《實(shí)驗(yàn)室生物安全》PPT課件.ppt

實(shí)驗(yàn)室生物安全、細(xì)菌接種技術(shù)和革蘭染色,新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室 辦公電話：3029130 監(jiān)督電話：3029945 EMail：,實(shí)驗(yàn)一（5個(gè)學(xué)時(shí)）,1.課件首頁留任課教師的聯(lián)系方式以及科教科聯(lián)系電話（3029945） 2.本次實(shí)驗(yàn)?zāi)康?（1）通過介紹實(shí)驗(yàn)室生物安全方面的相關(guān)知識(shí)，在醫(yī)學(xué)實(shí)踐中樹立 “有菌的意識(shí)，無菌操作的觀念” 以保證工作的安全順利。 （2） 掌握細(xì)菌接種的無菌操作技術(shù) （3）掌握革蘭染色實(shí)驗(yàn)方法并進(jìn)行細(xì)菌基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)的觀察。 3.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（3個(gè)） （1）實(shí)驗(yàn)室生物安全 (0.5學(xué)時(shí)) 熟悉 （1）微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全意義 （2）實(shí)驗(yàn)室規(guī)則,例一：1956年，前蘇聯(lián)的一個(gè)實(shí)驗(yàn)室曾有9支裝有感染了委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒的鼠腦的安瓿被打破。由于沒采取必要的措施，結(jié)果在幾天內(nèi)造成24名工作人員感染。 例二：1998年，我國某大城市的某高校在使用大白鼠進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，有兩名學(xué)生被大白鼠咬傷，還有一些學(xué)生在給實(shí)驗(yàn)老鼠放血、解剖的過程中，未按照要求戴手套操作，結(jié)果在29名實(shí)驗(yàn)人員中，有 9人感染了流行性出血熱 可用實(shí)驗(yàn)室感染事件的發(fā)生引入，說明關(guān)注實(shí)驗(yàn)室生物安全的重要性，以微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室相關(guān)規(guī)則為主，相關(guān)注意事項(xiàng)一定要交代清楚。,醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則,學(xué)生進(jìn)微生物實(shí)驗(yàn)室必須穿好工作服，離室需脫下反折，要經(jīng)常清洗消毒。 進(jìn)實(shí)驗(yàn)室時(shí)隨帶書包、衣物等與實(shí)驗(yàn)無關(guān)物品一律存放指定的儲(chǔ)物柜內(nèi)。 嚴(yán)禁在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)食、飲水和喧嘩打鬧。 手拿培養(yǎng)物后或出實(shí)驗(yàn)室前要洗手，必要時(shí)用消毒液泡手；避免有菌材料濺出；破損器材及時(shí)處理并報(bào)告。 實(shí)驗(yàn)過程中避免一切不良的個(gè)人習(xí)慣；操作中產(chǎn)生的廢料要扔在指定容器內(nèi)；實(shí)驗(yàn)完畢清理臺(tái)面，值日生嚴(yán)格認(rèn)真打掃衛(wèi)生，關(guān)閉水電，門窗，洗手后離開實(shí)驗(yàn)室。,實(shí)驗(yàn)室意外緊急處理辦法,1 皮膚破損：去除異物，生理鹽水或蒸餾水洗凈后2% 碘酊或2%紅汞涂抹。 2 燒傷：局部涂凡士林，2%鞣酸或2%苦味酸。 3 化學(xué)藥品腐蝕傷：若強(qiáng)酸則先用大量清水沖洗，再用碳酸氫鈉溶液洗滌中和；若強(qiáng)堿則先用大量清水沖洗，再用2%硼酸洗滌中和（若傷處為眼部加用橄欖油或者液體石蠟12滴滴眼）。 4 菌液入口：立即吐入消毒容器內(nèi)，1：1000高錳酸鉀或3%雙氧水漱口，根據(jù)菌種服用抗菌藥物。 5 菌液污染臺(tái)面：2%3%來蘇爾或0.1%新潔爾滅覆蓋30分鐘后抹去，皮膚手指沾染活菌應(yīng)用上述液體浸泡3分后肥皂和清水洗凈。 6 火警：勿慌，立即關(guān)閉電閘和煤氣閘。若酒精乙醇乙醚等有機(jī)溶劑起火切不可用水撲救，可用沙土等物撲滅。,（2）無菌操作技術(shù)（1.5學(xué)時(shí)） 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1 掌握常用的細(xì)菌接種方法 2 熟悉細(xì)菌生長現(xiàn)象的觀察方法 一、培養(yǎng)基 概念:是人工配制的專供微生物生長繁殖的混合 營養(yǎng)物制品。 成分：充足的營養(yǎng)物質(zhì)（水分、碳源、氮源、無機(jī)鹽）；合適的PH； 適宜的溫度；適宜的氣體環(huán)境。 用途：用于微生物的繁殖及分離接種，傳代或保存，鑒別微生物的類 屬，研究微生物的生理及生化特性，制造菌苗、疫苗或其他微 生物制劑等。,二、分類,三、細(xì)菌的接種技術(shù),介紹接種環(huán)及其無菌操作使用方法 普通瓊脂培養(yǎng)基接種法 1.平板分區(qū)劃線接種法：分離培養(yǎng)細(xì)菌，通過此法可以獲得純培養(yǎng)為進(jìn)一步鑒定細(xì)菌提供條件。 2.斜面接種法：用于純菌的移種，可短時(shí)間保存菌種。,分區(qū)劃線,劃線時(shí)接種環(huán)與平皿約成30-40度角,輕輕接觸,以腕力在瓊脂表面輕快滑動(dòng),不能劃破瓊脂. 第一次劃線應(yīng)占平皿面積的1/10,以后每次劃線約占面積的1/41/5. 劃線為連續(xù)劃線,不能間斷.應(yīng)占滿平皿.劃線不能交叉重復(fù). 每次劃完后應(yīng)滅菌.,3.半固體穿刺接種法：保存菌種或觀察細(xì)菌的動(dòng)力和生化反應(yīng) 4.液體接種法：用于肉湯、蛋白胨水、糖發(fā)酵管等液體培養(yǎng)基 的接種,四、生長現(xiàn)象的觀察,固體培養(yǎng)基-菌落 一個(gè)細(xì)菌不斷分裂而成的細(xì)菌群體稱之。觀察菌落的形態(tài)、大小、表面、邊緣、濕度、透明度；在血平板上還要觀察溶血情況和色素等。,半固體培養(yǎng)基-鞭毛 觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng),液體培養(yǎng)基-生長,混濁生長（大多數(shù)細(xì)菌） 沉淀生長（鏈球菌） 膜樣生長（專性需氧菌，如結(jié)核分枝桿菌、枯草桿菌）,（3）細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查（3學(xué)時(shí)） 形態(tài)學(xué)檢查分類 一、不染色標(biāo)本檢查(活體）(簡單介紹) 懸滴法 壓滴法 二、染色標(biāo)本檢查 單染法：簡單染色，一種染料 （美蘭染色） 復(fù)染法：復(fù)雜染色，兩種以上染料（革蘭染色、抗酸染色） A.革蘭染色(Gram stain)（每個(gè)學(xué)生一張玻片） 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、掌握細(xì)菌涂片標(biāo)本的制備及革蘭染色的方法 2、熟悉革蘭染色的原理和臨床意義,1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立 革蘭染色是最常用的一種染色方法，可以將細(xì)菌初步分為革蘭染色陽性菌和革蘭染色陰性菌，在臨床上具有非常重要的意義,實(shí)驗(yàn)原理 （重點(diǎn)講解通透性學(xué)說） 器材和試劑 1、菌種 白色葡萄球菌 大腸桿菌 2、試劑 革蘭染色液 初染液 結(jié)晶紫 媒染液 盧戈氏碘液 脫色液 95%乙醇 復(fù)染液 稀釋石碳酸復(fù)紅 3、其它 接種環(huán) 載玻片 染色盤 洗液瓶 酒精燈等,沖洗,染色完成之后，在涂片區(qū)滴上香柏油使用油鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果 若學(xué)生沒用過油鏡觀察標(biāo)本，請(qǐng)示教油鏡的使用方法。,方法與步驟 1、細(xì)菌涂片的制備 涂片 干燥 固定 2、染色 初染（結(jié)晶紫） 媒染（盧戈氏碘液） 脫色 （95%乙醇） 復(fù)染（稀釋石碳酸復(fù)紅） 吸水紙 吸干,1min,1min,30s,30s,沖洗,沖洗,沖洗,結(jié)果（圖片展示） 意義 注意事項(xiàng)（提醒學(xué)生將實(shí)驗(yàn)后的玻片放入 指定的消毒缸中） 注：油鏡的使用方法 尋找視野：在使用油鏡之前，必須先經(jīng)低、高倍鏡觀察，然后將需進(jìn)一步放大的部分移到視野的中心。 增大光照強(qiáng)度：將聚光器上升到最高位置，光圈開到最大。 轉(zhuǎn)高倍鏡頭、滴加鏡油、換油鏡頭：轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，使高倍鏡頭離開通光孔，在需觀察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)油鏡，在轉(zhuǎn)換油鏡時(shí)，從側(cè)面水平注視鏡頭與玻片的距離，使鏡頭浸入油中而又不以壓破載玻片為宜。,調(diào)試觀察：觀察目鏡，并慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié)器至物象清晰為止。如果不出現(xiàn)物象或者目標(biāo)不理想要重新尋找，在加油區(qū)之外重找時(shí)應(yīng)按：低倍高倍油鏡程序。在加油區(qū)內(nèi)重找應(yīng)按：低倍油鏡程序，不得經(jīng)高倍鏡，以免油沾污鏡頭。 清洗鏡頭：油鏡使用完畢，先用擦鏡紙擦去鏡頭上和標(biāo)本上的香柏油，再用擦鏡紙沾少許二甲苯（或乙醚）擦去殘余的香柏油，最后再用干擦鏡紙擦干凈。,透鏡 折光率 油 1.515 1.0 空氣 玻 1.52 璃 空 氣 油鏡原理示意圖,細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)（示教）（二毛莢一胞）,實(shí)驗(yàn)報(bào)告,一、目的 二、原理（主要通透性） 三、材料 四、方法 五、結(jié)果（2+3幅圖） 六、意義 七、注意事項(xiàng),作業(yè)重點(diǎn),1、繪制所涂片染色的G+及G-菌的形態(tài)圖并注明放大倍數(shù)（紅藍(lán)鉛筆） 2、繪制示教片中各細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)形態(tài)圖并注明放大 倍數(shù)（鉛筆）,預(yù)習(xí)下周實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： 消毒滅菌，內(nèi)毒素檢測(cè)，腸道致病菌分離培養(yǎng),