科研論文 (2)

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1、硼酸鹽對(duì)馬鈴薯干腐病菌的抑制特性研究 學(xué)生科研訓(xùn)練計(jì)劃(SRTP)項(xiàng)目論文項(xiàng)目名稱:培養(yǎng)條件對(duì)馬鈴薯干腐病菌細(xì)胞壁降解酶的影響 主 持 人: 李夏妮 所在學(xué)院: 食品科學(xué)與工程學(xué)院 專業(yè)年級(jí): 生物工程08級(jí) 指導(dǎo)教師: 李永才 副教授 學(xué)生科研訓(xùn)練計(jì)劃(SRTP)項(xiàng)目管理辦公室二一二年四月 目錄前言21 材料與方法31.1 材料31.2 方法31.2.1培養(yǎng)基制作31.2.2制作標(biāo)準(zhǔn)曲線31.2.3酶液的制備31.2.4 PG(多聚半乳糖醛酸酶)的測(cè)定41.2.5 PMG(果膠甲基半乳糖醛酸酶 )的測(cè)定41.2.6 Cx(纖維素酶)的測(cè)定41.2.7-葡萄糖苷酶的測(cè)定41.2.8結(jié)果統(tǒng)計(jì)42

2、 結(jié)果與分析42.1 PH值對(duì)馬鈴薯干腐病菌細(xì)胞壁降解酶的影響42.1.1 PH對(duì)PG(多聚半乳糖醛酸酶)活性的影響52.1.2 PH對(duì)PMG(果膠甲基半乳糖醛酸酶)活性的影響52.1.3 PH對(duì)Cx(纖維素酶)活性的影響62.1.4 PH對(duì)-葡萄糖苷酶活性的影響62.2培養(yǎng)時(shí)間對(duì)馬鈴薯干腐病菌細(xì)胞壁降解酶的影響72.2.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)PG(多聚半乳糖醛酸酶)活性的影響72.2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)PMG(果膠甲基半乳糖醛酸酶)活性的影響72.2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Cx(纖維素酶)活性的影響82.2.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)-葡萄糖苷酶活性的影響82.3 培養(yǎng)溫度對(duì)馬鈴薯干腐病菌細(xì)胞壁降解酶的影響92.3.1 培

3、養(yǎng)溫度對(duì)PG(多聚半乳糖醛酸酶)活性的影響92.3.2 培養(yǎng)溫度對(duì)PMG(果膠甲基半乳糖醛酸酶)活性的影響92.3.3 培養(yǎng)溫度對(duì)Cx(纖維素酶)活性的影響102.3.4培養(yǎng)溫度對(duì)-葡萄糖苷酶活性的影響103 討論114 結(jié)論11參考文獻(xiàn)12培養(yǎng)條件對(duì)馬鈴薯干腐病菌細(xì)胞壁降解酶影響的研究李夏妮(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 蘭州 730070)摘要:本文通過體外試驗(yàn),研究了不同培養(yǎng)條件(溫度、pH)和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)馬鈴薯干腐病菌主要細(xì)胞壁降解酶活性的影響。結(jié)果表明,不同培養(yǎng)條件及時(shí)間對(duì)馬鈴薯干腐病菌細(xì)胞壁降解酶具有一定的影響。除-葡萄糖苷酶(最佳 pH 8)外,多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果膠甲基

4、半乳糖醛酸酶(PMG)和纖維素酶(Cx)均在pH 6 的條件下活性最高;對(duì)溫度而言,各種細(xì)胞壁降解酶在23-25 下活性最高,低溫對(duì)具有抑制作用;PG、PMG和Cx均在培養(yǎng)前期(第2d)活性最大,而-葡萄糖苷酶在培養(yǎng)3d時(shí)活性最大,各種酶隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)其活性均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。 因此可通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件來抑制病原物的主要致病因子細(xì)胞壁降解酶的活性,從而有效地控制馬鈴薯塊莖干腐病。關(guān)鍵詞:馬鈴薯;硫色鐮刀菌;細(xì)胞壁降解酶;培養(yǎng)條件前言馬鈴薯是我國(guó)北方的重要經(jīng)濟(jì)作物,甘肅省作為我國(guó)馬鈴薯生產(chǎn)的最佳適宜區(qū)之一,目前全省馬鈴薯種植面積擴(kuò)大到746萬(wàn)畝,居內(nèi)蒙古自治區(qū)之后,列全國(guó)第二;總產(chǎn)量達(dá)到755萬(wàn)

5、噸,居全國(guó)第一1。馬鈴薯的種植、發(fā)展越來越引起人們的重視。但是近年來,馬鈴薯貯藏期腐爛問題也日漸突出。據(jù)調(diào)查造成爛窖的主要原因是塊莖攜帶病菌。雖然馬鈴薯塊莖病害有15多種,但是其中Fusarium solani和晚疫病復(fù)合侵染或Fusarium solani誘發(fā)侵染是導(dǎo)致爛窖的主體,有調(diào)查顯示,馬鈴薯貯藏期間,平均病薯率為27.59%,其中88.5%為黑色干腐病型病薯2。最終導(dǎo)致馬鈴薯減產(chǎn)和商品性降低,對(duì)生產(chǎn)者造成極大的損失。干腐病又名“干腐爛”,染病塊莖長(zhǎng)白色至灰色絨毛物,內(nèi)部薯肉則呈灰褐色至深褐色病變,有的出現(xiàn)空心,空腔內(nèi)充滿菌絲體,嚴(yán)重時(shí)整個(gè)塊莖僵縮或呈干腐狀,不能食用3。干腐病是由鐮刀

6、菌(Fusarium spp.)4所致病的。干腐病是限制馬鈴薯產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的主要采后病害之一,貯藏期間其發(fā)病率高達(dá)30%。目前主要利用化學(xué)殺菌劑進(jìn)行控制,然而化學(xué)殺菌劑的大量使用不僅會(huì)產(chǎn)生環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等問題,也會(huì)導(dǎo)致病原物產(chǎn)生抗藥性,導(dǎo)致了抗藥菌株的產(chǎn)生,使其使用受到越來越多的限制,因而,必須尋求新的安全高效的防腐劑,以逐步取代和減少化學(xué)殺菌劑使用5。病原物產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶(果膠甲酯酶、多聚半乳糖醛酸酶等多種細(xì)胞壁降解酶)在侵入和定殖寄主組織中產(chǎn)生了重要作用,是其主要的致病因子之一6。研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)條件對(duì)酶的產(chǎn)生及活性具有一定的影響,故而本試驗(yàn)以馬鈴薯干腐病菌(Fusarium sulph

7、ureum)為研究對(duì)象,系統(tǒng)研究培養(yǎng)條件(溫度,pH等)對(duì)馬鈴薯干腐病菌(F. sulphureum)產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶種類、活性的影響。進(jìn)而了解不同培養(yǎng)條件下馬鈴薯干腐病菌細(xì)胞壁降解酶產(chǎn)生的情況,對(duì)有的放矢的進(jìn)行病害控制具有十分重要的意義。本研究通過體外試驗(yàn),研究培養(yǎng)條件(溫度,pH)和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)馬鈴薯干腐病菌主要細(xì)胞壁降解酶產(chǎn)生的影響,以期為馬鈴薯干腐病的防治提供新的方法。1 材料與方法 1.1 材料馬鈴薯干腐病菌(Fusarium sulphureum ) 超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD)、恒溫培養(yǎng)搖床(THZ-100)、電冰箱(BCD-196TX)、分光光度計(jì)(UV-2450)、巴氏滅

8、菌鍋(YX-280B)、恒溫水浴鍋(HWS24)、烘箱、電磁爐 1.2 方法1.2.1培養(yǎng)基制作參照方中達(dá) 9法進(jìn)行。制作馬鈴薯水瓊脂培養(yǎng)基(PDB),培養(yǎng)基成分:馬鈴薯250g,蒸餾水1000mL。將馬鈴薯切碎,大約1cm的小方塊,加水煮沸30min后用四層紗布過濾并定容至1000mL。分裝在三角瓶(每個(gè)三角瓶瓶子裝100mL培養(yǎng)基)中進(jìn)行高壓滅菌。滅菌后制備平板PDB。1.2.2 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線配置一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液,按照3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定還原糖的方法,在540nm 處測(cè)定吸光度值,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.2.3 酶液的制備將培養(yǎng)的5個(gè)硫色鐮刀菌菌柄擴(kuò)于100mL經(jīng)滅

9、菌后的培養(yǎng)基中在三角瓶中進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)數(shù)天后將三角瓶中培養(yǎng)的菌培養(yǎng)液真空抽濾,置濾液于離心管中離心10min備用。1.2.4多聚半乳糖醛酸酶(PG)的測(cè)定取兩只具塞刻度試管,每只試管中都分別加入1.0mL50mmol/L,PH5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液和0.5mL10g/L的 PG溶液,往其中一只試管中加0.5mL酶液,另一只試管中加0.5mL蒸餾水作為對(duì)照,混勻后置于37水浴中保溫反應(yīng)1h。保溫后,迅速加入1.5mLDNS,在沸水浴中加熱5min,然后迅速冷卻至室溫,加8mL蒸餾水稀釋,混勻。在波長(zhǎng)540nm處按照與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法比色,測(cè)定各試管中溶液的吸光度值。重復(fù)三次。 1.2.5 果

10、膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)的測(cè)定取兩只具塞刻度試管,每只試管中都分別加入1.0mL50mmol/L,PH5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液和0.5mL10g/L的果膠溶液,往其中一只試管中加0.5mL酶液,另一只試管中加0.5mL蒸餾水作為對(duì)照,混勻后置于37水浴中保溫反應(yīng)1h。保溫后,迅速加入1.5mLDNS,在沸水浴中加熱5min,然后迅速冷卻至室溫,加8mL蒸餾水稀釋,混勻。在波長(zhǎng)540nm處按照與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法比色,測(cè)定各試管中溶液的吸光度值。重復(fù)三次。 1.2.6纖維素酶(Cx)的測(cè)定取兩只具塞刻度試管,每只試管中都分別加入1.5mL10g/L的CMC(羧甲基纖維素)溶液,往其中一只試管

11、中加0.5mL酶液,另一只試管中加0.5mL蒸餾水作為對(duì)照,混勻后置于37水浴中保溫反應(yīng)1h。保溫后,迅速加入1.5mLDNS,在沸水浴中加熱5min,然后迅速冷卻至室溫,加8mL蒸餾水稀釋,混勻。在波長(zhǎng)540nm處按照與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法比色,測(cè)定各試管中溶液的吸光度值。重復(fù)三次。 1.2.7 -葡萄糖苷酶的測(cè)定取兩只具塞刻度試管,每只試管中都分別加入1.5mL10g/L的水楊苷溶液,往其中一只試管中加0.5mL酶液,另一只試管中加0.5mL蒸餾水作為對(duì)照,混勻后置于37水浴中保溫反應(yīng)1h。保溫后,迅速加入1.5mLDNS,在沸水浴中加熱5min,然后迅速冷卻至室溫,加8mL蒸餾水稀釋,混勻

12、。在波長(zhǎng)540nm處按照與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法比色,測(cè)定各試管中溶液的吸光度值。重復(fù)三次1.2.8結(jié)果統(tǒng)計(jì) 所有數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)并作圖。2 結(jié)果與分析2.1 pH值對(duì)馬鈴薯干腐病菌細(xì)胞壁降解酶的影響2.1.1 pH對(duì)PG活性的影響圖1 不同pH對(duì)F. sulphureum PG 酶活性的影響由圖1可見,不同pH的培養(yǎng)液對(duì)F. sulphureum PG活性的影響存在差異,其中pH為6時(shí)其活性最大,pH為8時(shí)PG活性最低。當(dāng)pH大于6時(shí),其活性呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢(shì)。2.1.2 PH對(duì)PMG活性的影響圖2 不同pH對(duì)F. sulphureum PMG 酶活

13、性的影響由圖2可見,不同pH的培養(yǎng)液對(duì)F. sulphureum PMG活性表現(xiàn)出不同的影響,當(dāng)pH大于6時(shí),其活性呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢(shì),其中pH為6時(shí),PMG活性最大,pH為8時(shí)PMG(果膠甲基半乳糖醛酸酶)活性最低。2.1.3 PH對(duì)Cx活性的影響圖3 不同pH對(duì)F. sulphureum Cx 酶活性的影響由圖3可見,不同pH的培養(yǎng)液對(duì)F. sulphureum Cx活性表現(xiàn)出不同的影響,隨著pH的增加,呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),其中pH為6時(shí),Cx活性最大, pH為8時(shí)Cx活性最低。2.1.4 PH對(duì)-葡萄糖苷酶活性的影響圖4 不同pH對(duì)F. sulphureum -葡萄糖苷酶活性的影

14、響由圖4可見,不同pH的培養(yǎng)液對(duì)F. sulphureum-葡萄糖苷酶活性表現(xiàn)出不同的影響,隨著pH的增加,呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),其中pH為8時(shí),-葡萄糖苷酶活性最大, pH為5時(shí)-葡萄糖苷酶活性最低。2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)馬鈴薯干腐病菌細(xì)胞壁降解酶的影響2.2.1培養(yǎng)時(shí)間對(duì)PG活性的影響圖5 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)F. sulphureum PG 酶活性的影響由圖5可見不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)F. sulphureum PG活性的影響存在差異,其中2d時(shí)其活性最大,培養(yǎng)時(shí)間為5d時(shí)PG活性最低。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間大于6天時(shí)PG活性基本保持在0.16mg/min.mL左右,其活性呈現(xiàn)先上升后降低后上升的趨勢(shì)。2.2.2

15、培養(yǎng)時(shí)間對(duì)PMG活性的影響圖6 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)F. sulphureum PMG 酶活性的影響由圖6可見不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)F. sulphureum PMG活性的影響存在差異,其中2d時(shí)其活性最大,培養(yǎng)時(shí)間為5d時(shí)PMG活性最低。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間大于6天時(shí)PMG活性基本保持在0.17mg/min.mL左右,其活性呈現(xiàn)先上升后降低后上升的趨勢(shì)。2.2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Cx活性的影響圖7不同p培養(yǎng)時(shí)間對(duì)F. sulphureum Cx 酶活性的影響917d養(yǎng)時(shí)間ANGSHIJIAN由圖7可見不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)F. sulphureum Cx活性的影響存在差異,其中2d時(shí)其活性最大,培養(yǎng)時(shí)間為8d時(shí)Cx活性最低。當(dāng)

16、培養(yǎng)時(shí)間大于5天時(shí)Cx活性基本保持在0.129mg/min.mL左右,其活性呈現(xiàn)先上升后降低后上升的趨勢(shì)。2.2.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)-葡萄糖苷酶活性的影響圖8 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)F. sulphureum -葡萄糖苷酶活性的影響由圖8可見不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)F. sulphureum -葡萄糖苷酶活性的影響存在差異,其中3d時(shí)其活性最大,培養(yǎng)時(shí)間為5d時(shí)-葡萄糖苷酶活性最低。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間大于6天時(shí)-葡萄糖苷酶活性基本保持在0.130mg/min.mL左右。2.3培養(yǎng)溫度對(duì)馬鈴薯干腐病菌細(xì)胞壁降解酶的影2.3.1 培養(yǎng)溫度對(duì)PG活性的影響圖9 不同培養(yǎng)溫度對(duì)F. sulphureum PG 酶活性的影響由圖9可

17、見,不同培養(yǎng)溫度對(duì)F. sulphureum PG活性表現(xiàn)出不同的影響,當(dāng)溫度高于25時(shí),其活性呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢(shì),在溫度為25時(shí),PG活性最大,在溫度為20時(shí),PG活性最低。2.3.2 培養(yǎng)溫度對(duì)PMG活性的影響圖10 不同培養(yǎng)溫度對(duì)F. sulphureum PMG 酶活性的影響由圖10可見,不同培養(yǎng)溫度對(duì)F. sulphureum PMG活性表現(xiàn)出不同的影響,當(dāng)溫度高于25時(shí),其活性呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢(shì),在溫度為25時(shí),PMG活性最大,在溫度為20時(shí),PMG活性最低。2.3.3 培養(yǎng)溫度對(duì)Cx活性的影響圖11 不同培養(yǎng)溫度對(duì)F. sulphureum Cx 酶活性的影響由圖11可見

18、,不同培養(yǎng)溫度對(duì)F. sulphureum Cx 酶活性表現(xiàn)出不同的影響。隨著培養(yǎng)溫度的升高,其活性呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢(shì),在溫度為25時(shí),Cx 酶活性最大,在溫度為20時(shí),Cx 酶活性最低。2.3.4 培養(yǎng)溫度對(duì)-葡萄糖苷酶活性的影響圖12不同培養(yǎng)溫度對(duì)F. sulphureum -葡萄糖苷酶活性的影響由圖12可見,不同培養(yǎng)溫度對(duì)F. sulphureum-葡萄糖苷酶活性表現(xiàn)出不同的影響,當(dāng)溫度高于25時(shí),其活性基本不變(約為0.153mg/min.mL),在溫度為25時(shí),-葡萄糖苷酶活性最大,在溫度為23時(shí),-葡萄糖苷酶活性最低。3 討論本試驗(yàn)通過控制培養(yǎng)條件(溫度、PH)和培養(yǎng)時(shí)間來有效

19、的控制馬鈴薯由硫色鐮刀菌引起的腐爛,保持莖塊的品質(zhì)包括對(duì)馬鈴薯病害的控制。據(jù)報(bào)道,研究發(fā)現(xiàn),由植物病原菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶在病菌致病過程中起重要作用,隨胞壁降解酶濃度增加,酶浸解能力增強(qiáng),兩者呈顯著的正相關(guān)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)及貯藏條件對(duì)酶的產(chǎn)生及活性具有一定的影響,但關(guān)于培養(yǎng)條件(溫度, pH)對(duì)馬鈴薯干腐病菌(Fusarium sulphureum)細(xì)胞壁降解酶產(chǎn)生和活性的影響尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)中培養(yǎng)條件(溫度、時(shí)間、pH)可以有效抑制硫色鐮刀菌(F. sulphureum Schlechlendahl)生長(zhǎng),在對(duì)硫色鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶活性的抑制上有顯著的效果。實(shí)驗(yàn)表明:(1)在

20、pH為8、培養(yǎng)時(shí)間為5d、溫度為20時(shí)對(duì)PG抑制作用最顯著:(2)在pH為8、培養(yǎng)時(shí)間為5d、溫度為20時(shí)對(duì)PMG的抑制作用最顯著;(3)在pH為8、培養(yǎng)時(shí)間為8d、溫度為20時(shí)對(duì)Cx抑制作用最顯著;(4)在pH為5、培養(yǎng)時(shí)間為5d、溫度為23時(shí)對(duì)-葡萄糖苷酶的抑制作用最顯著。故而可通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件來抑制病原物的生長(zhǎng)從而有效地控制馬鈴薯干腐病,可見培養(yǎng)條件抑菌在馬鈴薯干腐病菌控制中具有良好的應(yīng)前景。 隨科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步,細(xì)胞壁降解酶的作用機(jī)制應(yīng)該可以明確,這可為研究病菌致病的分子機(jī)制及新的病害控制措施奠定基礎(chǔ)。4 結(jié)論本試驗(yàn)通過研究培養(yǎng)條件(溫度、PH)和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)硫色鐮刀菌(F. sul

21、phureum)細(xì)胞壁降解酶活性的影響,結(jié)果表明:4.1 pH為6,溫度為23,培養(yǎng)2d時(shí)PG的活性最大,而pH為8,溫度為20,培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至5d時(shí),其酶活性顯著被抑制。4.2 pH為6,溫度為25,培養(yǎng)2d為PMG產(chǎn)生和活性被激活最佳的條件,而pH為8,溫度為20,培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至5d時(shí),其酶活性最低。4.3 Cx產(chǎn)生和活性被激活最佳的條件pH為6,溫度為25,培養(yǎng)時(shí)間2d,而pH為8,溫度為20,培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至8d時(shí),其酶活性最低。4.4 -葡萄糖苷酶活性最大的培養(yǎng)條件和時(shí)間為:pH為8,溫度為25,培養(yǎng)時(shí)間3d,而pH為5,溫度為23,培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至5d時(shí),其酶活性顯著被抑制。參考文獻(xiàn)1

22、 趙永平, 韓建民.甘肅馬鈴薯產(chǎn)業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力分析J. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 40(2): 250-255.2 何蘇琴, 金秀琳, 魏周全等. 甘肅省定西地區(qū)馬鈴薯塊莖干腐病病原真菌的分鑒定J. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 5(19):550-5523 張維一, 畢陽(yáng). 果蔬采后病害與控制M. 北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 19964 葉琪明, 王拱辰. 浙江馬鈴薯干腐病病原研究初報(bào)J. 植物病理學(xué)報(bào), 1994, 25:1485 葛永紅, 畢陽(yáng), 楊冬梅. 誘抗劑處理對(duì)“銀帝”甜瓜采后粉霉病和黑斑病的抑制效果J. 食品科學(xué), 2006, 27(1):246-2496 張紅,徐敬友.細(xì)胞壁降

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