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1、血清球蛋白的分離、純化及鑒定,分工合作,專人、固定錐形瓶，放開，不斷滴加pH6.3醋酸鹽緩沖液，防止氣泡。 鹽析混勻時需要兩個人合作。 兩次操作是一樣的，都有動手的機會。 改錯?。≒46頁錯誤）,操作,一、鹽析 取1ml血清1ml， 取1ml飽和(NH)SO溶液緩慢滴入，邊加邊搖。 混勻后于室溫中放置10分鐘。,目的要求,(一)掌握分離純化蛋白質(zhì)的基本原理。 (二)了解柱層析技術(shù)。,實驗原理,蛋白質(zhì)的分離和純化是研究蛋白質(zhì)化學及其生物學功能的重要手段。 不同蛋白質(zhì)的分子量、溶解度及在一定條件下，帶電的情況等都有所不同。利用這些性質(zhì)的差別，可分離純化各種蛋白質(zhì)。,一、粗提（鹽析法）,鹽析的定義。
2、常用的中性鹽有：硫酸銨、硫酸鈉等，由于各種蛋白質(zhì)分子的顆粒大小和親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣。 因此，調(diào)節(jié)鹽的濃度可使不同的蛋白質(zhì)沉淀從而達到分離的目的。,血清中含有清蛋白和球蛋白。用半飽和的(NH)SO鹽析可使球蛋白沉淀，而清蛋白仍留在溶液中，經(jīng)離心而分離。 原因：一、清蛋白等電點是4.0。2球蛋白等電點是5.06，球蛋白等電點是5.1，球蛋白等電點是7.1。 二、清蛋白的分子量遠小于球蛋白,二、脫鹽（凝膠層析法）,鹽析分離的蛋白質(zhì)溶液中含有大量無機鹽，必須先脫鹽后才能進一步純化。脫鹽有多種方法，本實驗采用凝膠層析法。,凝膠層析法主要根據(jù)混合物中分子大小不同的各種物質(zhì)，隨流動相流
3、經(jīng)作為固定相的凝膠層析柱時，各分子的擴散移動速度不同，使混合物質(zhì)得到分離的技術(shù)。 凝膠有多種，葡聚糖凝膠是最常用的一種人工合成凝膠。,混合物中各種物質(zhì)同時進行著兩種不同的運動，垂直向下移動和無定向的擴散運動。 大分子物質(zhì)(蛋白質(zhì))直徑大不能入凝膠顆粒的網(wǎng)孔，垂直向下的速度較快。小分子物質(zhì)(無機鹽)可擴散入凝膠顆粒網(wǎng)孔之中， 結(jié)果小分子物質(zhì)流出所經(jīng)的路程較大分子為長，從而使混合物中各組分按分子大小不同的順序流出，得到除去鹽的蛋白質(zhì)溶液。,三、純化（離子交換法）,離子交換是指溶液中的離子和交換劑上的離子進行可逆的交換過程。帶正電荷的交換劑稱為陰離子交換劑；帶負電荷的交換
4、劑稱陽離子交換劑。 DEAE纖維素是一種陰離子交換劑。,因球蛋白中及球蛋白的pI6.3 而球蛋白的pI6.3(pI7.3) 故經(jīng)DEAE纖維素陰離子交換層析流出的第一部分蛋白質(zhì)為純化的球蛋白。 純化前后的球蛋白用電泳法進行鑒定。,操作,一、鹽析 取1ml血清1ml， 取1ml飽和(NH)SO溶液緩慢滴入，邊加邊搖。 混勻后于室溫中放置10分鐘。,然后每分3500轉(zhuǎn)離心10分鐘，并小心吸去上清液，用濾紙條吸除上清夜。 沉淀加pH6.5醋酸氨緩沖液0.5ml，使之溶解，作為純化球蛋白用。,二、G25凝膠層析脫鹽,（一）葡聚糖凝膠G25層析柱的制備： 1、取層析柱，關(guān)緊下端出口加蒸餾水
5、少許。 2、緩慢加入膨脹處理過的凝膠懸液，預(yù)先經(jīng)pH6.5醋酸鹽緩沖液流洗平衡。,3、待膠下沉至1015cm高(防止凝膠分層和柱內(nèi)混有氣泡，使表面整平并蓋一濾紙片，即可使用。,（二）上樣與洗脫：,1、小心控制凝膠柱下端活塞，使柱上緩沖液面剛好下降到凝膠床表面(注意不要使液面低于凝膠床表面以致空氣進行凝膠床)。 2、關(guān)緊下端出口，用滴管吸取鹽析球蛋白液，小心緩慢的加到凝膠床表面上(注意不要將凝膠粒中沖起或破壞凝膠床表面的平整)。,3、開下端出口，使樣品進入凝膠床，關(guān)閉出口，小心加入適量pH6.3磷酸緩沖液。 4、放開，流速約20滴/分鐘，立即檢測（方法見后），檢測到蛋白后收集三管，20滴/管。
6、顏色最深而且無渾濁的管用于下一步操作。,洗脫液中蛋白質(zhì)的檢查,取小試管3個，分別加20磺基水楊酸10滴，從下端管口取1滴，滴于試管中，出現(xiàn)白色混濁或沉淀即有蛋白質(zhì)析出。 對比法：與未加液體的管對比，出現(xiàn)渾濁即開始收集。,三、陰離子交換層析,經(jīng)處理再生后的DEAE纖維素，將脫鹽后含球蛋白的溶液加于DEAE纖維陰離子交換柱上，用同一緩沖液洗脫， 分管收集洗脫液。檢測到蛋白后立即收集三管，20滴/管，編號。,五、注意事項,1、鹽析：邊加邊混（為什么？）。 2、滴速：20滴/分。 3、避免污染磺基水楊酸。,下午,濃縮,刷一個干凈的小試管，濾紙上控干。 找一張干凈的紙條，折疊，倒入一包葡聚糖干粉，小心的送入試管底部。 加入1號管的樣品，小心的震蕩混勻，取上層液體一滴上樣。,如果液體太少，小心的滴加2號試管的液體，混勻，取上清夜點樣。 回收！,四、醋酸纖維素薄膜電泳檢查,樣品：(1)血清。 (2) 純化的球蛋白液(由于此溶液濃度較低，應(yīng)多次點樣于同一位置（10次），每次點樣時待干后再點。,注意事項,1、不要調(diào)電泳儀?。?！ 2、血清接觸過的點樣器、玻片用完后拋入84消毒液30分鐘后清洗 3、多次點樣在同一位置！,1、所用緩沖液為醋酸銨緩沖液，還是硫酸銨？ 2、完全飽和的硫酸銨中清蛋白、球蛋白是否均發(fā)生沉淀？ 3、層析的原理是什么？,思考題,再生,醋酸根離子 Cl離子 蛋白質(zhì)離子,
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