動物分子遺傳育種學(xué)第4章課件

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1、Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,（自1982以來）已成功：小鼠、大鼠、兔、豬、綿羊、山羊、牛、雞、魚等多種轉(zhuǎn)基因動物。,第一節(jié),動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的理論基礎(chǔ),染色體交換與基因轉(zhuǎn)移：,聯(lián)會,轉(zhuǎn)座子,基因組內(nèi),轉(zhuǎn)基因,（自然產(chǎn)生）,生物界的這些現(xiàn)象及其發(fā)現(xiàn)是轉(zhuǎn)基因動物得以產(chǎn)生的一個基礎(chǔ)。,物種進(jìn)

2、化與基因表達(dá)調(diào)空：,物種進(jìn)化,產(chǎn)生多,種物種,重要基因高,的保守性,表達(dá)調(diào)空機(jī)制,相似或相同,被轉(zhuǎn)基因,成功表達(dá),生物界的這些現(xiàn)象及其發(fā)現(xiàn)是轉(zhuǎn)基因動物得以產(chǎn)生的又一基礎(chǔ)。,基因組研究與分子克隆：,基因組計劃,遺傳圖,物理圖,轉(zhuǎn)錄圖,序列圖,DNA重組,及克隆,轉(zhuǎn)基因動物,這些技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展是轉(zhuǎn)基因動物得以產(chǎn)生的主要基礎(chǔ)。,轉(zhuǎn)基因的表達(dá)特征：,（1）,時空,特異性表達(dá),（2）可控性表達(dá),（3）共抑制性,（,當(dāng)轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源基因存,在同源關(guān)系時，二者的表達(dá)均受到抑,制，其原因極其復(fù)雜，目前尚未完全,清楚,）,（4）沉默現(xiàn)象,原因：a.整和在不適當(dāng)?shù)牟课弧?b.被受體細(xì)胞識別為異己DNA,后將其甲基

3、化而失活。,c.轉(zhuǎn)基因本身構(gòu)建不恰當(dāng)，而,無法轉(zhuǎn)錄表達(dá)。,轉(zhuǎn)基因動物的成功率,受精卵,（開始）,轉(zhuǎn)基因動物,子代（結(jié)束）,總成功率：陽性動物子代數(shù) 待轉(zhuǎn)基因受精卵數(shù),不同動物的轉(zhuǎn)基因成功率,動物轉(zhuǎn)基因的技術(shù)：,（1）上游技術(shù)：,是指利用分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行基因改造，載體構(gòu)建，最后組裝成轉(zhuǎn)基因單位的一系列方法技術(shù)。,（2）中游技術(shù)：,包括外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞、胚胎移植、轉(zhuǎn)基因動物的繁育建系等。,（3）下游技術(shù)：,是指轉(zhuǎn)基因的整和表達(dá)情況的檢測。,下游技術(shù)的檢測方法：,（1）在染色體和DNA水平上：,a.Southern 雜交,b.PCR擴(kuò)增,c.熒光原位雜交,（2）在 mRNA水平上：

4、,a.,Nouthern blot雜交,b.RT-PCR擴(kuò)增,（3）在Pr水平上：,Western blot雜交。,（4）表型水平上：,檢測轉(zhuǎn)基因動物在生長速度、抗病性、產(chǎn)品質(zhì)量等方面與原來動物有無差異。,第二節(jié),轉(zhuǎn)基因動物的研究方法,轉(zhuǎn)基因動物的常用方法：,（1）顯微注射法,（2）逆轉(zhuǎn)錄病毒法,（3）胚胎干細(xì)胞法,（4）精子載體法,顯微注射法：,外源基因構(gòu)建,準(zhǔn)備受精卵,顯微注射,胚胎移植,轉(zhuǎn)基因檢測,優(yōu)點(diǎn)：,（1）安全（無病毒基因組序列）,（2）轉(zhuǎn)移率高（整合率達(dá)30%）,（3）相對較短周期內(nèi)可得到純合體,缺點(diǎn)：,（1）設(shè)備昂貴，所需技術(shù)性很強(qiáng)。,（2）轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)無法控制，通,常為多拷

5、貝，最多可達(dá)幾百個,（3）通常在插入點(diǎn)引起突變（重組、,缺失）造成動物生理缺陷,顯微注射法：,逆轉(zhuǎn)錄病毒法：,逆轉(zhuǎn)錄病毒：,是一種整合性的單鏈RNA病毒。,該方法就是將外源基因重新組合在逆轉(zhuǎn)錄病毒載上，然后在去感染著床前或著床后的胚胎，將外源基因?qū)雱游锛?xì)胞內(nèi)，是目前開展動物轉(zhuǎn)基因研究中最有效的方法一。,優(yōu)點(diǎn):,（1）,整合率高。,（2）單位點(diǎn)、單拷貝。,（3）插入位點(diǎn)的克隆分析較容易。,缺點(diǎn):,（1）,逆轉(zhuǎn)錄病毒容量小，轉(zhuǎn)移片段一般,小于 10kb，故被轉(zhuǎn)入基因通常無調(diào),空序列。,（2）病毒基因組有可能與外源基因一起整,合到受體細(xì)胞染色體上，造成轉(zhuǎn)基因,動物的污染，限制了其在商業(yè)轉(zhuǎn)基因,動物

6、中的應(yīng)用。,逆轉(zhuǎn)錄病毒法：,胚胎,干細(xì)胞,法,通過,顯微注射法,或,逆轉(zhuǎn)錄病毒法,將外源基因引入到ES細(xì)胞內(nèi)，使外源基因整合到ES基因組內(nèi)某一非必需基因位點(diǎn)上,再對 ES細(xì)胞進(jìn)行篩選鑒定和培養(yǎng)擴(kuò)增,用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物.,優(yōu)點(diǎn):,(1),外源基因整合與表達(dá)可以在干細(xì),胞中檢 測.,(2)可以對,外源基因進(jìn)行定點(diǎn)整合.,缺點(diǎn),:,需要經(jīng)過多代的選育,才能得到純合,的轉(zhuǎn)基因動物,這對牛、羊等產(chǎn)仔數(shù),少，世代間隔長的大動物來講是很困,難的。,胚胎干細(xì)胞法,精子載體法,利用精子作為轉(zhuǎn)移外源基因的載體，通過受精將外源基因帶入卵細(xì)胞，并整合在染色體上的一種方法。,實(shí)際上很早以前，人們就已發(fā)現(xiàn)，,通過受精過程

7、，精子可以將外源基因帶入卵細(xì)胞。,但到目前為止，人們尚不清楚這種過程的確切機(jī)制。不過這并不影響精子載體法在轉(zhuǎn)基因動物研究中的應(yīng)用。,精子與外源基因結(jié)合的部位：,（1）精子的整個頭部區(qū)域。,（2）精子的頭前區(qū)域。,（3）精子的頭后區(qū)域。,該種結(jié)合一般不出現(xiàn)在精子的尾部。,影響精子與外源基因結(jié)合的因素：,（1）外源基因的大?。ù髢?yōu)于?。?（2）精子頭部的特異性蛋白質(zhì)（有促進(jìn)）,（3）清洗精子（有促進(jìn)）,外源基因的存在方式：,（1）整合到受體細(xì)胞的染色體上。,（2）外源基因以附加體的形式存在,（易丟失，但通過設(shè)計增加自主復(fù)制,序列可以穩(wěn)定存在，并正確表達(dá)而,得到轉(zhuǎn)基因動物）。,優(yōu)點(diǎn)：（,1）,方法

8、簡單實(shí)用，只通過人工受精,就可生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物。,（2）以附加體形式得到的轉(zhuǎn)基因動物,在理論上可以不受受體基因組的,影響，以達(dá)到特異性表達(dá),精子載體法,第三節(jié),轉(zhuǎn)基因動物育種現(xiàn)狀,轉(zhuǎn)基因動物育種包括兩個方面：,（1）常規(guī)性轉(zhuǎn)基因動物育種：直接轉(zhuǎn)入高產(chǎn)基因（低產(chǎn) 高產(chǎn)）。,（2）動物生物反應(yīng)器（乳腺、血液等）。,常規(guī)性轉(zhuǎn)基因動物育種：,在國內(nèi)外均開展了相關(guān)技術(shù)的研究。例如：轉(zhuǎn)入人GH基因的豬在生長速度、飼料利用率、胴體瘦肉率方面有了明顯的改善。,但轉(zhuǎn)基因普遍體質(zhì)下降，表現(xiàn)出,病態(tài),現(xiàn)象，特別是,胃病、關(guān)節(jié)病,明顯增加。因此，如用常規(guī)性轉(zhuǎn)基因動物培育新的動物品種尚需做很多,基礎(chǔ)性研究,工作。,綿羊和

9、魚:,這兩種動物的轉(zhuǎn)基因個體沒有發(fā)現(xiàn)健康和繁殖性能方面的異常，大有希望培育新品種應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中。,列外:,非常規(guī)轉(zhuǎn)基因動物育種（動物生物反器）：,動物生物反應(yīng)器的出現(xiàn)生物技術(shù)領(lǐng)域和畜牧業(yè)的一次革命，具有重要而深遠(yuǎn)的意義。,畜產(chǎn)品,工業(yè)產(chǎn)品,目前發(fā)展最快的是動物,乳腺,生物反應(yīng)器，用來生產(chǎn),藥用蛋白,或,酶蛋白,，是一種,全新的生產(chǎn)模式,，其優(yōu)越性：,（1）動物乳腺是一個,封閉系統(tǒng),，可避免外源基因表達(dá)產(chǎn)物對動物健康造成的危害。,（2）乳腺組織對外源表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行正確的,加工和修飾,，使其具有天然產(chǎn)品相似的生物活性。,（3）在乳腺中表達(dá)的目的基因,可以遺傳,（可擴(kuò)繁）,利用,動物生物反應(yīng)器,生

10、產(chǎn)產(chǎn)品時，不同動物其開發(fā)利用價值,差異極大,。故在選擇轉(zhuǎn)基因動物時，需考慮如下因素：,（1）世代間隔,（2）產(chǎn)仔數(shù),（3）抗病力,（4）飼養(yǎng)成本,（5）目的基因產(chǎn),物的多少,不同轉(zhuǎn)基因動物開發(fā)利用價值比較及評價,轉(zhuǎn)基因動物中存在的主要問題：,（1）外源基因的整合率和總成功率低，已經(jīng)整合的外源基因易于丟失，遺傳率也低。,（2）外源基因的表達(dá)不理想。,（3）外源基因常導(dǎo)致受體動物基因突變或功能紊亂。,轉(zhuǎn)基因動物的育種前景：,目前，人們在轉(zhuǎn)基因動物育種中，已經(jīng)取得了一定的經(jīng)濟(jì)效益。特別是非常規(guī)性的轉(zhuǎn)基因動物育種中。動物生物反應(yīng)器投資相對少，效益大，無公害。,荷蘭的Genpharm公司,（1990）,培育的帶有人,LF,的轉(zhuǎn)基因奶牛，制造嬰兒奶粉的年產(chǎn)值達(dá),50億,美元。,英國的PPL公司,（1991）,培育的帶有人,抗胰蛋白酶,基因的轉(zhuǎn)基因山羊羊奶，每升售價,6000,美元。,美國DNA公司,（1991）,培育的帶有人,Hb,轉(zhuǎn)基因豬，年產(chǎn),20萬單位,人Hb，產(chǎn)值達(dá)5000萬美元。,例如：,因此，人們把轉(zhuǎn)基因動物稱為“分子農(nóng)場”。,在常規(guī)的轉(zhuǎn)基因動物育種中也出現(xiàn)了一些問題，但我們完全有理由相信，在不久的將來，它會給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來一次革命性的變化。,