類匯總?cè)祟惤M織 細(xì)胞和體液中的蛋白質(zhì)及其異構(gòu)體 構(gòu)建新一代的蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)庫的工作 1997年召開了第一次國際 蛋白質(zhì)組學(xué) 會議1998年在