《發(fā)酵工程》課件

微生物發(fā)酵工程,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,2,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,3,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,一 發(fā)酵類型： 發(fā)酵類型是為了描述菌體生長，碳源利用與代謝產物形成速率變化，以及它們相互間動力學關系而確定的。,5.1微生物發(fā)酵的類型和方式,4,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,1動力學描述參數(shù),菌體生長速率,比生 長速率,菌體得 率系數(shù),產物得率系數(shù),（Vx）：單位體積，單位時間里生長的菌體量 g/(L h),（）： 菌體濃度除菌體生長速率或繁殖速率 h-1,（Yx/s）: 消耗1g或1mol營養(yǎng)物質生成的菌體的g數(shù)或mol數(shù),（Yp/s）：消耗1g或1mol營養(yǎng)物質生成的產物的g數(shù)或mol數(shù),5,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,2發(fā)酵類型,根據(jù)產物的形成與,基質消耗的關系分,6,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,2發(fā)酵類型,特點,菌體生長，碳 源利用和產物 形成幾乎都在 相同的時間出 現(xiàn)高峰。,微生物生長和 產物合成是分 開的。 糖既滿 足細胞生長所 需能量又充作 產物合成的碳 源。,產物形成一般 在菌體生長接 近或達到最高 生長時期。產 物形成與碳源 利用無準量關 系。,7,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,8,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,1 分批發(fā)酵： 是一種準封閉式系統(tǒng)。 一次投料，一次接種，一次收獲的間歇式培養(yǎng)方式。培養(yǎng)過程中，接種物要經過5個時期。即延遲期、 對數(shù)生長期、減速期、穩(wěn)定期和衰亡期。,二 發(fā)酵方式：,分批培養(yǎng)的特點：操作簡單、周期短、染菌機會少和生產過程、產品質量易掌握。但是生產率相對較低。,9,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,10,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,減速期,靜止期,衰亡期,特點,11,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,對數(shù)生長期： dX /dt =X 其中： X- 細胞干重 t- 時間 - 比生長速率 微生物的比生長速率與微生物的種類、培養(yǎng)溫度、pH 、培養(yǎng)基成分及限制性基質濃度等因素有關。,12,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,13,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,分批培養(yǎng)過程的生產率 P: 生產率=產物濃度/發(fā)酵時間 生產率是評價發(fā)酵過程的成本和效率的綜合指標。在分批培養(yǎng)時，計算時間還應包括放罐、清洗、裝料和消毒的時間等非發(fā)酵過程所占用的時間。,14,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,15,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,2. 連續(xù)發(fā)酵：連續(xù)發(fā)酵是指在培養(yǎng)過程中，連續(xù)地向發(fā)酵罐中加入培養(yǎng)基，同時以相同的流速從發(fā)酵罐中排出含有產品的培養(yǎng)基的發(fā)酵方式。一般連續(xù)培養(yǎng)方式很多：攪拌發(fā)酵罐和管式反應器；恒化和恒濁；循環(huán)式和非循環(huán)式；單級和多級。,16,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,恒濁,17,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,連續(xù)發(fā)酵,非循環(huán)式：,18,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,單級連續(xù)培養(yǎng)進入穩(wěn)定狀態(tài)后，細胞的比生長速率與稀釋率相等。 連續(xù)培養(yǎng)的最大特點：微生物細胞的生長速率、產物 的代謝均處于恒定狀態(tài)，可達 到穩(wěn)定、高速培養(yǎng)微生物細胞 或生產大量的代謝產物的目 的。生產率得以提高。,19,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,3補料分批發(fā)酵 在分批培養(yǎng)過程中，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基，而不從發(fā)酵罐中間斷地放出培養(yǎng)液的培養(yǎng)方法。 工業(yè)上利用分批補料培養(yǎng)以消除阻遏并保持通氣條件。分批補料培養(yǎng)還可以防止培養(yǎng)基中某一組分的毒性。,20,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,21,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,培養(yǎng)基：提供微生物生長繁殖和生物合成各種代謝產物所需要的，按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質的混合物。,5.2 培養(yǎng)基選擇和配制的原則,22,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,一、培養(yǎng)基的類型和用途,23,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,二.培養(yǎng)基的選擇,24,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,對培養(yǎng)基的要求,提供合成 細胞和發(fā)酵產 物的基本成分,利于減少培 養(yǎng)基原料的單耗,利于提高培養(yǎng) 及產物的濃度,利于減少能耗,減少副產物， 利于產品的 分離純化,利于提高產 物的合成速率,三培養(yǎng)基的配制原則,25,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,26,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,典型培養(yǎng)基,27,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,完善的培養(yǎng)基設計是實驗室的實驗，實驗工廠的放大和生產規(guī)模中的一個重要步驟。 培養(yǎng)基的組成必須滿足細胞的生長和代謝所需的元素，并能提供生物合成和細胞維持活力所需要的能量。,5.3 培養(yǎng)基的設計,28,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,一.培養(yǎng)基的成分,1,2,3,4,能源 物質,碳源 物質,氮源 物質,無機鹽和微量 元素,29,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,一.培養(yǎng)基的成分,5,6,7,8,生長 因子,前體,促進 劑和 抑制 劑,水分,30,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,光能：光能自養(yǎng)微生物的能源。極端嗜鹽菌進行海水淡化，藻類發(fā)酵等 氫、硫、氨、亞硝酸鹽、亞鐵鹽等是 化能自養(yǎng)微生物的能源。 碳水化合物等有機物、石油、天然氣及石油化工產品是異養(yǎng)微生物的能源。,1 能源物質,31,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,。,碳源,細胞碳骨架,產物,能源,2.碳源物質,主要包括：糖類，脂類，有機酸，低碳糖等,32,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,脂類,有機 酸類,33,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,有機氮和無機氮,作用,菌體細 胞結構,含氮代 謝產物,細胞提 供能源,3 氮源物質,34,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,花生餅粉，黃豆餅粉， 棉籽餅粉，酵母粉， 麥麩，魚粉，蠶蛹粉， 玉米漿，蛋白胨，尿素， 廢菌體和酒糟,氨水， 銨鹽和 硝酸鹽,有機氮,無機氮,35,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,4無機鹽和微量元素,磷，鎂，硫，鐵，鉀，鈉，鉛，氯，鋅，鈷，錳等。較低濃度對細胞的生長和產物合成有促進作用， 而在高濃度時常表現(xiàn)出顯著的抑制作用,36,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,作用,酶的激活劑,生理活性 物質的調節(jié)劑,生理活性 物質的組成,37,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,38,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,硫,含硫氨基酸,許多酶的輔酶的活性基,產物,硫酸鈉,硫代 硫酸鈉,39,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,鐵,鎂,鉀和鈣,40,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,微生物生長不可缺少的微量有機物，稱為生長因子。如氨基酸，嘌呤，嘧啶，維生素等。 作用：構成細胞的組成成分，促進生命活動的進行。,5生長因子,41,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,1）生物素 作用：影響產生菌細胞膜的通透性，同時影響菌體的代謝途徑。一般5g/L。,42,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,生 物 素,過量,不足,不產或少產谷氨酸 產乳酸或琥珀酸 長菌快， pH低，尿素消耗多,菌體生長不好 谷氨酸產量低弱 發(fā)酵向乳酸發(fā)酵轉換,43,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,2）維生素B1：對某些菌種發(fā)酵有促進作 用。 3）天然原料：玉米漿， 0.4-0.8% 麩皮水解液， 1% 糖蜜， 0.1-0.4% 酵母,44,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,某些化合物被加到培養(yǎng)基后，能夠直接在生物合成過程中結合到產物分子中去，而自身的結構并未發(fā)生太大的變化，卻能提高產品的產量。這類小分子物質稱為前體。,6前體,45,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,46,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,7促進劑和抑制劑,促進劑,是一類刺激因子，他們并 不是前體或營養(yǎng)，其加入 可以影響微生物的正常代 謝，或促進中間代謝產物 的積累，或提高次級代謝 產物的產量。,常用的促進劑,誘導物，表面 活性劑，乙二 胺四乙酸， 大 豆油抽提物等。,47,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,在發(fā)酵過程中，加入抑制劑會抑制某些代謝途徑的進行，同時刺激另一代謝途徑，以至于可以改變微生物的代謝途徑。,48,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,49,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,8水分,微生物發(fā)酵工程,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,51,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,52,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,一.培養(yǎng)基的成分,1,2,3,4,能源 物質,碳源 物質,氮源 物質,無機鹽和微量 元素,53,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,一.培養(yǎng)基的成分,5,6,7,8,生長 因子,前體,促進 劑和 抑制 劑,水分,54,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,嚴格控制營養(yǎng)物質的濃度和比例，不僅僅是為了維持正常的滲透壓，節(jié)約原料，而且直接影響到菌體的繁殖和產物積累。,二營養(yǎng)物質的調節(jié),55,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,56,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,1).不同碳源的利用速度,能夠被微生物快速利用的碳源稱為速效碳源， 反之為遲效碳源。 利用速度依次為：葡萄糖-乳酸-乳糖,57,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,微生物對氮源的利用速度為：氨態(tài)氮-硝態(tài)氮-有機氮。 氨的過高過低都會對產物形成造成不良的影響。 氮源的利用速度與碳源的利用速度是很有關系的。 糖代謝的許多中間產物是氨基酸合成的前體。,2).氮源利用和碳源利用的關系,58,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,生產上多采用控制碳氮比例以滿足菌體 的大量繁殖，又能大量形成產物。 酵母細胞的碳氮比為：100：20；霉菌 細胞的碳氮比為：100：10。 發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮比約為：100：0.2-2.0。 谷氨酸生產中的碳氮比約為：100：15-21。,3).碳氮比例的調節(jié),59,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,4).前體的控制,60,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,補料,豐富培養(yǎng)基 產物合成的旺盛期延長,控制pH和代謝方向,改善了通氣效果,解除終產物反饋,5)補料,61,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,補料的物質,碳，氮和水及其他物質。碳源 有葡萄糖，飴糖，蔗糖，糊精 ，淀粉，油脂等。補料氮源有氨 水，硫酸銨，硝酸鈉，蛋白胨， 花生餅粉，黃豆餅粉， 玉米漿 和尿素等。,補料的方法,關鍵是控制補料時間， 速率和配比。其目的是不 使菌體生長過快，僅僅 維持呼吸，但是仍能合 成產物。,62,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,碳源和能源+氮源+其他需要 細胞+產物+CO2 + H2O熱量 組成微生物的元素包括、和，這些元素都要在方程中予以平衡。培養(yǎng)基中還需要微量元素(、等)。,三培養(yǎng)基的設計,63,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,64,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,對于無力合成的生長因子，要通過在培養(yǎng)基中加入適量的純凈物或含有該物質的混合物。 碳源具有生物合成的底物和能源的雙重作用。在需氧的條件下對碳源的需要量可以通過菌體得率系數(shù)推算而得,65,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,工業(yè)上，將淀粉水解成葡萄糖的過程稱為淀粉的糖化。,5.4淀粉水解糖的制備,66,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,發(fā)酵用淀粉水解糖的要求：還原糖含量要高，不含糊精；外觀要潔凈，透明，呈淡黃色；不可變質。 制備淀粉水解糖的原料主要有玉米，小麥，大米和薯類等。,67,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,68,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,方法,酸解法,酶解法,酸酶 結合法,69,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,1.淀粉水解糖對發(fā)酵的影響 水解不完全：浪費，逃液，染菌。 水解過度：產生羥甲基糠醛，進而形成類黑素，不僅浪費，而且抑制菌體生長。 淀粉原料中蛋白含量過多，當糖液中和，過濾時除去不徹底，會引起發(fā)酵逃液和染菌。,70,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,葡萄糖的理論收率：111%,指 標,實際 收率,葡萄糖值,淀粉 轉化率,2.淀粉制糖過程中考察的指標,71,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,實際收率=糖液體積（L）X葡萄糖含量（%）/淀粉量（Kg）X原料中純淀粉的含量（%）X100% 轉化率=糖液體積（L）X葡萄糖含量（%）/淀粉量（Kg）X原料中純淀粉的含量（%）X1.11X100% DE值=還原糖（%）/干物質含量（%）,72,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,以酸為催化劑，在高溫高壓下，將淀粉轉化為葡萄糖的方法。 優(yōu)點：生產簡單，方便，水解時間短，設備生產能力大。 缺點：要求特殊設備；易產生副反應；對原料要求高 原理： 淀粉 各種糊精 麥芽糖 葡萄糖,二淀粉酸水解法,73,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,影響水解反應速率的關鍵因素：,74,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,淀粉 羥甲基糠醛 乙酰丙酸+蟻酸+有色物質等。,其它副反應,縮短反應時間， 控制反應， 降低葡萄糖的濃度,減少,75,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,葡萄糖,二糖， 三糖和 其他低 聚糖,酸和熱,復合反應,異麥芽糖和龍膽二糖,降低葡萄糖的收率， 發(fā)酵的殘?zhí)窃黾樱?抑制菌體生長和產物形成， 增加提取和精制的難度,76,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,工藝,原料,中和 脫色,過濾 除雜,糖液,調漿,糖化,冷卻,10.5-12B 0.6-0.7%， pH1.5 左右,糖化時間=達到最大葡萄糖值時的時間-放料時間。,燒堿或純堿中和溫度為60-70， 中和pH4.6-5.0.,活性炭 ，淀粉量的0.6-0.8%。 65C。，pH4.6-5.0。,d =144.3/144.3B,77,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,三雙酶水解法,淀 粉 酶 和 糖 化 酶,優(yōu)點,缺點,條件溫和，無需特殊設備 無副反應，產品純度高，淀粉轉化率高。 可在高淀粉濃度下水解,時間長， 設備多， 過濾難。,78,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,淀粉,a-淀粉酶,葡萄糖， 麥芽糖和 麥芽三糖。 異麥芽糖 和低聚糖。,（一）液化,79,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,1.淀粉液化的條件及液化 程度的控制,淀 粉,糊化,老化,受熱后，淀粉顆粒膨脹，晶體結構消失，互相接觸變成糊狀液體，即使停止攪拌，淀粉也不會再沉淀的現(xiàn)象。 60-75。,分子間氫鍵已經斷裂的糊化淀粉 又重新排列成新的氫鍵的過程。淀粉酶很難進入老化淀粉的結晶區(qū)起作用，使淀粉很難液化,淀粉的種類，酸堿度，溫度及加熱方式，淀粉糊的濃度有關系。,80,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,液化的方法,81,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,1）、工藝流程 -,調漿,高溫 維持,二次 液化,冷卻,糖化,配料,一次噴 射液化,液化 保溫,二次 噴射,2、蒸氣噴射液化工藝及條件,82,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,2）、液化的控制,液 化,低,高,液化液的黏度太大，難于操作； 淀粉易老化， 不利于糖化。,糖液的葡萄糖值低，淀粉會老化，影響糖化酶的作用效果。,葡萄糖值為10-20 液化結束要滅酶 。,83,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,糖化酶的水解作用 糖化是利用糖化酶將淀粉液化產物糊精和低聚糖進一步水解成葡萄糖的過程。 糖化過程葡萄糖含量不斷增加。糖化酶對底物的作用是從非還原性末端開始的。產生a-葡萄糖。糖化酶對a-1,4和a-1,6 糖苷鍵都能水解。,（二）糖化,84,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,液化-糖化-滅酶-過濾-貯糖計量-發(fā)酵,80-100U/g 淀粉 pH 4.2-4.5, 60 數(shù)小時,pH 4.8-5.0 90 30min,60-70 過濾,糖化工藝條件及控制,85,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,86,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,基因工程菌的穩(wěn)定性是高水平發(fā)酵生產的基本條件。,5.5基因工程菌的不穩(wěn)定性及對策,87,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,一、質粒不穩(wěn)定性,分裂不穩(wěn)定性,工程菌分裂時出現(xiàn)一定比 例的不含質粒的子代菌的 現(xiàn)象,結構不穩(wěn)定性,由于DNA從質粒上丟失或 堿基重排、缺失所致工程 菌性能的改變,88,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,合適的 宿主,合適的 載體,固定化,提高質粒穩(wěn)定性的方法,89,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,基因工程菌的培養(yǎng),補料分批,連續(xù) 培養(yǎng),透析 培養(yǎng),固定化培養(yǎng),延長對數(shù)期 獲得高密度 菌體,難；分段，進行兩階段連續(xù)連續(xù)培養(yǎng)；優(yōu)化誘導水平，稀釋率；細胞比生長速率,利用膜的半透性使培養(yǎng)物和培養(yǎng)基分離,質粒的穩(wěn)定性提高,90,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,高密度培養(yǎng),高密度培養(yǎng)是一個相對概念，一般是指培養(yǎng)液中工程菌的菌體濃度在50g/L干重以上，理論上最高值可達200g/L。高密度培養(yǎng)是大規(guī)模制備重組蛋白質過程中不可缺少的工藝過程 高密度培養(yǎng)可以提高菌體密度，提高單位體積的生產能力，降低生物量的分離費用，縮短生產周期，從而降低生產成本，提高生產效率。,91,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,影響高密度培養(yǎng)的因素,pH,92,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,影響高密度培養(yǎng)的因素,93,5微生物發(fā)酵類型及培養(yǎng)基,如何達到高密度培養(yǎng),