病毒基礎(chǔ)知識講座(二)

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1、三、病毒學(xué)的發(fā)展歷程病毒病害的病原研究階段； 病毒化學(xué)和結(jié)構(gòu)研究階段。（一）病毒病害的病原研究階段自病毒發(fā)現(xiàn)直到上個世紀(jì)30年代初，病毒學(xué)研究主要集中在：分離和鑒定引起各種病毒性疾病的病毒；病毒對疾體所引起的特異性病理效應(yīng)；病毒的傳播方式和感染宿主范圍；各種理化因子對病毒感染的影響等方面。在病毒發(fā)現(xiàn)的那一年,1898年德國細(xì)菌學(xué)家勒夫勒和弗施（Loeffler和Frosch）證實了口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)的存在。1911年,勞斯(Rous)發(fā)現(xiàn)了引起雞的惡性腫瘤的勞斯肉瘤病毒（Rous sarcoma virus， RSV）。1915-1917年,

2、托特和德愛萊爾（Twort和dHerelle）分別發(fā)現(xiàn)了噬菌體。人們通過過濾性試驗，相繼發(fā)現(xiàn)了近百種病毒病害，包括流感、骨髓灰質(zhì)炎、幾種腦炎、狂犬病、兔的粘液瘤、馬鈴薯花葉病、卷葉病、和條斑病、黃瓜花葉病、小麥花葉病等。而且人們從解決病害觀點出發(fā)，在機(jī)體水平上研究了病毒感染的癥狀、傳播途徑、傳播介體以及病毒的繁殖特征。1899年古巴流行黃熱病，細(xì)菌學(xué)家里德（Reed）證明罪犯確實是伊蚊。接著日本人高見（Takami）證明一種葉蟬會傳水稻矮花病，蚜蟲會傳馬鈴薯退化病。300多年前（1619年）就知道的郁金香碎色病直到1929年才證明是蚜蟲傳的。這時期還發(fā)現(xiàn)了一些非常有趣的病毒生物學(xué)現(xiàn)象，如一種病

3、毒通過變異，產(chǎn)生致病力強(qiáng)弱不等毒株。而且同一種病毒的不同毒株彼此間有拮抗，稱干擾現(xiàn)象。還有人發(fā)現(xiàn)把病植株的汁液注入到動物體內(nèi)后，動物的血清和病汁液起特異的反應(yīng)。這些研究成果都對當(dāng)時防治病毒病起了重要作用。在這一階段，人們對病毒本質(zhì)的認(rèn)識還很膚淺，認(rèn)為病毒是一種與細(xì)菌類似的病原體，所不同的僅在于病毒必須在生活的細(xì)胞內(nèi)才能繁殖，再就是體積十分微小，以致在顯微鏡下不能見到，能夠通過細(xì)菌濾器。這也正是在那一時期把病毒稱之為“超顯微的濾過性病毒”的原因。（二）病毒的化學(xué)和結(jié)構(gòu)研究階段1935年，美國生化學(xué)家斯坦利（Stanley）發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒的侵染性能被胃蛋白酶破壞，在這一現(xiàn)象的啟示下，他幾乎磨了上

4、噸重的感染花葉病的煙葉，企圖用提酶的方法把病毒提純出來。他得到了一小匙在顯微鏡下看來是針狀結(jié)晶的東西，把結(jié)晶物放在少量水中，水就出現(xiàn)乳光了，用手指沾一點這溶液，在健康煙葉上磨擦幾下，一星期以后這棵煙草也得了同樣類型的花葉病?？梢娞峒兊臇|西的確是有侵染性的煙草花葉病毒。今天在美國加州大學(xué)的原來斯坦利實驗室里，仍然保留著一個標(biāo)注著“Tob. Mos.”字樣的瓶子，其中就盛著當(dāng)年第一次提純的煙草花葉病毒（簡稱TMV）。根據(jù)各種試驗結(jié)果，證明這種結(jié)晶物質(zhì)是蛋白質(zhì)，初步的滲透壓和擴(kuò)散測定表明，這種蛋白質(zhì)的分子量高達(dá)幾百萬。其結(jié)晶制品的侵染性依賴于蛋白質(zhì)的完整性，侵染性被認(rèn)為是病毒蛋白質(zhì)的一種性質(zhì)。Sta

5、nley 的研究論文1953年發(fā)表在Science雜志上，他在論文中寫道：“煙草花葉病毒是一種具有自我催化能力的蛋白質(zhì)，它的增殖需要活體細(xì)胞的存在”。在獲得TMV結(jié)晶之后的將近20年時間里，許多其他病毒也相繼被結(jié)晶出來，1955年，Scaffer和Schwerdt成功地結(jié)晶了脊髓灰質(zhì)炎病毒，它是第一個被結(jié)晶出來的動物病毒。然而，Stanley在他的結(jié)晶工作中，并未注意到病毒的含磷組分，1936年Bawden和Pirie等在純化的TMV中發(fā)現(xiàn)了含磷和糖類的組分，它們以核糖核酸的形式存在， 通過熱變化， 這種核酸可以從病毒粒子中釋放出來，這一發(fā)現(xiàn)也被Stanley不久證實，Stanley及其同事證

6、實幾種不同植物病毒的核酸也能從核蛋白的形式中被分離出來。TMV的結(jié)晶及其化學(xué)本質(zhì)的發(fā)現(xiàn)是對醫(yī)學(xué)和生物科學(xué)的巨大貢獻(xiàn)，它不僅引導(dǎo)人們從分子水平去認(rèn)識生命的本質(zhì)，而且為分子病毒學(xué)和分子生物學(xué)的誕生奠定了基礎(chǔ)。鑒于Stanley在TMV研究中的突出貢獻(xiàn)，1946年他被授予諾貝爾獎，這是病毒學(xué)領(lǐng)域第一個獲此殊榮的科學(xué)家。 最初從電子顯微鏡照片上看到的病毒是一些幾乎類似的微粒，1939年，G.A.Kansche在電鏡下直接觀察到了TMV，指出TMV是一種直徑為1.5nm，長為300nm的長桿狀的顆粒，而番茄黃化花葉病毒（Tomato yellow mosaic virus, TYMV）顆粒為球形，直徑為

7、25nm。早期電鏡學(xué)家獲得的最令人振奮的發(fā)現(xiàn)之一是細(xì)菌病毒-噬菌體，dHerelle的噬菌體最初的電鏡照片曾引起很大的轟動。噬菌體雖然非常微小，僅為10nm，但它們具有高度整齊而復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，它們有圓的頭和起初被認(rèn)為是尾巴的附屬物，像個小蝌蚪。在爭論多年以后，確定了噬菌體的附屬物沒有運動的功能，但它對噬菌體吸附于細(xì)胞表面和注射傳染性核酸進(jìn)入到細(xì)胞中卻起了重要的作用。病毒學(xué)研究的化學(xué)時期，還有一些比較重要的進(jìn)展，1934年M.Schlesinger獲得了純化的噬菌體，1938年W.J.Elford測定了各種病毒顆粒大小等。但總的說來，這一階段，病毒學(xué)工作者主要采用敏感動物（如小白鼠）或動物胚胎（如

8、雞胚）來研究病毒，分離鑒定了近百種病毒。同時在機(jī)體水平上研究了病毒的繁殖、發(fā)病機(jī)理和免疫反應(yīng)等。只是微生物學(xué)的一個分支。同時，對病毒化學(xué)本質(zhì)的了解也較為膚淺，對病毒的概念 這一時期，病毒學(xué)雖有很大的進(jìn)展，但尚未形成獨立學(xué)科，它還尚有很大爭論，眾說紛紜。（三）病毒研究的細(xì)胞水平時期這一時期，包括本世紀(jì)40年代至60年代。在此期間，病毒學(xué)不論是在理論上還是在實踐上都有很大的發(fā)展，逐步形成了一門獨立的學(xué)科。由于這個時期對病毒的化學(xué)本質(zhì)有了更清晰的認(rèn)識，因而也有了較為統(tǒng)一的、明確的病毒概念。1、利用大腸桿菌研究噬菌體的感染過程取得了迅速發(fā)展。以M.Delbruck和A.D.Hershey等領(lǐng)導(dǎo)的“噬菌

9、體小組”圍繞噬菌體與感染細(xì)菌細(xì)胞的相互關(guān)系進(jìn)行了大量而深入的研究。這一時期的突出貢獻(xiàn)在于：1940年M.Delbruck闡明了噬菌體的復(fù)制周期；1950年A.Lwoff揭示了溶原性噬菌體誘導(dǎo)的原理；1952年A.D.Hershey證明了噬菌體DNA的感染性；1952年N.D.Zinder發(fā)現(xiàn)了噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象；1952年E.Wollman發(fā)現(xiàn)了溶原性噬菌體。2、組織培養(yǎng)技術(shù)開始應(yīng)用于動物病毒的研究。我國學(xué)者黃禎祥早在1943年就利用雞胚組織塊在試管內(nèi)進(jìn)行病毒傳代、定量滴定及中和試驗。我國已故微生物學(xué)和病毒學(xué)的奠基人高尚蔭院士，1958年在國際病毒學(xué)研討會上宣讀了培養(yǎng)膿細(xì)胞的組織培養(yǎng)方法研究論文

10、，從此揭開了中國昆蟲病毒學(xué)研究的新篇章。許多學(xué)者采用這一新技術(shù)，相繼分離了上百種過去對動物不敏感的新病毒，如腺病毒、副流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、Echo病毒和柯薩奇病毒，大大拓寬了病毒學(xué)的研究范圍。組織培養(yǎng)技術(shù)不僅發(fā)展了臨床病毒學(xué)，而且還可用于研究病毒的復(fù)制和遺傳，使人們對病毒本質(zhì)有了進(jìn)一步的認(rèn)識。 1949年J.J.Enders利用單層細(xì)胞培養(yǎng)繁殖脊髓灰質(zhì)炎病毒取得成功，并且由于他對脊髓灰質(zhì)炎病毒的開創(chuàng)性研究，而于1954年獲得諾貝爾獎。1952年Dulbecco利用細(xì)胞單層培養(yǎng)進(jìn)行了蝕斑試驗，1953年Salk用細(xì)胞培養(yǎng)的脊髓灰質(zhì)炎病毒制備出滅活疫苗，1957年Stewart用細(xì)胞

11、培養(yǎng)技術(shù)還分離出多瘤病毒。目前組織培養(yǎng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于未知傳染因子的分離，病毒病診斷，疫苗生產(chǎn)，以及病毒感染和復(fù)制的基礎(chǔ)研究。組織培養(yǎng)技術(shù)對動物病毒研究所作的貢獻(xiàn)主要包括：病毒轉(zhuǎn)錄新途徑和翻譯新途徑的發(fā)現(xiàn)；病毒對宿主范圍的選擇；某些腫瘤病毒引起的細(xì)胞轉(zhuǎn)化；某些病毒侵染引起的細(xì)胞融合；發(fā)現(xiàn)有的病毒核酸由若干片段組成；有的病毒核酸具有極性的不同，如小RNA病毒為正鏈RNA病毒，正粘病毒為負(fù)鏈RNA病毒。3、植物病毒不斷有重要的發(fā)現(xiàn)，如1952年J.I.Harris揭示了TMV外殼蛋白的化學(xué)性質(zhì)，1955年H.Fraenkel-Conrat成功地將TMV的核酸及其蛋白亞基重建出感染的TMV，1956

12、年H.Fraenkel-Conrat還證明TMV-RNA分子具有感染性，1956年F.A.Anderer闡明了TMV外殼蛋白變性的可逆性；1960年A.Tsugita測定了TMV外殼蛋白的氨基酸序列。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)裘維蕃院士對北京大白菜三大病害和華北小麥叢矮病等進(jìn)行了深入研究。（四）分子病毒學(xué)的研究時期自從1953年DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)理論建立以來，由于分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，新技術(shù)和新方法的應(yīng)用，使得病毒學(xué)的研究步入了分子病毒學(xué)的發(fā)展時期。50年代至60年代是分子生物學(xué)的奠基時代，而病毒特別是噬菌體和植物病毒為此做出了巨大的貢獻(xiàn),因此分子病毒學(xué)也正是分子生物學(xué)的發(fā)展過程中應(yīng)運而生。分子病毒學(xué)的發(fā)展是

13、各相關(guān)學(xué)科如分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)與病毒學(xué)理論和技術(shù)相互滲透的結(jié)果。尤其是分子生物學(xué)新技術(shù)的發(fā)明極大剌激了分子病毒學(xué)的發(fā)展。分子病毒學(xué)的發(fā)展經(jīng)歷了如下過程：1953年，Watson和Crick建立了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)理論，它使人們開始從分子水平上去認(rèn)識遺傳物質(zhì)-DNA的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和復(fù)制特性，理解基因表達(dá)與性狀的關(guān)系，從而為分子生物學(xué)和分子病毒學(xué)的創(chuàng)立奠定了基礎(chǔ)。1962年，D.L.D.Casfar闡明了許多病毒的二十面體結(jié)構(gòu)，明確了病毒核衣殼二十面體的構(gòu)成規(guī)律，這是對病毒超微結(jié)構(gòu)認(rèn)識的重大突破。1962年，D.Nathans成功地進(jìn)行了噬菌體RNA的體外翻譯；1965年，S.Spi

14、egelman成功地在體外復(fù)制出Q噬菌體RNA；1967年M.Goulian成功地體外復(fù)制X174噬菌體。這些工作對以后闡明DNA病毒和RNA病毒 的繁殖機(jī)制起了重要作用。1967年，T.O.Diener發(fā)現(xiàn)了類病毒，他在試圖分離馬鈴薯紡錘形塊莖病的病毒時，發(fā)現(xiàn)其病原不是病毒，而是一種不含有蛋白質(zhì)，分子量為105左右的裸露RNA。這樣小的RNA分子不編碼任何蛋白質(zhì)。根據(jù)其特殊的性質(zhì)，Diener把這類致病因子稱為“類病毒（Viroids）”。隨后的研究表明，類病毒RNA還有特殊的復(fù)制機(jī)制。類病毒的發(fā)現(xiàn)在分子病毒學(xué)史上是一個重要事件，它不僅揭示了自然界存在著比病毒更簡單的生物，而且也使人們加深了

15、對生命起源的認(rèn)識。在類病毒報道之后，有人在澳大利亞又發(fā)現(xiàn)了類似于類病毒的環(huán)狀RNA分子還能與病毒基因組RNA共同包被于RNA病毒粒子中，引起絨毛菸、苜菪和地三葉草產(chǎn)生病害，其中類似于類病毒的RNA稱為“擬病毒（virusoid）”。羊瘙癢病(scrapie)最初也認(rèn)為是類病毒引起的，Prusiner于1982年證實瘙癢因子不是類病毒，而是一種分子量只有3.0104的蛋白質(zhì)，稱為“蛋白侵染因子”或“朊病毒”（prion）。根據(jù)類病毒的發(fā)現(xiàn)，Lavoff（1981）首先提出把病毒分為真病毒（envirus）和類病毒的概念。隨著擬病毒和朊病毒的相繼發(fā)現(xiàn)，1983年在意大利召開的“植物和動物的亞病毒病

16、原：類病毒和朊病毒”國際學(xué)術(shù)討論會上，把類病毒、擬病毒和朊病毒列入亞病毒（subvirus）。1968年，P.H.Duesberg發(fā)現(xiàn)流感病毒的多節(jié)段RNA基因組，隨后在其他一些病毒中如呼腸孤病毒、大麥條紋花葉病毒中也發(fā)現(xiàn)了病毒基因組分節(jié)現(xiàn)象的存在。1970年，P.H.Duelerg發(fā)現(xiàn)Rous肉瘤病毒含有癌基因v-src，而且在正常雞以及其他脊椎動物和無脊椎動物的DNA中，也發(fā)現(xiàn)有癌基因v-src的同源序列存在，推測病毒癌基因是來自于細(xì)胞正?；?。隨著其他腫瘤病毒致癌基因的發(fā)現(xiàn)，腫瘤病毒的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)建立，以及腫瘤病毒對細(xì)胞轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)作用的確定，使人們對腫瘤發(fā)生的機(jī)制有了更深刻的了解。1970

17、年，H.M.Temin和D.Baltimor分別發(fā)現(xiàn)了病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄酶基因組RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，首先合成原病毒DNA，然后原病毒可整合到宿主染色體DNA上。除了病毒癌基因外，原病毒在宿主DNA上的插入、整合，也可以引起細(xì)胞癌基因的激活和細(xì)胞轉(zhuǎn)化，逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄過程的發(fā)現(xiàn)，是對Crick 1958年提出的遺傳學(xué)中心法則的重要補充和發(fā)展，說明遺傳信息不僅可以從DNA RNA，也可由RNA DNA。1971年，限制性內(nèi)切酶技術(shù)的發(fā)現(xiàn)為DNA序列分析和病毒基因的定位創(chuàng)造了條件，利用這一技術(shù)曾經(jīng)成功地為乳頭瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、皰疹病毒構(gòu)建了酶切圖譜。另一些新技術(shù)如基因轉(zhuǎn)移方法、So

18、uthen blot的相繼誕生，也加快了病毒特異性基因，尤其是轉(zhuǎn)化基因的定位和病毒核酸序列分析的進(jìn)程。除此以外，70年代出現(xiàn)的DNA重組技術(shù)，使一些病毒基因組能在原核細(xì)胞的質(zhì)粒載體上克隆，并在細(xì)菌中能夠得到大量復(fù)制和表達(dá)產(chǎn)物，因而有利于探尋病毒的基因組結(jié)構(gòu)和功能。1977年，英國劍橋大學(xué)的Sanger完成了X174-DNA全部序列的測定,為此Sanger第二次獲得諾貝爾獎。根據(jù)X174-DNA全部序列的分析結(jié)果，Sanger意想不到地發(fā)現(xiàn)了基因重疊現(xiàn)象。隨后，在DNA噬菌體如R17、MS2、F2、Q中也證實了基因重疊現(xiàn)象的存在，這是病毒利用有限的遺傳信息執(zhí)行更多的功能，提高自身在進(jìn)化過程中適應(yīng)

19、能力的一種表現(xiàn)。1977年，LTChow闡明了腺病毒轉(zhuǎn)錄過程中的mRNA拼接現(xiàn)象，隨后在SV40、多瘤病毒中也相繼發(fā)現(xiàn)了mRNA轉(zhuǎn)錄后的拼接過程，從而證實了真核基因的不連續(xù)性，明確了內(nèi)含子（intron）和外顯子（exon）的概念。1978年，WFiers和V.B.Reddy測定了SV40-DNA的一級結(jié)構(gòu)由5224個堿基對組成。SV40是第一個全部核苷酸序列被搞清楚的真核病毒，它含有結(jié)構(gòu)基因VP1、VP2、VP3以及轉(zhuǎn)化基因T和t，整個基因組有12.5%非編碼區(qū)或非翻譯區(qū)，在這些區(qū)域中包含啟動子、增強(qiáng)子序列和其他調(diào)節(jié)序列，可對病毒基因組復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯進(jìn)行調(diào)控。由于SV40既是研究真核基因結(jié)

20、構(gòu)和表達(dá)的良好模型，又是研究癌變機(jī)制的理想材料，因此，SV40-DNA一級結(jié)構(gòu)的測定具有重要意義。在70年代，Miller和Barbara研究X174-DNA轉(zhuǎn)錄時還發(fā)現(xiàn)了X174-DNA僅有一條鏈被轉(zhuǎn)錄，他們利用X174噬菌體感染大腸桿菌，并在培養(yǎng)基中加入32P-磷酸鹽以制備放射性的噬菌體mRNA，然后再將標(biāo)記的mRNA分離出來，讓其與分開來的RF-DNA正負(fù)鏈雜交，結(jié)果觀察到僅有RF-DNA的負(fù)鏈與標(biāo)記mRNA形成雜交體。因而讓實在活體內(nèi)X174的RF DNA中僅一條鏈?zhǔn)寝D(zhuǎn)錄的模板。與此相類似，T7噬菌體DNA在活體中也只有一條單鏈被轉(zhuǎn)錄。但在T4或噬菌體中情形較為復(fù)雜,其基因組中的某些部

21、分是以一條鏈作為模板，而在另一區(qū)域，則是以另一條鏈為模板。大腸桿菌基因組的轉(zhuǎn)錄也同樣存在一組基因與另一組基因的模板鏈不同。1979年，TTaniguchi用載體成功地表達(dá)了人干擾素基因。這是基因工程的一項大突破。進(jìn)入八十年代后，分子病毒學(xué)的研究無論是在深度和廣度都有了很大的發(fā)展。這里只舉一些重要進(jìn)展。1981年，D.K.Kleid等利用重組DNA技術(shù)制備出口蹄疫病毒疫苗；1982年，J.Summers等發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒DNA復(fù)制中有逆轉(zhuǎn)錄過程；1982年，B.Moss和E.Paoletti用痘苗病毒作為載體表達(dá)外源基因；1983年，Montagnier和R.C.Gallo分別分離到與AIDS相

22、關(guān)的人類逆轉(zhuǎn)錄病毒（HIV）；1985年，H.Vonder Patten等在3A下闡明了鼻病毒的晶體結(jié)構(gòu);1988年，Chuo和Yamaya用弱病毒全長cDNA導(dǎo)入產(chǎn)生抗病毒的轉(zhuǎn)化植株；1990年以來，PCR技術(shù)在分子病毒學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，目前PCR已成為病毒性疾病診斷和研究的重要手段。1993年，美國科學(xué)家K.Mullis由于發(fā)明了PCR儀而與第一個設(shè)計基因定點突變的Smith共享諾貝爾化學(xué)獎。1991年，Han等將Moloney鼠白血病毒的反義表達(dá)序列導(dǎo)入小鼠受精卵中，從而培育成功對該病毒有抗性的轉(zhuǎn)基因小鼠。1992年，Desrosiers等利用SIV mac239/nef缺失突變株制

23、備出減毒活疫苗，取得了抗SIV感染成功，也給HIV疫苗的研究賦予了許多啟示。1995年，HIV天冬氨酰蛋白酶三維結(jié)構(gòu)的鑒定，使得一些針對病毒蛋白酶活性位點的抑制劑先后問世。1996年，David Ho利用逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑與蛋白酶抑制劑配成的“雞尾酒”式藥，成功地抵抗了HIV感染，因而1996年稱為AIDS希望年。1997年，美國加利福尼亞大學(xué)的神經(jīng)病學(xué)和病毒學(xué)教授S.Prusiner由于發(fā)現(xiàn)了羊瘙癢病的致病因子是朊病毒（prion），以及提出了瘋牛病、Creutz-feldt-Jakob氏病、Kuru病等腦退化性疾病是由朊病毒引起的理論，而獲得了諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。然而朊病毒究竟是一種傳染性因子，還是由正常基因突變形成的結(jié)構(gòu)異常的蛋白質(zhì)，至今仍處于爭論之中。病毒學(xué)經(jīng)過上述四個時期的發(fā)展，逐漸形成和成熟起來，隨著病毒基因組復(fù)制、基因表達(dá)調(diào)控原理、病毒與宿主細(xì)胞的相互作用規(guī)律，病毒感染和致病的分子機(jī)制的揭示，以及分子病毒學(xué)在技術(shù)上的革新和進(jìn)步，它將為人類克服和戰(zhàn)勝病毒病做出貢獻(xiàn)。