補(bǔ)腎填精方促進(jìn)大鼠慢性難愈性創(chuàng)面修復(fù)愈合的作用及機(jī)制討論

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1、補(bǔ)腎填精方促進(jìn)大鼠慢性難愈性創(chuàng)面修復(fù)愈合的作用及機(jī)制討論 慢性難愈性創(chuàng)面是各種原因?qū)е碌木植拷M織缺損，創(chuàng)面難以愈合，且愈合后極易復(fù)潰，少數(shù)有癌變可能。因其病程纏綿，難以治愈且消耗巨大，給患者造成很大的心理壓力，嚴(yán)重影響患者的身體狀況和生活質(zhì)量。因此，如何促進(jìn)慢性難愈性創(chuàng)面的早期愈合是當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重要課題之一，已引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。慢性難愈性創(chuàng)面是中醫(yī)外科常見(jiàn)病、多發(fā)病。闕華發(fā)教授現(xiàn)系上海中醫(yī)藥大學(xué)博士生導(dǎo)師，上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中醫(yī)外科主任，師從中醫(yī)外科名家唐漢鈞教授。闕華發(fā)教授在治療慢性難愈性創(chuàng)面方面，繼承了唐師“補(bǔ)虛化瘀法”的學(xué)術(shù)思想，臨證注重益氣健脾化瘀; 在此基礎(chǔ)上

2、又有所創(chuàng)新和發(fā)揮，認(rèn)為慢性難愈性創(chuàng)面病久氣血耗傷，精血同源，久病及腎，治療上亦十分注重補(bǔ)腎填精法的應(yīng)用，并自擬補(bǔ)腎填精方，驗(yàn)之于臨床，療效頗佳。本研究旨在通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)補(bǔ)腎填精方促進(jìn)慢性難愈性創(chuàng)面修復(fù)愈合的作用，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。1 材料與方法1. 1 實(shí)驗(yàn)材料1. 1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物52 只健康雄性SD 大鼠SPF 級(jí)，2月齡，體質(zhì)量200 250g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任提供( 動(dòng)物合格證號(hào): SCXK ( 滬) 2007 -0005) 。1. 1. 2 實(shí)驗(yàn)藥物補(bǔ)腎填精方由熟地黃、山萸肉、仙靈牌組成，劑量比例為4: 4: 5。根據(jù)中藥藥理研究方法學(xué)-“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人按體表面積

3、比等效劑量換算比率表”計(jì)算出人鼠等效劑量為3. 51g / ( kgd) 。中藥按傳統(tǒng)工藝制備成水煎劑，減壓濃縮至濃度為0. 351g /ml，放置于4冰箱備用( 由上海中醫(yī)藥大學(xué)龍華醫(yī)院中藥制劑室制備) 。1. 1. 3 主要實(shí)驗(yàn)試劑免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連接法( streptavidin -biotinperoxidasemethod，SP) 試劑盒，購(gòu)于美國(guó)Zymed 公司; EnVision試劑( 辣根過(guò)氧化物酶/抗兔，HRP /Rabbit) 即用型購(gòu)自丹麥Dako 公司; 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子( vascularendothelial growth factor，VEG

4、F) 一抗( 兔抗鼠，分別為1 100、1 50 稀釋) ，購(gòu)于美國(guó)SantaCruz 公司; 生物素標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白G ( immunoglobulinG，IgG) ，購(gòu)于德國(guó)Vector 公司; 鹽酸氯胺酮注射液購(gòu)于上海第一生化藥業(yè)公司; 注射用氫化可的松琥珀酸鈉( 50mg /支) 購(gòu)于天津市生物化學(xué)制藥廠。1. 1. 4 主要實(shí)驗(yàn)儀器切片機(jī)( 型號(hào): RM2145) ，購(gòu)于德國(guó)Lico 公司; 攝像機(jī)( 型號(hào): MV-CP410) ，購(gòu)于日本Panasonic 公司; 光學(xué)顯微鏡，購(gòu)于日本Olympus公司; BH2 數(shù)碼相機(jī)，購(gòu)于日本Nikon 公司;IMS 細(xì)胞圖像分析儀系統(tǒng)和

5、醫(yī)學(xué)圖像分析軟件，購(gòu)于上海申藤信息技術(shù)有限公司。1. 2 實(shí)驗(yàn)方法1. 2. 1 慢性難愈性創(chuàng)面大鼠模型建立大鼠在常規(guī)飼養(yǎng)1 周后，腹腔注射鹽酸氯胺酮( 150mg /kg 體質(zhì)量) 麻醉，在造模區(qū)( 腰椎正中偏上) 剃毛，用直徑2. 4cm 的瓶蓋在造模區(qū)標(biāo)記造模面積，無(wú)菌條件下，用外科方法做一深達(dá)筋膜的創(chuàng)面，建立全層皮膚缺損的開(kāi)放性創(chuàng)面模型。除正常對(duì)照組外，其余大鼠造模后即刻肌肉注射醋酸氫化可的松( 80mg /kg體質(zhì)量) ，制成難愈性創(chuàng)面模型，創(chuàng)面用一塊( 4層) 消毒干紗布加蓋后膠布“豐”字型固定。于手術(shù)前1 天開(kāi)始，每只大鼠后肢肌肉注射青霉素( 4000U/只) ，連續(xù)4 天，以預(yù)

6、防感染。大鼠分籠單獨(dú)飼養(yǎng)，自由進(jìn)水和飲食。1. 2. 2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥方法52 只大鼠分2 批進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。第一批25 只大鼠主要用于觀察補(bǔ)腎填精方對(duì)大鼠創(chuàng)面愈合率及創(chuàng)面愈合時(shí)間的影響。25 只大鼠先隨機(jī)抽取8 只為正常對(duì)照組，創(chuàng)面制作方法同前，其余17 只大鼠建立慢性難愈性創(chuàng)面模型，在成模后再隨機(jī)分為模型組( 9 只) 、補(bǔ)腎填精方組( 8 只) 。第2 批27 只大鼠主要用于探討補(bǔ)腎填精方促進(jìn)大鼠慢性難愈性創(chuàng)面修復(fù)愈合的機(jī)制。27 只大鼠先隨機(jī)抽取9 只為正常對(duì)照組，創(chuàng)面制作方法同前，其余18 只大鼠建立慢性難愈性創(chuàng)面模型，在成模后再隨機(jī)分為模型組( 9 只) 、補(bǔ)腎填精方組( 9只)

7、。各組均于造模后第2 天開(kāi)始灌胃給藥，正常對(duì)照組及模型組均予生理鹽水灌胃，2ml /次，補(bǔ)腎填精方組予中藥補(bǔ)腎填精方灌胃，2ml /次，實(shí)驗(yàn)各組均予一塊( 4 層) 生理鹽水紗布濕敷創(chuàng)面，1 次/日，換藥前均以1 5000 呋喃西林溶液清潔創(chuàng)面; 第2批大鼠連續(xù)用藥7 天后分別將動(dòng)物鹽酸氯胺酮麻醉處死，取局部創(chuàng)面新生肉芽組織，置于10% 的甲醛溶液，進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。1. 2. 3 創(chuàng)面愈合率的觀察第1 批25 只大鼠在用藥后第3、7、11、15 天用標(biāo)尺標(biāo)記、照相機(jī)拍攝創(chuàng)面，再用Image J 軟件計(jì)算創(chuàng)面面積。按下列公式計(jì)算創(chuàng)面愈合率: 創(chuàng)面愈合率= ( 原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積) /原始

8、創(chuàng)面面積×100%。1. 2. 4 創(chuàng)面愈合時(shí)間的觀察觀察25 只大鼠從創(chuàng)面用藥起到創(chuàng)面完全上皮化愈合所需的天數(shù)。1. 2. 5 VEGF 及微血管數(shù)的檢測(cè)1. 2. 5. 1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)VEGF 表達(dá)取出第2 批各組大鼠已用甲醛固定的肉芽組織標(biāo)本，分別常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片。取4μm 石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精至水; PBS 洗滌3 分鐘，3 次;將切片浸入0. 01mmol /L、pH 6. 0 檸檬酸鹽緩沖液中，微波3 檔( 約98) 20 分鐘熱誘導(dǎo)修復(fù)，室溫自然冷卻; PBS 洗3 分鐘，3 次; 0. 3% H2O2抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶20 分鐘，

9、室溫; PBS 洗3 分鐘，3次; 20%正常羊血清室溫孵育30 分鐘，不洗; 滴加VEGF 一抗( 分別為上述抗體及抗體稀釋度) ，在濕盒中37孵育2h; PBS 洗3 分鐘，3 次; EnVision 試劑( HRP /R) 37 孵育30 分鐘; PBS 洗3 分鐘，3次; DAB 顯色8 12 分鐘; 流水洗，蘇木素襯染色，熱水藍(lán)化; 吹干后，樹(shù)脂封片; 鏡下觀察，背景呈紫藍(lán)色，陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色或黃色。1. 2. 5. 1 圖像分析法分析VEGF 表達(dá)量及微血管數(shù)通過(guò)顯微鏡、圖像采集卡、數(shù)碼相機(jī)或CCD 攝像機(jī)采集數(shù)字圖像，數(shù)字圖像為標(biāo)準(zhǔn)的BMP ( 位圖)文件格式; 在250 倍光學(xué)

10、顯微鏡下，先點(diǎn)擊圖像中微尺上的兩個(gè)點(diǎn)，再將它的實(shí)際微米數(shù)輸入計(jì)算機(jī)，計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算得到比例因子后存儲(chǔ)備用; 去除免疫組化圖像中的紫藍(lán)色背景，選擇陰性區(qū)域，處理后用藍(lán)色表示; 選擇棕黃色或棕褐色陽(yáng)性區(qū)域，處理后有效陽(yáng)性區(qū)域用紅色表示; 測(cè)定免疫組化圖像中陽(yáng)性區(qū)域面積和陽(yáng)性比率以及光密度值; 每張切片至少分析3 個(gè)視野，求出3 個(gè)視野的平均值，計(jì)算VEGF 表達(dá)水平。每張石蠟切片，隨機(jī)選取肉芽組織區(qū)域的3 個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野的新生微血管( microvesselcount，MVC) ( 有完整管腔) ，每高倍視野0 5 個(gè)為( +) ，記為1 分; 6 10 個(gè)為( +) ，記為2 分; >

11、;10 個(gè)為( +) ，記為3 分; 計(jì)算每例平均積分。1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS13 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用x- ±s 表示，進(jìn)行多個(gè)樣本單因素方差分析比較組間差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 組間兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)方法) 。2 結(jié)果2. 1 創(chuàng)面愈合率在造模用藥后第3、7、11 天: 模型組創(chuàng)面愈合率均較正常對(duì)照組顯著降低( P<0. 01，P<0. 05) ; 補(bǔ)腎填精方組創(chuàng)面愈合率在各時(shí)間點(diǎn)均較模型組明顯提高( P<0. 01) ，與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P>0. 05) 。3 討論慢性難愈性創(chuàng)面屬祖國(guó)醫(yī)學(xué)“潰瘍”的范疇。中

12、醫(yī)學(xué)治療潰瘍，總結(jié)出了“腐祛肌生、肌平皮長(zhǎng)”的潰瘍愈合規(guī)律，重視潰瘍?cè)缙陟罡?，后期煨膿長(zhǎng)肉，但對(duì)于“腐”去“新肌”不生或難生等難題尚不能得到解決。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為潰瘍愈合，既和皮膚、肌肉及骨骼有直接聯(lián)系，又與氣血、臟腑的功能狀態(tài)密切相關(guān)。名老中醫(yī)唐漢鈞教授在長(zhǎng)期臨床實(shí)踐的基礎(chǔ)上，提出“虛”、“瘀”為慢性難愈性創(chuàng)面發(fā)生發(fā)展的根本原因，治療上突破“祛腐生肌”的傳統(tǒng)觀念，主張“補(bǔ)虛化瘀生肌”愈創(chuàng)新理論，臨證注重益氣健脾化瘀。闕華發(fā)教授在繼承唐師學(xué)術(shù)思想的基礎(chǔ)之上，同時(shí)結(jié)合自己多年的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為“腎為先天之本”，“腎主藏精”，“受五臟六腑之精而藏之”，“久病及腎”，慢性難愈性創(chuàng)面膿水淋漓不盡，病久則氣

13、血虧耗，精血同源，腎精亦虧; 病久不愈，臟氣受伐，五臟所傷，窮必及腎，先后天并損，元?dú)忸j廢，生化無(wú)源，正氣不復(fù)，不能充養(yǎng)四肢，故瘡面經(jīng)久不斂。臨床上慢性難愈性創(chuàng)面皮膚組織長(zhǎng)期缺損，多有瘡口下陷，膿液稀少，肉芽灰白或黯淡，瘡周皮膚色暗黑、板滯木硬，肌肉瘦削等形體不足之象。素問(wèn)陰陽(yáng)應(yīng)象大論云: “形不足者，溫之以氣，精不足者，補(bǔ)之以味。”張景岳亦云: “形體之本在精血治形必以精血為先?！惫赎I華發(fā)教授在慢性難愈性創(chuàng)面的治療上除重視益氣健脾化瘀法的運(yùn)用之外，亦十分注重補(bǔ)腎填精、溫補(bǔ)精血法的應(yīng)用，并自擬補(bǔ)腎填精方，應(yīng)用于臨床療效滿意。補(bǔ)腎填精方由熟地黃、山萸肉、仙靈脾組成，意在溫補(bǔ)精血、補(bǔ)益先天。方中熟

14、地黃味甘、性微溫，入肝、腎經(jīng)，具有滋陰補(bǔ)血、益精填髓之功，張景岳曾云: “熟地至靜之性，以至甘至厚之味，實(shí)精血形成中第一純厚之藥?！鄙捷侨?，味酸、澀，性微溫，歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)益肝腎、壯元?dú)?、秘精、益?yáng)道、添精髓等補(bǔ)益功能。醫(yī)學(xué)衷中參西錄云: “山萸肉，能收斂元?dú)?，振作精神，收斂之中兼?zhèn)錀l暢之性，故有通利九竅，流通血脈?！毕伸`脾，又名淫羊藿，味辛、甘，性溫，歸肝、腎經(jīng)，具有溫腎壯陽(yáng)、補(bǔ)氣益精、強(qiáng)身延年之功， 本草綱目記載: “淫羊藿，性溫不寒，能益精氣，真陽(yáng)不足者宜之。”現(xiàn)代藥理研究證實(shí): 熟地黃能激活纖溶酶原，抗血栓形成，并且能增強(qiáng)紅細(xì)胞的增殖和分化; 山萸肉對(duì)特異性免疫功能有增強(qiáng)作用，并能

15、增強(qiáng)血紅蛋白含量，抗缺氧，抑制血小板聚集的作用;仙靈脾能調(diào)節(jié)免疫功能，促進(jìn)蛋白質(zhì)和核酸合成，增加冠脈血流量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組與正常對(duì)照組比較，各時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面愈合率均顯著降低( P <0. 01，P <0. 05) ，愈合時(shí)間明顯延長(zhǎng)( P<0. 01) ，提示慢性難愈性創(chuàng)面造模成功; 補(bǔ)腎填精方組與模型組比較，各時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面愈合率顯著提高( P<0. 01) ，創(chuàng)面愈合時(shí)間明顯縮短( P<0. 01) ，提示補(bǔ)腎填精方有明顯促進(jìn)慢性難愈性創(chuàng)面愈合的作用。研究表明肉芽組織形成是創(chuàng)面修復(fù)愈合的關(guān)鍵步驟之一，可以直接影響創(chuàng)面的愈合程度及預(yù)后，而肉芽組織是由大量的毛

16、細(xì)血管及豐富的成纖維細(xì)胞組成，其中毛細(xì)血管的再生及血管網(wǎng)的形成起著十分T重要的作用，豐富的新生毛細(xì)血管網(wǎng)能充實(shí)肉芽組織，從而改善創(chuàng)面的微循環(huán)，為組織的修復(fù)提供必須的氧和豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而有利于創(chuàng)面的修復(fù)愈合。VEGF 是影響血管新生的關(guān)鍵生長(zhǎng)因子之一，其是一種作用最強(qiáng)，且唯一特異性所用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的促血管生成因子，可以直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，刺激其分裂增殖，誘導(dǎo)新生血管生成并影響微血管的量，從而促進(jìn)創(chuàng)面的修復(fù)愈合。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組VEGF 表達(dá)量和MVC 均顯著低于正常對(duì)照組( P<0. 01) ，說(shuō)明慢性難愈性創(chuàng)面生長(zhǎng)緩慢與創(chuàng)面組織VEGF 表達(dá)量減少，微血管生成受阻有密切關(guān)系; 補(bǔ)腎填精方組VEGF 表達(dá)量、MVC 均較模型組明顯升高( P<0. 01) ，由此提示補(bǔ)腎填精方通過(guò)上調(diào)慢性難愈性創(chuàng)面VEGF 表達(dá)，誘導(dǎo)血管新生，從而有效改善創(chuàng)面組織的缺血、缺氧狀態(tài)，促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)愈合。本研究為臨床上應(yīng)用補(bǔ)腎填精方治療慢性難愈性創(chuàng)面提供了科學(xué)可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，從而拓寬了慢性難愈性創(chuàng)面治療的途徑。