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1、第1課時大腸桿菌的培養(yǎng)和分離第一部分微生物的利用考試要求知識內(nèi)容考試屬性及要求考情解讀大腸桿菌的培養(yǎng)和分離加試1.進行大腸桿菌的擴增，利用液體培養(yǎng)基進行細菌培養(yǎng)的操作。2.進行大腸桿菌的分離，用固體平面培養(yǎng)基進行細菌的畫線培養(yǎng)。3.說明大腸桿菌培養(yǎng)的條件和實驗原理。一、微生物培養(yǎng)的基本條件二、大腸桿菌的培養(yǎng)與分離操作內(nèi)容索引當(dāng)堂檢測一、微生物培養(yǎng)的基本條件基礎(chǔ)梳理1.微生物基礎(chǔ)知識微生物基礎(chǔ)知識(1)微生物的特點： 簡單，形體 。通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細胞結(jié)構(gòu)。體內(nèi)一般不含葉綠素，不能進行光合作用。結(jié)構(gòu)微小(2)細菌的外形與大小外形分類球桿弧大小： 不分枝的 微生
2、物，細胞微小而透明。通常用適當(dāng)染料 后，再顯微鏡觀察。(3)細菌的繁殖：細菌以 的方式繁殖，分裂速度很快，約20分鐘分裂一次。單細胞原核染色分裂(4)菌落概念： 或 細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有 的子細胞群體，叫做菌落。(如圖)作用：細菌的菌落特征因種而異，菌落是 的重要依據(jù)。單個少數(shù)一定形態(tài)結(jié)構(gòu)鑒定菌種2.培養(yǎng)基的種類培養(yǎng)基的種類(1)按物理性質(zhì)分類種類是否含凝固劑用途 培養(yǎng)基是主要用于微生物的分離與鑒定等 培養(yǎng)基否主要用于擴大培養(yǎng)或工業(yè)生產(chǎn)固體液體(2)按培養(yǎng)基的用途分類種類制備方法用途 培養(yǎng)基 加入某種化學(xué)物質(zhì) 從眾多的微生物中 所需微生物 培養(yǎng)基加入某種試
3、劑 不同種類的微生物選擇鑒別分離鑒別3.無菌技術(shù)無菌技術(shù)(1)含義：無菌技術(shù)不僅能防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染，保持微生物的純培養(yǎng)，而且在分離、轉(zhuǎn)接時亦能防止其他微生物污染。(2)無菌操作對實驗空間、操作臺可用 或酒精消毒，操作者的手用 消毒。實驗用的培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)基一般用 法滅菌，接種環(huán)用灼燒方法滅菌。為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作應(yīng)在 附近進行。實驗操作時應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。紫外線酒精高壓蒸汽滅菌酒精燈火焰問題探究1.結(jié)合所學(xué)知識，完成下圖橫線上大腸桿菌的結(jié)構(gòu)名稱，然后思考：答案核糖體莢膜細胞壁質(zhì)膜擬核區(qū)(DNA)鞭毛答案(1)大腸桿菌與酵母菌
4、相比，在結(jié)構(gòu)上最主要的區(qū)別是什么？答案答案大腸桿菌是原核生物，與酵母菌相比，最主要的區(qū)別是沒有由核被膜包被的細胞核。(2)大腸桿菌是革蘭氏 性、 的腸道桿菌，在腸道中一般對人無害，但也有一些菌株對人體是有害的，可以侵襲 并產(chǎn)生毒素。但是，任何大腸桿菌如果進入人的 系統(tǒng)，都會對人體產(chǎn)生危害。(3)應(yīng)用：大腸桿菌是 技術(shù)中被廣泛采用的工具。陰兼性厭氧腸黏膜泌尿基因工程2.判斷下面培養(yǎng)基的各種成分能提供的營養(yǎng)物質(zhì)類別成分FeSO4蔗糖(NH4)2SO4維生素提供的營養(yǎng)_答案無機鹽碳源氮源生長因子小貼士小貼士(1)碳源的種類是判斷微生物同化作用類型的依據(jù)，能利用無機碳源的生物是自養(yǎng)型的，只能利用有機碳
5、源的生物是異養(yǎng)型的。含氮的有機物如蛋白質(zhì)既可作為氮源，也可作為碳源?！凹毦踩?，霉菌喜素”，細菌培養(yǎng)基要用蛋白胨和酵母提取物來配制。霉菌培養(yǎng)基一般用無機物配制或添加蔗糖的豆芽汁。(2)其他條件：在提供幾種主要營養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)基還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)及氧氣的要求。例如：培養(yǎng)乳酸桿菌時需要在培養(yǎng)基中添加維生素；培養(yǎng)霉菌時需要將培養(yǎng)基的pH調(diào)至中性偏酸；培養(yǎng)細菌時需要將pH調(diào)至中性或微堿性；培養(yǎng)厭氧型微生物時需要提供無氧的條件。3.比較消毒和滅菌的不同之處答案比較項目理化因素的作用強度消滅微生物的數(shù)量芽孢和孢子能否被消滅消毒_ 對人體有害的生活狀態(tài)的微生物_滅菌_ 微生物_較
6、為溫和強烈部分全部不能能小貼士小貼士(1)每個細菌細胞僅形成一個芽孢，故它無繁殖功能。芽孢有極強的抗熱、抗輻射、抗化學(xué)藥物和抗靜水壓的能力。芽孢的休眠能力十分驚人，可保持幾年到幾十年的生活力。(2)孢子是微生物產(chǎn)生的一種有繁殖或休眠作用的細胞。一般是單細胞，個體微小，通常是適應(yīng)于從不利環(huán)境條件中存活下來，并在條件改變時產(chǎn)生新的營養(yǎng)體，能直接發(fā)育成新個體。4.幾種消毒和滅菌方法及其適用范圍答案類型適用范圍操作方法消毒方法 法日常生活100 煮沸56 min 法不耐高溫的液體7075 煮30 min或80 煮15 min化學(xué)藥劑生物活體、水源等擦拭等，如用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源_房間、儀器設(shè)
7、備紫外線照射30 min煮沸消毒巴氏消毒紫外線滅菌方法灼燒 、接種時用的 或瓶口等直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒_ 、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿和金屬用具等物品放入干熱滅菌箱，160170 加熱12 h_培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿等，生產(chǎn)和實驗室常用高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，100 kPa，溫度121 ，1530 min過濾不耐高溫的物質(zhì)，如尿素、酶等G6玻璃砂漏斗過濾答案干熱滅菌高壓蒸汽滅菌接種工具試管口耐高溫活學(xué)活用1.下列關(guān)于大腸桿菌的表述，不正確的是A.其細胞質(zhì)中只有一種細胞器核糖體B.在有氧條件下進行需氧呼吸，無氧條件下進行厭氧呼吸C.除擬核外，在細胞質(zhì)中還有許多小的環(huán)狀DNA分子D.常作為基因工
8、程目的基因的受體菌答案2.連線無菌技術(shù)的方法、類型及對象答案二、大腸桿菌的培養(yǎng)與分離操作基礎(chǔ)梳理1.培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制我們一般用LB液體培養(yǎng)基來擴大培養(yǎng)大腸桿菌，培養(yǎng)后再在LB固體培養(yǎng)基上劃線進行分離。以下為本實驗中培養(yǎng)基配制步驟，請完成：(1)稱量： 。蛋白胨0.5 g，酵母提取物0.25 g，氯化鈉0.5 g，加水50 mL。(2)融化：加熱融化，用 定容到50 mL。配制LB固體培養(yǎng)基時還需加1 g ，整個過程不斷用玻棒攪拌，目的是_ 。(3)調(diào)pH：用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至 。準(zhǔn)確稱取各成分蒸餾水瓊脂防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂偏堿性(4)滅菌：在兩個250 mL的
9、三角瓶中分別裝入50 mL LB液體培養(yǎng)基和50 mL LB固體培養(yǎng)基，加上棉塞。將培養(yǎng)皿用牛皮紙包好，放入_ 內(nèi)，1 kg壓力滅菌15 min。滅菌鍋(5)倒平板：滅菌后，待固體培養(yǎng)基冷卻至 時在 附近進行操作。其過程(如下圖)是：將滅過菌的培養(yǎng)皿放在 ，右手拿裝有培養(yǎng)基的三角瓶，左手拔出棉塞；右手拿三角瓶，使三角瓶口_ ；用左手將培養(yǎng)皿打開一條稍大于三角瓶口的縫隙，右手將培養(yǎng)基 ，立刻蓋上皿蓋；待平板冷卻凝固后，將_ 。60 左右酒精燈火焰火焰旁迅速通過火焰倒入培養(yǎng)皿平板倒過來放置2.細菌的分離方法細菌的分離方法(1)劃線分離法：在液體培養(yǎng)基中，只要接種后培養(yǎng) h，每毫升培養(yǎng)基中就有幾億個
10、細菌?？捎?蘸取菌液在固體培養(yǎng)基上劃線，在劃線過程中接種環(huán)上的菌液逐漸 ，因此，劃線最后部分的細菌間的_ 加大。 將接種后的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)1020 h后，可由 產(chǎn)生 。如果再將每個菌落分別接種至含有固體培養(yǎng)基的試管斜面上， 在斜面上 ，則每個斜面的菌群就是由一個細菌產(chǎn)生的后代。這種方法也可用于_ ，將污染的 除去。8接種環(huán)減少距離一個細菌單菌落劃線分離細菌雜菌(2)涂布分離法：先將培養(yǎng)的菌液 ，通常稀釋 倍，然后取 mL稀釋度不同的稀釋液，加在培養(yǎng)皿的固體培養(yǎng)基上，用_涂布在培養(yǎng)基平面上，然后進行培養(yǎng)。在 的稀釋度下，可培養(yǎng)得到相互分開的菌落。通常以每個培養(yǎng)皿中有 個以內(nèi)的單菌落最為適合。(3
11、)兩種分離法的比較： 分離法，方法簡單； 分離法，單菌落更易分開，但操作復(fù)雜些。1051070.1玻璃刮刀適當(dāng)20劃線涂布稀釋3.大腸桿菌的培養(yǎng)和分離大腸桿菌的培養(yǎng)和分離(1)實驗內(nèi)容：將大腸桿菌擴大培養(yǎng)和劃線分離，即用 培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)大腸桿菌，培養(yǎng)后再在 培養(yǎng)基上劃線進行分離，隨后培養(yǎng)基上就會形成一個個單獨的菌落。(2)實驗步驟培養(yǎng)基滅菌_50 mL LB液體培養(yǎng)基和50 mL LB固體培養(yǎng)基及培養(yǎng)皿_ 滅菌將培養(yǎng)基分別倒入4個滅菌后的培養(yǎng)皿中，水平放置，使之形成平面高壓LB液體LB固體平面蒸汽倒平板在裝有液體培養(yǎng)基的 中接種大腸桿菌，培養(yǎng)12 h用接種環(huán)在接種有大腸桿菌的三角瓶中蘸菌液一次
12、，在固體培養(yǎng)基的平板上 ，蓋好培養(yǎng)皿培養(yǎng)皿倒置(蓋在下面)，放在37 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1224 h后，可看到劃線的末端出現(xiàn)不連續(xù)的_劃線分離培養(yǎng)觀察三角瓶連續(xù)劃線單個菌落接種問題探究1.固體培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，待培養(yǎng)基冷卻到60 時，需擱置斜面(圖甲)或倒平板(圖乙)，請回答：答案(1)如何確定制備的培養(yǎng)基滅菌是否合格？答案答案將未接種的培養(yǎng)基在適宜的溫度下放置一定時間，觀察培養(yǎng)基上是否有菌產(chǎn)生。(2)在固體培養(yǎng)基凝固前擱置斜面的目的是什么？答案答案增大接種面積。(3)平板冷凝后，為什么要將平板倒置？答案答案平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以
13、使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。答案2.某同學(xué)在純化土壤中的細菌時，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基上的菌落連成了一片，最可能的原因是什么？應(yīng)當(dāng)怎樣操作才可避免此種現(xiàn)象？答案答案最可能的原因是菌液濃度過高或劃線時在劃下一區(qū)域前未將接種環(huán)灼燒滅菌；采取的措施是增大稀釋倍數(shù)或每次劃新區(qū)域前先將接種環(huán)灼燒滅菌。答案活學(xué)活用3.以下接種、分離操作中，正確的是A.接種前，在火焰上燒紅了的接種環(huán)，應(yīng)先冷卻再取菌體B.劃線分離時，應(yīng)間斷式劃線C.接種環(huán)可在菌液中多次蘸液D.菌體放入三角瓶的液體培養(yǎng)基中后，三角瓶的封口膜需重新制作答案解析解析解析劃線分離時的劃線一定要是連續(xù)的；接種時，接種
14、環(huán)只能在菌液中蘸取一次，否則會污染菌液；三角瓶的封口膜不需要重新制作，用剛?cè)∠碌募纯伞?.請結(jié)合圖示，回答下列有關(guān)大腸桿菌分離與純化的問題：(1)稀釋用1 mL無菌吸管吸取1 mL大腸桿菌培養(yǎng)液，加入到盛有9 mL 的大試管中，充分混勻，稀釋 倍；按照同樣的方法依次進行稀釋制成101、102、103、104、105、106系列稀釋度的大腸桿菌稀釋液。答案無菌水10(2)劃線或涂布劃線分離法a.操作：在 旁，左手拿培養(yǎng)皿，右手拿接種環(huán)，挑取大腸桿菌培養(yǎng)液在平板上劃線。 b.劃線方法： 劃線和 劃線。答案酒精燈火焰平行連續(xù)c.平行劃線時，第一次劃線及每次劃線之間都要灼燒接種環(huán)，劃線結(jié)束后也要灼燒接
15、種環(huán)，目的分別是什么？答案答案如表所示 第一次灼燒每次劃線之前灼燒劃線結(jié)束時灼燒目的殺死接種環(huán)上原有的微生物殺死上次劃線后接種環(huán)上殘留的菌種，使下次劃線的菌種直接來源于上次劃線的末端，使每次劃線后菌種數(shù)目減少殺死接種環(huán)上殘存的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者答案涂布分離法a.將 浸在盛有酒精的燒杯中。b.取不超過0.1 mL的 ，滴加到培養(yǎng)基表面。c.將蘸有少量酒精的玻璃刮刀在火焰上引燃，待酒精燃盡后，冷卻810 s。d.用玻璃刮刀將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時可轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使菌液分布均勻。答案玻璃刮刀菌液答案(3)培養(yǎng)：將接種的平板 于培養(yǎng)箱或溫室中37 培養(yǎng)1224 h。倒置一題多
16、變一題多變判斷正誤：(1)大腸桿菌是革蘭氏陰性菌，對人無害( )(2)擴大培養(yǎng)大腸桿菌常用LB液體培養(yǎng)基( )(3)利用涂布分離法分離細菌時，需要先將培養(yǎng)的菌液進行梯度稀釋( )(4)在“大腸桿菌的培養(yǎng)和分離”實驗中所用棉花為脫脂棉( )答案答案(5)下圖中甲為劃線分離法中最重要的環(huán)節(jié)，乙為操作的結(jié)果每一次劃線后都要將接種環(huán)灼燒( )除第一次劃線外，每一次劃線的起點都是第一次劃線的末端( )課堂小結(jié)劃線分離涂布分離滅菌當(dāng)堂檢測1.劃線分離法和涂布分離法是接種微生物的兩種常用方法，下列描述正確的是A.都要將菌液進行一系列的梯度稀釋B.劃線分離法是將不同稀釋度的菌液通過接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面連 續(xù)
17、劃線的操作C.涂布分離法是將不同稀釋度的菌液倒入液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)D.都能在培養(yǎng)基表面形成單個菌落23451答案解析解析解析劃線分離法不需要進行梯度稀釋；劃線分離法是通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面；涂布分離法需要將不同稀釋度的菌液涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面；劃線分離法和涂布分離法都能在培養(yǎng)基表面形成單個菌落。234512.下圖為實驗室培養(yǎng)和純化大腸桿菌過程中的部分操作步驟，下列說法錯誤的是A.步驟操作時需要在酒精燈火焰旁進行B.步驟中，待倒入的培養(yǎng)基冷卻后蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋C.步驟中，每次劃線前都需對接種環(huán)進行灼燒處理D.劃線接種結(jié)束后，將圖
18、平板倒置后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)答案解析2341523415解析解析由圖可知，步驟是倒平板，步驟是用接種環(huán)蘸取菌液，步驟是進行平板劃線，步驟是培養(yǎng)。步驟操作時需要在酒精燈火焰旁進行，防止被雜菌污染，A項正確；倒完平板后應(yīng)立即蓋上培養(yǎng)皿蓋，冷卻后將平板倒過來放置，B項錯誤；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到單菌落，C項正確；劃線接種結(jié)束后，將平板倒置后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，有利于培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)和防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基造成污染，D項正確。3.在
19、劃線分離法操作中，錯誤的是A.將接種環(huán)放在酒精燈火焰上灼燒，直到接種環(huán)燒紅B.將燒紅的接種環(huán)在酒精燈火焰旁邊冷卻C.接種環(huán)在平板上的劃線位置是隨機的D.在蘸取菌種前和接種完畢后均要將試管口通過火焰答案解析23415解析解析接種環(huán)灼燒及接種前后試管口要通過火焰，其目的是為了防止雜菌污染，將接種環(huán)先冷卻再接種可以避免高溫燙死菌種，因此A、B、D都是正確的；在平板上劃線時，要劃三至五條平行線，而不是隨機劃線，因此C選項錯誤。4.下列關(guān)于消毒和滅菌的理解，不正確的是A.滅菌是指殺滅環(huán)境中的一切微生物的細胞、芽孢和孢子B.消毒和滅菌實質(zhì)上是完全相同的C.接種環(huán)用灼燒法滅菌D.常用的滅菌方法有灼燒法、干熱
20、滅菌法和高壓蒸汽滅菌法解析解析消毒是使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或其中一部分對人體有害的微生物，不包括芽孢和孢子。滅菌則是使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。解析2341答案55.(1)在大腸桿菌培養(yǎng)過程中，除考慮營養(yǎng)條件外，還要考慮 、 和滲透壓等條件。(2)在微生物培養(yǎng)操作過程中，為防止雜菌污染，需對培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿進行 處理(消毒、滅菌)；操作者的雙手需要進行清洗和 ；靜止空氣中的細菌可用紫外線殺滅，其原因是紫外線能使蛋白質(zhì)變性，還能 。(3)若用涂布分離法計數(shù)大腸桿菌活菌的個數(shù)，要想使所得估計值更接近實際值，除應(yīng)嚴(yán)格操作、多次重復(fù)外，還應(yīng)保證待測樣品稀釋的 。答案23415溫度酸堿度滅菌消毒損傷DNA的結(jié)構(gòu)比例合適(4)通常，對獲得的純菌種還可以依據(jù)菌落的形狀、大小等菌落特征對細菌進行初步的 。(5)培養(yǎng)大腸桿菌時，在接種前需要檢測培養(yǎng)基是否被污染。對于固體培養(yǎng)基應(yīng)采用的檢測方法是_。(6)若用大腸桿菌進行實驗，使用過的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物必須經(jīng)過 處理后才能丟棄，以防止培養(yǎng)物的擴散。答案23415鑒定(或分類)將未接種的培養(yǎng)基在適宜的溫度下放置適宜的時間，觀察培養(yǎng)基上是否有菌落產(chǎn)生滅菌
生物 第一部分 微生物的利用 第1課時 大腸桿菌的培養(yǎng)和分離同步備課 浙科版選修1
