《多功能酶標(biāo)儀》PPT課件.ppt

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1、,酶標(biāo)儀的使用,主要內(nèi)容,一、ELISA法介紹 二、酶標(biāo)儀和多功能酶標(biāo)儀 三、儀器操作,一、ELISA法介紹,經(jīng)典的化學(xué)分析方法（如滴定分析、重量分析、分光光度法）能對(duì)化學(xué)體系組分進(jìn)行常量或微量分析，而對(duì)復(fù)雜生物體系的微量成分的測(cè)定往往力不從心。 在此背景下，科學(xué)家研發(fā)了一系列測(cè)定生物體系成分含量的方法，其中免疫化學(xué)法（如酶聯(lián)免疫法、免疫熒光法、放射免疫法）因具有高特異性、超微量分析生物體有機(jī)成分的特點(diǎn)而得到迅速推廣和發(fā)展。,1971年人們建立了用酶來(lái)標(biāo)記抗原或抗體的分析技術(shù)，使得原來(lái)極其微乎其微的抗原或抗體在數(shù)分鐘后就可被識(shí)別出來(lái)，并進(jìn)行定量，這種技術(shù)被稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法，簡(jiǎn)稱ELISA

2、。 （Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay） 酶聯(lián)免疫法的專用儀器就是酶標(biāo)儀。,分析原理,酶標(biāo)儀的分析原理與分光光度法一樣，服從朗伯比爾定律。物質(zhì)的含量與顯色液的顏色深淺成正比，而顏色深淺可用吸光度表示，所以物質(zhì)的含量與吸光度值成正比。 酶標(biāo)記抗原或者抗體發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)后，與底物的結(jié)合物，在特定波長(zhǎng)下有最大吸收，可通過(guò)測(cè)定顯色液的吸光度對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定量。,ELISA法知識(shí),1.免疫學(xué)知識(shí) 2.常用的ELISA分析 3.ELISA 應(yīng)用,1.免疫學(xué)知識(shí),什么是抗體？ 什么是抗原？ 什么是抗原抗體反應(yīng)？,什么是抗體(Antibody)？,抗體是機(jī)體受抗原刺激后，在體

3、液中出現(xiàn)的一種能與相應(yīng)抗原發(fā)生反應(yīng)的球蛋白，稱免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)。 人類免疫球蛋白有五類，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。 含有免疫球蛋白的血清稱免疫血清。,免疫球蛋白（Ig）,免疫球蛋白（Ig）是機(jī)體受抗原刺激后產(chǎn)生的，其主要作用是與抗原起免疫反應(yīng)，生成抗原-抗體復(fù)合物?？梢宰钄嗖≡w對(duì)機(jī)體的危害，也可以引起過(guò)敏反應(yīng)或其他有害反應(yīng)。,免疫球蛋白的結(jié)構(gòu),免疫球蛋白都是大分子的物質(zhì)，輕鏈和重鏈， 且具有抗原結(jié)合的部位。,什么是抗原(Antigen) ？,凡能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，并能與抗體發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)稱為抗原。物質(zhì)所具有的這種特性稱為抗原性?？乖奈?/p>

4、質(zhì)可以是機(jī)體自身的成分如蛋白、酶、多肽或者多糖。也有外來(lái)的抗原（如病毒、污染物）。,抗原的特異性,各種抗原物質(zhì)的化學(xué)組成雖然很復(fù)雜，但能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體并與抗體反應(yīng)相結(jié)合的化學(xué)組成，僅僅是抗原物質(zhì)表面的一些具有活性的化學(xué)基團(tuán)、化學(xué)結(jié)構(gòu)及空間構(gòu)型，被稱為抗原物質(zhì)決定簇。 分子結(jié)構(gòu)的差異性，決定各種物質(zhì)抗原的特異性。,抗原抗體反應(yīng),抗原與抗體的反應(yīng)統(tǒng)稱為免疫學(xué)反應(yīng)。在體內(nèi)進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)稱為免疫反應(yīng)，在體外進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)稱為血清學(xué)反應(yīng)。 沒(méi)有抗原的刺激，機(jī)體不能產(chǎn)生抗體；利用抗體可以檢測(cè)抗原物質(zhì)。,ELISA法特點(diǎn),ELISA法是建立在抗原與抗體免疫學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)上，因而，具有特異性。 由于測(cè)

5、定中需要酶標(biāo)記抗原或抗體，酶分子與抗原或抗體分子的結(jié)合物可以催化底物分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生放大作用，正因?yàn)榇朔N放大作用而使本法具有很高的敏感性。,2.常用的ELISA分析,1).測(cè)定抗原 2).測(cè)定抗體,(1)測(cè)定抗原,A將抗體吸附于固相表面，這個(gè)過(guò)程叫包被。 B 加抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物。 C 加酶標(biāo)抗體。 D 加酶反應(yīng)的底物。反應(yīng)終止時(shí)，反應(yīng)液的顏色深淺與抗原的含量成正比。,主要步驟,1.包被抗體的酶標(biāo)板（一抗）。 2.加待測(cè)抗原?？乖贵w反應(yīng)，洗滌。 3.加酶標(biāo)抗體（二抗）。反應(yīng)，洗滌。 4.加顯色底物（三抗），反應(yīng)，洗滌。 5.加終止液。 6.酶標(biāo)儀上讀取吸光度值。 7.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)

6、待測(cè)抗原進(jìn)行定量。,(2)測(cè)定抗體,A 抗原包被在酶標(biāo)板。 B 加抗體，形成抗原抗體復(fù)合物。 C 加酶標(biāo)抗體（一抗） D 加酶底物（二抗），顯色，比色。,3.ELISA方法的應(yīng)用,原則上ELISA可用于檢測(cè)一切抗原、抗體及半抗原，可以直接定量測(cè)定體液中的可溶性抗原。 在實(shí)際應(yīng)用中它和醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、藥理學(xué)、環(huán)境學(xué)等方面密切相關(guān)。,舉例,醫(yī)學(xué)方面：腫瘤研究中檢測(cè)甲胎蛋白；檢測(cè)過(guò)敏原；檢測(cè)血清中白蛋白及免疫球蛋白；傳染病診斷中檢查乙型肝炎表面抗原。 環(huán)境科學(xué)方面：測(cè)定污染物抗原干預(yù)下生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、酶的變化。 其他：植物組織漿液中檢查植物病毒；普通比色分析。,二、酶標(biāo)儀和多功

7、能酶標(biāo)儀,普通酶標(biāo)儀 多功能酶標(biāo)儀,1.普通酶標(biāo)儀,即酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(ELISA Reader）,Bio-Rad Model 550,4萬(wàn)元,光源,光電檢測(cè)器,電信號(hào)經(jīng)前置放大、對(duì)數(shù)放大、模數(shù)轉(zhuǎn)換等,濾光片 或單色器,酶標(biāo)儀結(jié)構(gòu)及原理,光源：鎢燈 濾光片：常用的波長(zhǎng)范圍： 405nm 450nm(四甲基聯(lián)苯胺) 490nm(鄰苯二胺) 630nm 單色器：可調(diào)節(jié)波長(zhǎng)的光,比色裝置： 聚苯乙烯塑料微孔板：96孔 光電檢測(cè)器,酶標(biāo)儀與光度計(jì)的區(qū)別,波長(zhǎng)：4-6個(gè) 比色裝置：酶標(biāo)板，非比色杯 光路：垂直 功能：不能波長(zhǎng)掃描；只在固定波長(zhǎng)的可見(jiàn)光范圍測(cè)定；可對(duì)化學(xué)物及生命組分進(jìn)行終點(diǎn)分析。,酶標(biāo)儀的應(yīng)

8、用,普通酶標(biāo)儀基本功能有2個(gè)： （1）相當(dāng)于分光光度計(jì)：測(cè)定化合物含量或者細(xì)胞存活率等。 （2）基于免疫反應(yīng)的ELISA分析。 新型的多功能酶標(biāo)儀價(jià)格在20-50萬(wàn)元，分析功能得到廣泛拓展，這對(duì)酶標(biāo)儀的應(yīng)用有深刻的意義。,ELISA的局限性,世界衛(wèi)生組織專家組提出對(duì)ELISA的評(píng)價(jià)認(rèn)為：“ELISA作為免疫診斷應(yīng)用是一個(gè)好辦法，但要做好它不容易?！?1.對(duì)ELISA法的非特異性評(píng)價(jià)的資料尚不夠完善，因此，對(duì)出現(xiàn)一些非特異性反應(yīng)的時(shí)候，往往不易解釋。 2.固相載體的質(zhì)量常不統(tǒng)一，主要是原料及制備工藝還不一致，致使不同批號(hào)的固相載體有時(shí)本底值較高，有時(shí)吸附性能很差，影響試驗(yàn)結(jié)果。 3.試劑不統(tǒng)一，

9、現(xiàn)在處于“八仙過(guò)海，各顯神通”，標(biāo)準(zhǔn)還不能統(tǒng)一。,2.多功能酶標(biāo)儀,Thermo公司全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀,50多萬(wàn)元,多功能酶標(biāo)儀的特點(diǎn),1.比色杯或者微孔板（6、12、24、48、96和384孔微孔板 ）,測(cè)樣量大 ； 2. 200-1000 nm ，有紫外可見(jiàn)光、熒光、偏振光等,波長(zhǎng)變化可達(dá)到1nm, 只要是有色溶液即可測(cè)定吸光度； 3.可提供終點(diǎn)檢測(cè)、動(dòng)力學(xué)、單孔掃描和光譜掃描等測(cè)讀模式 ； 4.分析功能擴(kuò)大。,多功能酶標(biāo)儀的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用舉例,DNA/RNA定量和純度檢測(cè) Bradford /Lowry實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞活性/細(xì)胞毒性檢測(cè) MTT分析 （IC50/LD50 ） 細(xì)菌生長(zhǎng)分析 鈣流檢測(cè)

10、膜電位檢測(cè) 雙熒光素酶報(bào)告基因分析,多功能酶標(biāo)儀的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用,ATP檢測(cè) 微生物生長(zhǎng) 綠熒光蛋白分析 藥代毒性分析 膜滲透分析 熒光偏振分析,三、酶標(biāo)儀操作,1. 注意事項(xiàng) 2. 酶標(biāo)板 3. 操作要點(diǎn),1.注意事項(xiàng),1）反復(fù)研讀試劑盒說(shuō)明，熟悉操作步驟。 2）加樣的準(zhǔn)確性。操作中須注意顯色劑和終止的加量準(zhǔn)確，最好使用加樣槍加液以保證比色時(shí)吸光度的準(zhǔn)確性。槍頭不要混用。 3）洗滌時(shí)間。一般按照說(shuō)明書(shū)要求，起碼洗滌5次，切要把殘液甩干。,4）觀察和判讀吸光度結(jié)果應(yīng)在15min 內(nèi)完成，否則液體顏色會(huì)減退。 5）待測(cè)生物樣品要放在4冰浴上。 6）顯色液要現(xiàn)用現(xiàn)配，避光低溫保存 。 7）注意購(gòu)買(mǎi)抗體的

11、保存。,2.酶標(biāo)板,酶標(biāo)板材料,可溶性抗原或抗體吸附于固相載體而成為不溶形式，這是進(jìn)行酶標(biāo)記測(cè)定的基本條件。許多物質(zhì)可作為固相載體，如纖維素、交聯(lián)右旋糖苷、瓊脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應(yīng)板。由于微量反應(yīng)板所用試劑量少，操作方便，適合于大規(guī)模應(yīng)用。,酶標(biāo)板材料,國(guó)產(chǎn)聚苯乙烯微量反應(yīng)板（上海塑料三廠出品）目前已大量應(yīng)用于ELISA測(cè)定，并且獲得了滿意的結(jié)果。但每批微量反應(yīng)板對(duì)抗原或抗體蛋白質(zhì)的吸附性能是有顯著差別的。實(shí)驗(yàn)證明，吸附效果似乎與塑料的類型及其表面性質(zhì)有關(guān)。特別是塑料制品在加工過(guò)程中因工藝不同或受其他因素的影響而造成

12、吸附性能的極大差異，甚至完全喪失吸附能力。,酶標(biāo)板鑒定,對(duì)每批制品在使用前，必須經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室鑒定，鑒定的方法和標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)每批購(gòu)置的微量反應(yīng)板抽樣，用檢測(cè)試劑盒進(jìn)行試驗(yàn)，當(dāng)顯色并終止反應(yīng)后，在酶標(biāo)比色計(jì)中測(cè)定其O.D值。,一般認(rèn)為全板中每?jī)煽组gO.D值的誤差不超過(guò)10%為合格。如果中間孔與四周孔O.D值相差太大，或者反應(yīng)板的這一邊與另一邊凹孔的O.D值相差大，均不合格。此外，還要檢查陽(yáng)性和陰性參考血清O.D值是否有明顯差別。一般要求有10倍左右的差異為合格。,酶標(biāo)儀單、雙波長(zhǎng)檢測(cè),一般的酶標(biāo)儀在測(cè)定中均有單波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)的模式，為什么呢？,酶標(biāo)儀是垂直光路，受被測(cè)樣本液面是否水平、酶標(biāo)板透光性、孔底是

13、否平整等的影響較大。 選擇 630nm為參比波長(zhǎng), 測(cè)定其吸光度A0;在測(cè)定波長(zhǎng)（如490nm/450nm）下測(cè)定樣本的吸光度A,雙波長(zhǎng)測(cè)定后,取二者的差值, 測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差比單波長(zhǎng)下測(cè)定的要小,實(shí)驗(yàn)誤差小。,在ELISA測(cè)定所使用的底物如鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，顯色終止后，在 630nm處的吸光度值都只有吸收峰處（490nm/450nm）吸光度值的1%以下，因此，利用雙波長(zhǎng)檢測(cè)，不會(huì)影響檢測(cè)靈敏度。 一般酶標(biāo)儀比色應(yīng)該首選雙波長(zhǎng)。,酶標(biāo)儀的工作環(huán)境,1.儀器應(yīng)放置在無(wú)強(qiáng)磁場(chǎng)和干擾電壓的位置。 2.儀器應(yīng)放置在噪音低于40分貝的環(huán)境下。 3.為延緩光學(xué)部件的老化，應(yīng)避免陽(yáng)光直射。 4.操作

14、環(huán)境溫度應(yīng)在1540之間，環(huán)境濕度在15%85%之間。 5.操作時(shí)電壓應(yīng)保持穩(wěn)定。 6.操作環(huán)境空氣清潔，避免水汽、煙塵。 7.保持干燥、干凈、水平的工作臺(tái)面，以及足夠的操作空間。,3.Bio-Rad Model 550酶標(biāo)儀操作,1.接通電源，打開(kāi)酶標(biāo)儀開(kāi)關(guān)。 2.儀器開(kāi)始自檢。Self disgonsis in progress 3.按箭頭光標(biāo)到Mode,設(shè)置參數(shù)。當(dāng)儀器出現(xiàn)set analysis mode 時(shí)，按enter確定。 4.選擇測(cè)定波長(zhǎng)的類型。按箭頭光標(biāo)到D/S,按select選中，enter 確定。光標(biāo)出現(xiàn)在Dual/Single，選擇雙波長(zhǎng)，按select選中，enter

15、 確定。,5.選擇濾光波長(zhǎng)，此酶標(biāo)儀有四個(gè)波長(zhǎng)：1：405nm;2:450nm;3:490nm;4:630nm。按箭頭光標(biāo)到Filt,按select選中，enter 確定。光標(biāo)出現(xiàn)在Mes=#X Ref=# Y，如按光標(biāo)選擇數(shù)字3，即490nm的測(cè)定波長(zhǎng),enter確定。再按Next, 到Ref,按光標(biāo)選擇參考波長(zhǎng)，如選數(shù)字4.即為630nm，enter 確定。 6.選擇是否混合。按箭頭光標(biāo)到Mix,按select選中，enter 確定。光標(biāo)出現(xiàn)在yes/No，如光標(biāo)選擇No，按select選中,enter 確定，說(shuō)明樣品不混合。,7.返回原顯示，set analysis 的D/S FiltM

16、ix,按enter出現(xiàn)set analysis的Mode。說(shuō)明儀器已經(jīng)到達(dá)測(cè)試狀態(tài)。 8.推開(kāi)測(cè)定蓋，將酶標(biāo)板小心正確放到測(cè)定槽內(nèi)，合住蓋。 9.上好酶標(biāo)儀專用的光敏打印紙。 10.按Start，開(kāi)始測(cè)量吸光度，并自動(dòng)打印測(cè)定結(jié)果。 11.測(cè)定完成后，取出酶標(biāo)板，合上蓋，關(guān)儀器開(kāi)關(guān)和電源，蓋上防塵罩。,4.Thermo多功能酶標(biāo)儀的操作,1.開(kāi)機(jī)，點(diǎn)擊 SkanIt RE for Varioskan flash2.4.3,進(jìn)入分析系統(tǒng)； 2. 選擇new session;name;next； 3.選擇酶標(biāo)板，如96孔版；next； 4.選定文件夾；設(shè)定測(cè)定方法，如波長(zhǎng)； 5.連接儀器connect；放板（in）,save;點(diǎn)擊excute session;開(kāi)始讀板，Results,保存數(shù)據(jù)；觀察結(jié)果，記錄或保存； 6.取板（out）,斷開(kāi)連接disconnect,關(guān)機(jī)。,思考題, 普通酶標(biāo)儀測(cè)定時(shí)為什么選擇雙波長(zhǎng)測(cè)定？ ELISA法的原理是什么？ 普通酶標(biāo)儀和紫外分光光度計(jì)有什么區(qū)別？,謝謝,