《HPLC原理與應(yīng)用》PPT課件.ppt

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1、高效液相色譜法,化學(xué)化工學(xué)院,1.HPLC儀器結(jié)構(gòu)及原理,根據(jù)各組分在固定相及流動(dòng)相中的吸附能力、分配系數(shù)、離子交換作用或分子尺寸大小的差異，因此在同一推動(dòng)力作用下，不同組分在固定相中的滯留時(shí)間有長(zhǎng)有短，從而實(shí)現(xiàn)分離的目的,1.HPLC儀器結(jié)構(gòu)及原理,3.操作條件的選擇流動(dòng)相的選擇,流動(dòng)相要求： (1)溶劑應(yīng)當(dāng)是高純度，溶劑與固定相不互溶，并能保持色譜柱的穩(wěn)定性； (2)溶劑的性能與使用的檢測(cè)器應(yīng)當(dāng)匹配；選用檢測(cè)器波長(zhǎng)比溶劑的紫外截止波長(zhǎng)要長(zhǎng)，甲醇：205nm; 乙腈：190nm (3)溶劑對(duì)樣品應(yīng)有足夠的溶解能力； (4)溶劑應(yīng)具有低的粘度和適當(dāng)?shù)偷姆悬c(diǎn)； (5)盡量避免使用具有顯著毒性的溶

2、劑。,常用流動(dòng)相溶劑：,反向色譜常用流動(dòng)相及沖洗強(qiáng)度 H2O甲醇乙腈丙醇異丙醇四氫呋喃 最常用組成：甲醇/ H2O 、 乙腈/ H2O 洗脫順序：極性物質(zhì)先洗脫下來(lái) 正想色譜常用流動(dòng)相及沖洗強(qiáng)度 正乙烷乙醚乙酸乙酯異丙醇,洗脫方式等度洗脫、梯度洗脫,等度洗脫： 整個(gè)洗脫過(guò)程中，流動(dòng)相的組成比保持不變 梯度洗脫： 在一個(gè)分析周期中，按照一定的時(shí)間程序連續(xù)或階段性的改變流動(dòng)相的組成比，從而改變?nèi)軇┑臉O性、離子強(qiáng)度、pH值等，使每個(gè)組分在適宜的條件下獲得分離。 梯度洗脫優(yōu)點(diǎn)： 改善峰型；提高柱效；減少分析時(shí)間；使強(qiáng)滯留組分不容易殘留在柱子。,梯度洗脫裝置,二元高壓梯度：先加壓后混合 利用兩臺(tái)高壓輸液

3、泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例輸入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。,一臺(tái)高壓泵，通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥，將兩種或者多種 不同極性的溶劑按一定比例抽入高壓泵中混合,四元低壓梯度：先混合后加壓,4.HPLC在各領(lǐng)域的主要應(yīng)用,1.環(huán)境:多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、硝基化合物、酚類化合物、鄰苯二甲酸脂等。 2.食品:食品營(yíng)養(yǎng)成分分析、食品添加劑分析、食品污染物分析。 3.醫(yī)藥:合成藥物：抗生素、抗憂郁藥物、黃胺類藥等；天然藥物：鑒別中藥真?zhèn)位蛘弋a(chǎn)地、吲哚堿、鴉片堿、強(qiáng)心甙測(cè)定等。 4.農(nóng)藥:有機(jī)農(nóng)藥、除草劑等。 5.化工:無(wú)機(jī)化工產(chǎn)品、合成高分子化合物、表面活性劑、洗滌劑成分、化妝品、染料等。,1.環(huán)境保護(hù)多環(huán)

4、芳烴標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖,1.環(huán)境保護(hù)苯及其衍生的分離譜圖,2.食品分析中的應(yīng)用食品營(yíng)養(yǎng)成分分析,啤酒中的有機(jī)酸分析,2.食品分析中的應(yīng)用食品營(yíng)養(yǎng)成分分析,2.食品分析中的應(yīng)用食品添加劑分析,3.醫(yī)藥中的應(yīng)用抗生素的測(cè)定,3.醫(yī)藥中的應(yīng)用復(fù)方丹參片中丹參酮A的測(cè)定,3.醫(yī)藥中的應(yīng)用中藥白鮮皮的指紋圖譜,不同地區(qū)的白鮮皮指紋圖譜考察,A吉林仁和 B黑龍江 C哈爾濱 D上海 E長(zhǎng)沙 F承德圍場(chǎng) G西安 H烏魯木齊,4.化工中的應(yīng)用24種禁用偶氮染料色譜圖,4. HPLC發(fā)展前景,固定相的發(fā)展 前處理方法 檢測(cè)器的發(fā)展 聯(lián)用技術(shù)的發(fā)明與應(yīng)用,4. HPLC發(fā)展前景固定相的發(fā)展,固定相基質(zhì) 高純硅膠微球 聚合

5、物微球 有機(jī)-無(wú)機(jī)復(fù)合物 氧化鈷微球 多孔石墨微球,鍵合及改性技術(shù) 立體保護(hù)鍵合固定相 包埋極性基團(tuán)烷基鍵合固定相 全氟烷基鍵合 聚合物涂覆改性,高純硅膠基質(zhì)固定相,硅膠除了具有良好的機(jī)械強(qiáng)度、容易控制的孔結(jié)構(gòu)和比表面積、較好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性以及專一的表面化學(xué)反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn), 還有一個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)就是其表面含有豐富的硅羥基, 這是硅膠可以進(jìn)行表面化學(xué)鍵合或改性的基礎(chǔ)。 突出特點(diǎn)是耐溶劑沖洗，并且可以通過(guò)改變鍵合相有機(jī)官能團(tuán)的類型來(lái)改變分離的選擇性。,化學(xué)鍵合的種類,按鍵合官能團(tuán)的極性分：極性和非極性鍵合。 極性鍵合相：氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)鍵合相。 非極性鍵合相：

6、各種烷基(C1C18)和苯基、苯甲基等，以C18應(yīng)用最廣。,硅膠鍵合固定相的應(yīng)用,10種混合物在大黃酸鍵合硅膠固定相 (a)和C18 (b)的色譜圖,聚合物基質(zhì)固定相,優(yōu)點(diǎn)： 色譜選擇性好 樣品容量較大 化學(xué)穩(wěn)定性好 不易產(chǎn)生非特異性吸附 不足： 剛性不理想、孔結(jié)構(gòu)復(fù)雜、溶脹或收縮,多孔石墨化碳固定相,特點(diǎn)： 穩(wěn)定性好-在低或高pH條件下抑制酸堿離子 極性樣品具有較強(qiáng)的保留 異構(gòu)體選擇性提高 可分離旋光異構(gòu)體 可進(jìn)行族分離 流動(dòng)相組成簡(jiǎn)單,氧化鈷基質(zhì)固定相,優(yōu)點(diǎn)： 穩(wěn)定性好 強(qiáng)堿分析速度快 高溫快速分析,優(yōu)點(diǎn)： 高比例水流動(dòng)相，不會(huì)導(dǎo)致烷基鏈?zhǔn)湛s 極性化合物(包括酸和堿性化合物)保留增強(qiáng) 傳統(tǒng)

7、C18C8固定相選擇性不同 可用低濃度緩沖溶液作流動(dòng)相，以及固定相官能團(tuán)低流失，適合于LC/MS,包埋極性基團(tuán)烷基鍵合固定相,包埋極性基團(tuán)鍵合相作用機(jī)理,溶質(zhì)與極性基團(tuán)的作用； 溶質(zhì)和硅羥基與極性基團(tuán)的競(jìng)爭(zhēng)作用； 極性基團(tuán)增加表面層水濃度,氟烷基鍵合固定相,特點(diǎn)： 在與 C18/C8 相似的流動(dòng)相條件下，選擇性改善 鹵代化合物和芳香異構(gòu)體的保留更強(qiáng) 分離含羥基、羧基、硝基和其它極性基團(tuán)化合物具有顯著優(yōu)勢(shì),4. HPLC發(fā)展前景樣品前處理方法,固相萃取,固相萃取,優(yōu)點(diǎn)：同步實(shí)現(xiàn)富集和純化 應(yīng)用范圍： 水中有機(jī)污染物的痕量富集、水中半揮發(fā)性有機(jī)物的測(cè)定及大氣和土壤樣品的前處理,4. HPLC發(fā)展前

8、景樣品前處理方法,分散液液微萃取,分散液液微萃取,特點(diǎn)： 有機(jī)溶劑用量少，富集倍數(shù)高 應(yīng)用范圍： 適用于水溶液中有機(jī)物的提取，如有機(jī)磷農(nóng)藥、酚類物質(zhì)等。也可用于水溶液中重金屬( 鈀 鈷 鉛 釩 有機(jī)錫等)的萃取。,4. HPLC發(fā)展前景樣品前處理方法,固相微萃?。?在固相萃取基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)，采用一根聚合物涂層的熔融石英纖維，從樣品基質(zhì)中或樣品上方的頂空氣體中直接吸附萃取待測(cè)物，然后再色譜進(jìn)樣口解吸、分析。 優(yōu)點(diǎn)： 所需樣本量少,避免了乳化現(xiàn)象,回收率高， 重現(xiàn)性好,而且便于自動(dòng)化操作。,4. HPLC發(fā)展前景樣品前處理方法,超臨界流體萃?。?利用超臨界流體的溶解能力與超臨界流體具有與流體相近的

9、密度和與氣體相近的豁度，擴(kuò)散系數(shù)為液體的10倍至100倍，對(duì)很多物質(zhì)有較好的滲透性和較強(qiáng)的溶解能力。 優(yōu)點(diǎn)： 提取過(guò)程快速、簡(jiǎn)便，消除有機(jī)溶劑對(duì)人體和環(huán)境的危害，并可與許多分析儀器聯(lián)用。,4. HPLC發(fā)展前景樣品前處理方法,微波輔助萃?。?在微波中，由于吸收微波能力的差異使基體物質(zhì)的某些區(qū)域或萃取習(xí)題的某些組分被選擇性的加熱，從而使樣品中要分析的組分從樣品基質(zhì)中滲出，實(shí)現(xiàn)與基質(zhì)的分離。 優(yōu)點(diǎn)： 受溶劑親和力影響小，設(shè)備簡(jiǎn)單，適用范圍廣，重現(xiàn)性好，節(jié)省時(shí)間和溶劑。,4. HPLC發(fā)展前景樣品前處理方法,濁點(diǎn)萃?。?以中性表面活性劑膠束水溶液的溶解性和濁點(diǎn)現(xiàn)象為基礎(chǔ)，通過(guò)改變實(shí)驗(yàn)參數(shù)引發(fā)相分離，

10、將疏水性物質(zhì)與親水性物質(zhì)分開(kāi)。 優(yōu)點(diǎn)： 萃取率高、富集因子大、操作簡(jiǎn)便、安全、經(jīng)濟(jì)，便于實(shí)現(xiàn)聯(lián)用。,4. HPLC發(fā)展前景檢測(cè)器,種類：紫外檢測(cè)器(UV) 熒光檢測(cè)器(FD) 電化學(xué)檢測(cè)器(ECD) 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD) 示差折光檢測(cè)器(RID),紫外檢測(cè)器(UV),原理： 基于Lambert-Beer定律，即被測(cè)組分對(duì)紫外光或可見(jiàn)光具有吸收，且吸收強(qiáng)度與組分濃度成正比。 優(yōu)點(diǎn): a: 靈敏度高，檢測(cè)下限約為 10-6 gml b: 線性范圍廣 C: 對(duì)溫度和流速不敏感，適于進(jìn)行梯度洗脫 紫外檢測(cè)器的類型: 固定波長(zhǎng)型(已淘汰)； 可變波長(zhǎng)型(最常用)； 二極管陣列檢測(cè)器(最新型)。,

11、二極管陣列檢測(cè)器（DAD）,時(shí)間、光強(qiáng)度和 波長(zhǎng)的三維譜圖,熒光檢測(cè)器（FLD）,原理: 物質(zhì)的分子或原子經(jīng)光照射后，有些電子被激發(fā)至較高的能 級(jí)，這些電子從高能級(jí) 躍至低能級(jí)時(shí)，物質(zhì)會(huì)發(fā)出比入射光 波長(zhǎng)較 長(zhǎng)的光，這種光稱為熒光。 熒光強(qiáng)度(F)與激發(fā)光強(qiáng)度(I0)及熒光物質(zhì)濃度(C)成正比。 優(yōu)點(diǎn)： 靈敏度高、選擇性好，是微量組分和體內(nèi)藥物分析常用的檢測(cè)器之一。,熒光檢測(cè)器（FLD）結(jié)構(gòu)示意圖,HPLC-FLD檢測(cè)發(fā)霉的花生中的黃曲霉素B1和黃曲霉素B2,黃曲霉素B2,黃曲霉素B1,流動(dòng)相：H2O :乙腈：甲醇 (60/20/20, v/v/v) 流速：1mL/min 柱溫：25,電化學(xué)檢

12、測(cè)器(ECD),原理（電導(dǎo)檢測(cè)器）：兩個(gè)對(duì)電極測(cè)量樣品中離子型溶質(zhì)的電導(dǎo)，由電導(dǎo)的變化測(cè)定的濃度。 原理（安培檢測(cè)器）：利用待測(cè)物流入反應(yīng)池時(shí)在工作電極表明發(fā)生氧化還原反應(yīng)，兩電極間有電流通過(guò)，電流大小與待測(cè)物質(zhì)濃度成正比。 適用范圍： 凡具氧化還原活性的物質(zhì)都能進(jìn)行檢測(cè)，本身沒(méi)有氧化還原活性的物質(zhì)經(jīng)過(guò)衍生化后也能進(jìn)行檢測(cè)。 優(yōu)點(diǎn)：靈敏度很高，尤其適用于痕量組分分析。,HPLC-ECD檢測(cè)綠原酸、咖啡酸、阿魏酸,蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD),原理： 將洗脫液引入霧化器與氣體混合形成均勻的微小液滴，蒸發(fā)除去流動(dòng)相而樣品組分形成氣溶膠，進(jìn)入檢測(cè)室，用強(qiáng)光或激光照射氣溶膠產(chǎn)生光散射，用光電二極管檢測(cè)

13、散射光。散射光的強(qiáng)度(I)與組分的質(zhì)量(m)通常具有下述關(guān)系：IKmb,散射光的對(duì)數(shù)響應(yīng)值與組分質(zhì)量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。,HPLC-ELSD測(cè)定磷酸陰離子 鈣陽(yáng)離子,4. HPLC發(fā)展前景聯(lián)用技術(shù)的發(fā)明與應(yīng)用,高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）,液質(zhì)(LC/MS)聯(lián)用系統(tǒng)的示意圖,HPLC-MS優(yōu)點(diǎn)：,1.是一種軟電離方式，適合穩(wěn)定性差、極 性大、分子量大的物質(zhì)的電離。 2.主要生成準(zhǔn)分子離子（M+H+ 、M- H-、 M+Na+等），生物大分析產(chǎn)生多電荷離子。 3.靈敏度高 4.不能進(jìn)行譜庫(kù)檢索 5.不適用于非極性化合物的分析,HPLC-MS應(yīng)用,LC/MS檢測(cè):利血平,高效液相色譜

14、-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（HPLC-MS/MS）,HPLC-MS/MS: 第一級(jí)質(zhì)譜分離感興趣的離子，第二級(jí)質(zhì)譜通過(guò)在碰撞過(guò)程中產(chǎn)生的碎片譜來(lái)表示其特征。 與HPLC-MS比較： HPLC-MS/MS技術(shù)可減少或消除樣品基質(zhì)中無(wú)關(guān)物的干擾，特異性好，靈敏度高，分析速度快，提供豐富的結(jié)構(gòu)信息，為物證鑒定提供絕對(duì)可靠的依據(jù)，如毒物分析、濫用藥物鑒定、爆炸殘留物分析等.,高效液相色譜-共振瑞利散射聯(lián)用技術(shù)（HPLC-RRS）,聯(lián)用裝置圖,HPLC-RRS優(yōu)點(diǎn),分離效率高 分析數(shù)度快 選擇性好 自動(dòng)化檢測(cè) 為無(wú)電化學(xué)性質(zhì)和光譜性質(zhì)的物質(zhì)提供新的檢測(cè)手段 可直接用于復(fù)雜樣品中微量組分的分離及測(cè)定。,HPLC-RRS的應(yīng)用,HPLC-RRS技術(shù)和HPLC-UV檢測(cè)土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素圖譜,HPLC-RRS測(cè)定血樣中氨基糖苷類抗生素,4. HPLC發(fā)展前景聯(lián)用技術(shù)的發(fā)明與應(yīng)用,高效液相色譜-核磁共振波譜聯(lián)用（HPLC-NRM） 優(yōu)點(diǎn)： 1.分離和結(jié)構(gòu)解析 2.對(duì)光、氧不敏感 缺點(diǎn)： 1.靈敏度低 2.線寬與流速有關(guān) 3.多溶劑信號(hào)突出 4.耗時(shí),HPLC-NMR的應(yīng)用,問(wèn)題？,