分光光度法血糖實習(xí)ppt課件

p31實驗四 分光光度技術(shù)與 葡萄糖氧化酶法測定血糖,1,一、分光光度法,分光光度法是根據(jù)不同物質(zhì)對于不同 波長的光波具有選擇性吸收的光學(xué)特性，建立起來的分析方法。,（一）分光光度法的依據(jù),2,I0,It,溶液,當(dāng)一定波長的光線通過某種透明介質(zhì)時， 其中一部分光可透過，一部分光被吸收，這種某種溶液對一定波長的光的吸收特性可用于該物質(zhì)的定性和定量分析。,3,分光光度計可獲得單色光,分光光度計利用棱鏡或光柵取得波長范圍 為幾個nm甚至更窄的單色光。,4,測定的時候需選擇不同物質(zhì) 最大吸收峰所對應(yīng)的波長,波長（nm ）,光 吸 收 值,最大吸收峰,5,分光光度計的優(yōu)點,分光光度法的靈敏度、準(zhǔn)確度及選擇性 都很高，是一種最常用的靈敏、精確、 快速和簡便的分析方法。,6,不同分光光度計的波長范圍,紫外光(200-400nm) 可見光(400-760nm) 紅外光(760nm-30m),7,（二）分光光度法原理,Lambert-beer定律，該定律闡明了溶液對單色光吸收的多少與溶液濃度及液層厚度的乘積成正比關(guān)系。,8,I0,It,lg,：光密度（O.D.），或稱吸光度（A）,I0,：入射光強度,It,：透過光強度,K,：吸光系數(shù)，它與該物質(zhì)吸收光能力有關(guān),9,（三）分光光度法計算待測溶液濃度的方法,1、利用標(biāo)準(zhǔn)溶液測定溶液的濃度,10,2、利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求得待測溶液的濃度,標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作： 先配制一系列已知不同濃度的測定物標(biāo)準(zhǔn)溶液，按測定管顯色，分別讀取各管光密度，以各管光密度為縱坐標(biāo)，各管濃度為橫坐標(biāo)，作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。,11,濃度,吸 光 度,以測定管的光密度從標(biāo)準(zhǔn) 曲線上可求得測定物濃度,12,（四）分光光度計的基本結(jié)構(gòu),1、光源 2、單色光器 3、吸收杯（比色杯） 4、檢流計（測光系統(tǒng)）,13,752型分光光度計,1）A/T/C/F切換鍵 2）SD鍵具2個功能。傳輸數(shù)據(jù)；確認(rèn)當(dāng)前的F值。 3）/0%調(diào)T為000.0。 4)/100%調(diào)T 為100.0。轉(zhuǎn)換至A時，按鍵后顯示0.000。,14,（五）操作規(guī)程,1. 插上電源，打開電源開關(guān)預(yù)熱30min。 2. 將波長旋鈕旋至所需波長。 3. 將樣品倒入比色皿放入比色皿架，空白管進入光路，按A/T/C/F鍵至光標(biāo)于T位，開蓋按/0%鍵使讀數(shù)顯示000.0。關(guān)蓋，再按/100%鍵使讀數(shù)顯示100.0。按A/T/C/F鍵至光標(biāo)于A位，再按/100%顯示0.000。拉出樣品管進入光路讀A。 4. 測定結(jié)束打開樣品室蓋。 5. 取出比色皿清洗干凈后用蒸餾水沖洗并倒扣在粗濾紙上晾干。,15,實驗?zāi)康?了解葡萄糖氧化酶法測定血糖的基本原理。 掌握酶法測定血糖的實驗方法 熟悉分光光度計的使用。,P57二、葡萄糖氧化酶法測定血糖,16,實驗原理：,葡萄糖O2+H2O GOD 葡萄糖酸內(nèi)酯2O2 22O2 + 4-氨基安替比林+酚 POD 紅色醌類化合物 + 2O +O2,用分光光度法將待測溶液與同樣處理的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液比色，求待測血糖濃度。,17,儀器和藥品：,血清、血糖試劑盒 752可見紫外分光光度計。,18,基本操作,取三支試管，編號，下表加樣計算血糖濃度,19,吸量管的使用,拿吸量管正確姿勢 取液姿勢 卸放姿勢,20,微量取樣器的操作,調(diào)至所需體積值； 吸：垂直持取樣器用大拇指按至第一檔；將吸頭插入溶液松開大拇指，液面上升； 放：移出液面，按至第一檔繼續(xù)按至第二檔以排空液體。 注意：移取另一樣品時， 更換新吸頭。,21,計算公式,測定管吸光度值,標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值,葡萄糖含量(mg/dL)=,×100,參考數(shù)據(jù)： A測=0.217，A標(biāo)=0.258， 葡萄糖含量=84mg/dl,22,思考題,試分析影響本試驗的因素有哪些？ 操作分光光度計時要注意哪些關(guān)鍵點？,23,