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1、第九章原生質體培養(yǎng)與體細胞雜交,原生質體的獲得原生質體的培養(yǎng)體細胞雜交,原生質體的獲得,原生質體的概念原生質體的用途原生質體的分離,原生質體的概念,指植物細胞除去細胞壁以外的部分,原生質體的用途,植物原生質體是沒有細胞壁的裸露細胞，它在一些研究方面具有獨特的優(yōu)勢。原生質體是研究細胞骨架、細胞壁的形成與功能、細胞膜的結構、大分子物質進出細胞的過程與機理等問題的良好實驗體系。遺傳轉化：原生質體與外源DNA共培養(yǎng)時，原生質體可以直接吸收外源DNA，并整合到染色體上，從而實現對植物細胞的遺傳轉化。通過植株再生就可以得到轉基因植物。,原生質體的用途,體細胞雜交由于原生質體沒有細胞壁，所以不同的原生質體可
2、以相互靠近，發(fā)生融合，進行細胞雜交。2個不同植物體細胞發(fā)生融合、形成新細胞的過程，稱為體細胞雜交。所得到的融合細胞為雜種細胞，再通過植株再生就可能創(chuàng)造出新的植物個體。,原生質體的分離——機械法,高產量、高質量的分離原生質體是進行原生質體培養(yǎng)和操作的前提。方法：機械法、酶解法機械法：通過對植物組織進行切割、研磨等方法破壞植物細胞壁，使原生質體游離出來的一種方法缺點:效率極低、原生質體破碎嚴重，完好的原生質體數量少優(yōu)點：對原生質體以后的負面影響小,原生質體的分離——機械法,具體方法：Klercker（1982），大植物細胞置于高滲的蔗糖溶液中，使細胞質壁發(fā)生分離，原生質體收縮成球形，然后用利刃切割
3、，在切割的過程中，有些細胞只被切去了細胞壁，從而釋放出完整的原生質體.適用范圍：某些植物的貯藏組織，如：胡蘿卜的根、洋蔥的鱗片等細胞高度液泡化的組織.,原生質體的分離——酶解法,酶解法：1960年由英國的Cooking發(fā)明，是利用一些酶分解植物細胞壁而獲得原生質體的一種方法。植物細胞壁組成：纖維素、半纖維素和果膠質優(yōu)點：分離原生質體的效率很高，用少量的材料就可以得到大量完整的原生質體，已成為分離原生質體的最主要方法酶制劑：纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶（離析酶）、崩潰酶（纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶）,具體步驟：,材料的選擇材料來源：細胞分裂旺盛的外植體，如幼嫩小苗的根、胚軸、子葉、幼葉等；處于
4、快速生長期的愈傷組織或懸浮細胞.對于容易培養(yǎng)、再生那里較強的雙子葉植物（如煙草、菊花、胡蘿卜、矮牽牛等）也可用完全展開的葉片作材料.用于分離原生質體的植物材料要培養(yǎng)在最佳的光溫條件下.,原生質體的分離——酶解法,酶解處理酶解處理對以后的原生質體培養(yǎng)至關重要.原則：利用盡可能低的酶濃度和盡可能短的酶解時間來獲得大量有活力的原生質體.酶解液的準備：由于植物細胞壁的主要成分是纖維素、半纖維素和果膠質組成的，所以，酶解液中一般含有纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶，濃度為0.5-2.0%,原生質體的分離——酶解法,滲透壓的調節(jié)必要性：為了保持釋放出來的原生質體的活力和膜穩(wěn)定性，必須使原生質體處于一個等滲環(huán)境
5、中。因此，酶解液中必須加入滲透壓調節(jié)劑。常用的滲透壓調節(jié)劑有：葡萄糖、甘露醇和山梨醇等，濃度一般為0.35-0.8mol/L。具體用什么濃度，要根據材料的水勢來確定。,原生質體的分離——酶解法,加入其它物質酶解液中加入較高濃度的Ca2+可以提高膜的穩(wěn)定性；加入葡聚糖硫酸鉀、KH2PO4也可以提高原生質體的穩(wěn)定性和活力；加入牛血清蛋白可防止酶解過程對細胞膜和細胞器的破壞；在酶解液中加入pH緩沖劑有利于保持酶解液的酸堿環(huán)境的穩(wěn)定，增加原生質體的釋放量和原生質體的穩(wěn)定性。,原生質體的分離——酶解法,原生質體的分離——酶解法,注意事項酶解液配制好后，要用過濾滅菌的方法進行滅菌，并且隨配隨用.,原生質體
6、的分離——酶解法,酶解就是將無菌材料放入酶解液中、釋放出原生質體的過程。有菌材料，則必須進行表面消毒處理。葉片、幼莖和根等材料要切成小片，葉片最好撕去下表皮。懸浮細胞則要離心后再酶解。,原生質體的分離——酶解法,用量：材料與酶解液的比率為2-10g/100ml酶解液。溫度和光照：一般在252℃、黑暗中酶解，期間輕輕搖動幾次，或放在50rpm的搖床上。時間：酶解時間因材料而異，2小時-10幾小時。,葉片的酶解法分離原生質體,原生質體的收集與純化過濾：酶解結束后，要及時的將酶解物通過孔徑為20-80m的不銹鋼篩網過濾，除去未被酶解的組織塊和細胞團。離心：濾液轉到離心管中在50g下離心5min。反復
7、洗滌：離心結束后，棄去上清液，用培養(yǎng)基和原生質體洗液重新懸浮沉淀的原生質體，再離心。如此反復2-4次，就可以將殘留的酶液去掉。純化：如原生質體不純（如含有較多的細胞碎片），可用含高濃度（21%）蔗糖的培養(yǎng)基進行離心、純化，完整的原生質體漂浮在上清液的上部。,原生質體的分離——酶解法,完整的原生質體,,原生質體的分離——酶解法,原生質體活力的測定原生質體活力的高低對后來的原生質體培養(yǎng)和融合影響極大。測定原生質體活力的方法常用熒光素雙醋酸酯（FDA）染色法。原生質體活力（%）=發(fā)熒光的原生質體數/原生質體總數100,原生質體的分離——酶解法,,,,,,,,,,,,,,,,原生質體培養(yǎng),發(fā)育過程：原
8、生質體在培養(yǎng)過程中，首先形成細胞壁（原生質體由圓形變?yōu)橐欢ㄐ螤睿?，后來進行分裂、形成細胞團、愈傷組織、完整植株。,苜蓿,,夜來香,1天,5天,7天,10天,,4周,5周,7周,原生質體的培養(yǎng)方法,液體淺層培養(yǎng)將含原生質體的培養(yǎng)液倒入培養(yǎng)皿底部，使其成一薄層，封口后進行培養(yǎng)。此種方法操作簡單，對原生質體的損傷小，而且容易以后添加新鮮培養(yǎng)基和轉移培養(yǎng)物。但原生質體分布不均勻，常常發(fā)生原生質體之間粘連，從而影響其進一步的生長、分裂；同時，原生質體的位置不能固定，所以不能跟蹤觀察單個原生質體的生長過程。,原生質體的培養(yǎng)方法,固體培養(yǎng)（平板培養(yǎng)）30-35℃的瓊脂或瓊脂糖培養(yǎng)基與原生質體溶液混合，搖勻，
9、倒入培養(yǎng)皿中，瓊脂或瓊脂糖凝固后，就成一薄層。平板培養(yǎng)時原生質體都被固定，容易觀察、統(tǒng)計原生質體的分裂情況，但操作比較復雜。進行平板培養(yǎng)時，要注意混合時培養(yǎng)基的溫度。溫度高對原生質體的傷害大；溫度低，培養(yǎng)基凝固，原生質體與培養(yǎng)基不能混勻。平板培養(yǎng)在以后添加新鮮培養(yǎng)基和轉移培養(yǎng)物方面也要復雜些。,原生質體的培養(yǎng)方法,液體—固體結合培養(yǎng)液體淺層—固體平板培養(yǎng)雙層培養(yǎng)法：培養(yǎng)皿底部鋪一層瓊脂或瓊脂糖培養(yǎng)基，再將原生質體懸浮液倒入或滴入固體培養(yǎng)基表面。優(yōu)點是固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)可以緩慢釋放倒液體培養(yǎng)基中。如果在固體培養(yǎng)基中加入活性炭，還可以吸附培養(yǎng)物分泌的有毒物質，促進原生質體的生長和分裂。,原生質體的
10、培養(yǎng)方法,瓊脂糖珠培養(yǎng)用移液管吸取含原生質體的瓊脂糖培養(yǎng)基，滴在培養(yǎng)皿或三角瓶中，待其凝固后，再加入適量的液體培養(yǎng)基，進行旋轉培養(yǎng)。也可以等含原生質體的瓊脂糖培養(yǎng)基凝固后，用刀將其切成小塊，再放入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。這種方法改進了培養(yǎng)物的通氣和營養(yǎng)環(huán)境，從而促進可以促進原生質體的分裂及細胞團的形成。,,看護培養(yǎng),原生質體的生長、分裂,在適宜的培養(yǎng)條件下，原生質體數小時后開始形成新的細胞壁。這時，在顯微鏡下可見原生質體由圓球形逐漸變?yōu)榉叫巍⒍噙呅蔚取＜s24-36h后，原生質體開始發(fā)生第一次分裂；以后隨著細胞分裂，原生質體就形成細胞團。但是，在細胞分裂開始以后，培養(yǎng)基中的甘露醇或山梨醇的濃度要逐漸降
11、低，否則會影響細胞的繼續(xù)生長、分裂。待原生質體形成的細胞團（愈傷組織）達到1mm時，應將細胞團轉移到新鮮的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。所形成的愈傷組織就可以按照普通的愈傷組織進行培養(yǎng)和植株再生。,影響原生質體培養(yǎng)效果的因素,原生質體培養(yǎng)效果的好壞，也可以用植板率來衡量。植物材料：用于分離原生質體的植物材料對原生質體后來培養(yǎng)的效果影響極大。不同的植物、同一植物不同的品種，其遺傳組成存在差異，原生質體的培養(yǎng)效果也就必然有差異。如Yamada曾用26個水稻品種的種子誘導出愈傷組織，再建立懸浮細胞培養(yǎng)，以懸浮細胞分離原生質體，結果只有1個品種的原生質體再生了植株。一般來說，容易培養(yǎng)的植物、外植體，其原生質體也容
12、易培養(yǎng)，反之，亦然。草本比木本容易，幼嫩的材料比成熟的材料容易。,培養(yǎng)基,基本培養(yǎng)基不同植物原生質體要求有不同的基本培養(yǎng)基。使用什么基本培養(yǎng)基，可以參照相應培養(yǎng)愈傷組織或細胞的培養(yǎng)基。一般認為，原生質體培養(yǎng)基種的大量元素應比愈傷組織培養(yǎng)基中的大量元素濃度低。由于Ca2+影響到膜的穩(wěn)定性，因此較高Ca2+濃度的對原生質體分裂有利。,培養(yǎng)基,有機成分：同培養(yǎng)細胞、愈傷組織相比，培養(yǎng)原生質體時要求培養(yǎng)基有更豐富的有機成分，如氨基酸、維生素、CW，YE，LH，CH、小牛血清等。大量的結果表明，培養(yǎng)基中添加谷氨酰胺有利于原生質體的分裂。激素：培養(yǎng)基中要加入一定濃度的細胞分裂素和生長素。由于2,4-D促進
13、細胞分裂能力很強，所以培養(yǎng)基中大都要加2,4-D。條件化培養(yǎng)基：使用條件化培養(yǎng)基可以大大促進原生質體的分裂和細胞團的形成。,培養(yǎng)基,培養(yǎng)基中的滲透壓：原生質體無細胞壁，所以培養(yǎng)基中必須使用滲透壓調節(jié)劑（甘露醇、山梨醇等），以維持原生質體的穩(wěn)定。但滲透壓調節(jié)劑濃度較高往往會抑制細胞分裂和后來的細胞生長。因此，培養(yǎng)基中滲透壓調節(jié)劑的濃度不能太高，并且在后來的培養(yǎng)過程中要逐漸降低甘露醇或山梨醇的濃度，以利于細胞的持續(xù)分裂和生長。,體細胞雜交,原生質體由于沒有細胞壁的限制，所以2個原生質體可以彼此靠近，通過膜的融合而融為一體。如果2個相同的原生質體發(fā)生融合，則可以實現染色體加倍；如果2個原生質體不同，則就可以實現將2種不同植物的遺傳物質組合在一起，形成一個新的雜種細胞，此雜種細胞通過植株再生，則可以得到雜種植株。2個不同體細胞發(fā)生融合的過程，稱為體細胞雜交。所得到的融合細胞為雜種細胞，再通過植株再生就可以創(chuàng)造出新的植物個體。,
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