酶的發(fā)酵工程

第 二 章 酶 的 生 物 合 成 與 發(fā) 酵 生 產(chǎn) 提 取 分 離 法 微 生 物 細(xì) 胞 發(fā) 酵 產(chǎn) 酶 酶 的 生 產(chǎn) 方 法 生 物 合 成 法 植 物 細(xì) 胞 發(fā) 酵 產(chǎn) 酶 化 學(xué) 合 成 法 動(dòng) 物 細(xì) 胞 發(fā) 酵 產(chǎn) 酶 第 一 節(jié) 酶 生 物 合 成 及 調(diào) 節(jié)一 、 酶 的 生 物 合 成 遺 傳 信 息 傳 遞 的 中 心 法 則轉(zhuǎn)錄傳遞給RN A，再由RNA 蛋 白 質(zhì)翻 譯轉(zhuǎn) 錄 逆 轉(zhuǎn) 錄 復(fù) 制復(fù) 制 DNARNA （ 一 ） RNA的 生 物 合 成 -轉(zhuǎn) 錄 (transcription) 定 義 以 DNA為 模 板 ， 以 核 苷 三 磷 酸 為 底 物 ， 在RNA聚 合 酶 （ 轉(zhuǎn) 錄 酶 ） 的 作 用 下 ， 生 成 RNA分 子的 過(guò) 程 。. 轉(zhuǎn) 錄 模 板啟 動(dòng) 子 （ promotor) 終 止 子 (terminator)模 板 鏈 （ template strand）反 意 義 鏈 (antisense strand)編 碼 鏈 (coding strand)有 意 義 鏈 (sense strand)5 53 3反 意 義 鏈 :指 導(dǎo) 轉(zhuǎn) 錄 作 用 的 一 條 DNA鏈有 意 義 鏈 :無(wú) 轉(zhuǎn) 錄 功 能 的 一 條 DNA鏈 . T C G A G T A CA G C T C A T GC G A G U A CG C A U RNA聚 合 酶有 意 義 鏈反 意 義 鏈 RNA PPi5 53GTP UTPCTP ATPUTPRNA在 DNA模 板 上 的 生 物 合 成335 RNA的 轉(zhuǎn) 錄 過(guò) 程 (三 步 )1.起 始2.延 長(zhǎng)3.終 止 原 核 生 物 的 RNA聚 合 酶 (DDRP)E. coli的 RNA聚 合 酶 是 由 四 種 亞 基 組 成 的 五 聚 體（ 2 ） 核心酶（core enzyme） 全酶（holoenzyme） 起 始 因 子 RNA合 成 過(guò) 程起 始雙 鏈 DNA局 部 解 開(kāi)磷 酸 二 酯鍵 形 成 終 止 階 段解 鏈 區(qū) 到 達(dá)基 因 終 點(diǎn)延 長(zhǎng) 階 段 5 3 RNA 啟 動(dòng) 子 （promotor) 終 止 子(terminator)5 RNA聚 合 酶5 35 355 3 離 開(kāi) RNA鏈 的 延 伸 圖 解 3 5 RNA-DNA雜 交 螺 旋聚 合 酶 的 移 動(dòng) 方 向新 生 RNA復(fù) 鏈 解 鏈有 義 鏈模 板 鏈 （ 反 義 鏈 ） 延 長(zhǎng) 部 位 定 義 以 mRNA為 模 板 ， 以 氨 基 酸 為 底 物 ， 在 核 糖體 上 通 過(guò) 各 種 tRNA、 酶 和 輔 助 因 子 的 作 用 ， 合成 多 肽 鏈 的 過(guò) 程 。（ 二 ） 蛋 白 質(zhì) 的 生 物 合 成 -翻 譯 (translation) 酪 55 3AUGGUU UAC ACA酪 氨 酰 - tRNA反 密 碼 mRNA密 碼 與 反 密 碼 的 堿 基 配 對(duì) AUG ACA5 蛋 蘇UGU GUU 3受 位(A位 )給 位(P位 )大 亞 基 小 亞 基 蛋 白 質(zhì) 的 合 成 過(guò) 程 （ 大 腸 桿 菌 ）v 氨 基 酸 的 活 化v 肽 鏈 合 成 的 起 始v 肽 鏈 的 延 伸v 肽 鏈 合 成 的 終 止 與 釋 放 氨 基 酸 的 活 化 與 轉(zhuǎn) 運(yùn)反 應(yīng) 式 ：AA + tRNA + ATP 氨 酰 -tRNA合 成 酶氨 酰 -tRNA+AMP+PPi 對(duì) 于 E.coli而 言 ， 肽 鏈 合 成 時(shí) 的 第 一個(gè) 氨 基 酸 都 是 甲 酰 甲 硫 氨 酸 （ fMet） 。 在 核 糖 體 上 合 成 多 肽 （ 三 階 段 ）1、 起 始 階 段2、 延 伸 階 段3、 終 止 階 段 肽 鏈 合 成 的 起 始 階 段1.mRNA與 小 亞 基 結(jié) 合 ： 形 成 30S-mRNA-IF3復(fù) 合 物2.AUG與 蛋 氨 酰 -tRNA結(jié) 合 ： 30S-mRNA-IF3 fMet-tRNA-IF2-GTP fMet-tRNA正 好 位 于 mRNA的 起 始 密 碼 子 上 （ AUG） 。3.大 小 亞 基 結(jié) 合 IF1 30S起 始 復(fù) 合 物 AUG ACA5 3AUG ACA5 3UAC UACAUG ACA5 3小 亞 基 mRNA 蛋 氨 酰 tRNA GTP大 亞 基GDP+Pi受 位給 位 蛋 蛋肽 鏈 合 成 的 起 始 階 段 肽 鏈 合 成 的 延 伸 階 段1.進(jìn) 位 :氨 基 酰 -tRNA進(jìn) 入 受 位 ;2.轉(zhuǎn) 肽 :形 成 肽 鍵 ,在 轉(zhuǎn) 肽 酶 作 用 下 ,給 位 與 受 位 結(jié) 合 ;3.移 位 :核 蛋 白 體 向 3 端 移 動(dòng) 一 個(gè) 密 碼 子 的 位 置 ,空 出 受 位 ,不 斷 地 進(jìn) 位 、 轉(zhuǎn) 肽 、 移 位 ,使 肽 鏈 延 長(zhǎng) 。 AUG ACA5 3UAC蛋 蘇UGU AUG ACA5 UAC蛋 蘇UGUGUUAUG ACA5 UAC蛋 蘇UGUGUUAUG ACA5 蛋 蘇UGU GUU 33 3GTP GDP+PiGDP+Pi GTP起 始 復(fù) 合 體 進(jìn) 位轉(zhuǎn) 肽移 位 Mg+K+ 肽 鏈 合 成 的 終 止 階 段1.出 現(xiàn) 終 止 密 碼 并 與 終 止 因 子 結(jié) 合 ;2.肽 鍵 水 解 ,多 肽 釋 放 ;3.tRNA,mRNA,大 小 亞 基 解 離 . AUG UAA5 UAC AUG UAA5 UAC3 3終 終AUG UAA5 UAC 3終5 3 UAC終 肽 鏈 二 、 酶 生 物 合 成 的 調(diào) 節(jié)定 義 ： 通 過(guò) 調(diào) 節(jié) 酶 合 成 的 量 來(lái) 控 制 微 生 物代 謝 速 度 的 調(diào) 節(jié) 機(jī) 制 ， 是 在 基 因 轉(zhuǎn) 錄 水 平 上進(jìn) 行 的 。意 義 ： 通 過(guò) 阻 止 酶 的 過(guò) 量 合 成 ， 節(jié) 約 生 物合 成 的 原 料 和 能 量 。 操 縱 子 基 因 表 達(dá) 的 協(xié) 同 單 位操 縱 子 結(jié) 構(gòu) 基 因 （ 編 碼 蛋 白 質(zhì) , structural gene, S）控 制 部 位 操 縱 基 因 （ operator gene, O）啟 動(dòng) 子 （ promotor gene, P）Jacob and Monod的 基 因 操 縱 子 調(diào) 節(jié) 系 統(tǒng) 示 意 圖 調(diào) 節(jié) 基 因 啟 動(dòng) 基 因 操 縱 基 因 結(jié) 構(gòu) 基 因 DNA 轉(zhuǎn) 錄 （ -） RNA聚 合 酶 （ +） 轉(zhuǎn) 錄 翻 譯 mRNA 翻 譯 阻 遏 蛋 白 蛋 白 質(zhì) 誘 導(dǎo) 劑 控 制 區(qū) 信 息 區(qū)操 縱 子 調(diào) 節(jié) 基 因 (regulator gene)： 可 產(chǎn) 生 一 種 組 成 型 調(diào) 節(jié) 蛋 白 (regulatory protein) （ 一 種 變 構(gòu) 蛋 白 ） ， 通 過(guò) 與 效 應(yīng)物 (effector) （ 包 括 誘 導(dǎo) 物 和 輔 阻 遏 物 ）的 特 異 結(jié) 合 而 發(fā) 生 變 構(gòu) 作 用 ， 從 而 改 變 它 與操 縱 基 因 的 結(jié) 合 力 。 調(diào) 節(jié) 基 因 常 位 于 調(diào) 控 區(qū) 的 上 游 。 R P O S D N A CRP-cA M P復(fù) 合 物 CRP+cA M P cAMP-CRP復(fù) 合 物 的 作 用 示 意 圖 啟 動(dòng) 基 因 （ promotor gene） （ 啟 動(dòng) 子 ） ： 有 兩 個(gè) 位 點(diǎn) ： （ 1） RNA聚 合 酶 的 結(jié) 合 位 點(diǎn)（ 2） cAMP-CAP的 結(jié) 合 位 點(diǎn) 。CAP： 分 解 代 謝 產(chǎn) 物 基 因 活 化 蛋 白 （ catabolite gene activator protein） ， 又 稱 環(huán) 腺 苷 酸 受 體 蛋 白 (cAMP receptor protein， CRP） 。 只 有 cAMP-CRP復(fù) 合 物 結(jié) 合 到 啟 動(dòng) 子 的 位 點(diǎn) 上 ， RNA聚 合 酶 才 能 結(jié) 合 到 其 在 啟 動(dòng) 子 的 位 點(diǎn) 上 ， 酶 的 合 成 才能 開(kāi) 始 。 操 縱 基 因 （ Operater gene） : 位 于 啟 動(dòng) 基 因 和 結(jié) 構(gòu) 基 因 之 間 的 一 段 堿基 順 序 ， 能 特 異 性 地 與 調(diào) 節(jié) 基 因 產(chǎn) 生 的 變 構(gòu)蛋 白 結(jié) 合 ， 操 縱 酶 合 成 的 時(shí) 機(jī) 與 速 度 。結(jié) 構(gòu) 基 因 （ Structural gene） : 決 定 某 一 多 肽 的 DNA模 板 ， 與 酶 有 各 自的 對(duì) 應(yīng) 關(guān) 系 ， 其 中 的 遺 傳 信 息 可 轉(zhuǎn) 錄 為 mRNA，再 翻 譯 為 蛋 白 質(zhì) 。 (二 ) 酶 合 成 調(diào) 節(jié) 的 類 型 1.誘 導(dǎo) (induction) 組 成 酶 ： 細(xì) 胞 固 有 的 酶 類 。 誘 導(dǎo) 酶 ： 是 細(xì) 胞 為 適 應(yīng) 外 來(lái) 底 物 或 其 結(jié) 構(gòu) 類 似 物 而 臨 時(shí) 合 成 的 一 類 酶 。 2.阻 遏 (repression) 分 解 代 謝 物 阻 遏 (catabolite repression) 反 饋 阻 遏 (feedback repression) 酶 合 成 誘 導(dǎo) 的 現(xiàn) 象 ： 已 知 分 解 利 用 乳 糖 的 酶 有 ： -半 乳 糖 苷 酶 ； -半 乳 糖 苷 透 過(guò) 酶 ； 硫 代 半 乳 糖 苷 轉(zhuǎn) 乙 酰 酶 。實(shí) 驗(yàn) ： （ 1） 大 腸 桿 菌 生 長(zhǎng) 在 葡 萄 糖 培 養(yǎng) 基 上 時(shí) ， 細(xì) 胞內(nèi) 無(wú) 上 述 三 種 酶 合 成 ； （ 2） 大 腸 桿 菌 生 長(zhǎng) 在 乳 糖 培 養(yǎng) 基 上 時(shí) ， 細(xì) 胞 內(nèi) 有上 述 三 種 酶 合 成 ； （ 3） 表 明 菌 體 生 物 合 成 的 經(jīng) 濟(jì) 原 則 ： 需 要 時(shí) 才 合 成 。 調(diào) 節(jié)基 因 操 縱基 因 乳 糖 結(jié) 構(gòu) 基 因P LacZ LacY LacamRNA 阻 遏 蛋 白（ 有 活 性 ） 基 因 關(guān) 閉啟動(dòng)子 OR P LacZ LacY Laca調(diào) 節(jié)基 因 操 縱基 因 乳 糖 結(jié) 構(gòu) 基 因啟動(dòng)子 OR mRNAZ mRNAY mRNAa 阻 遏 蛋 白（ 無(wú) 活 性 ） 基 因 表達(dá)mRNA A、 乳 糖 操 縱 子 的 結(jié) 構(gòu)B、 乳 糖 酶 的 誘 導(dǎo) 乳 糖 阻 遏 蛋 白（ 有 活 性 ） 誘導(dǎo) 2.末 端 產(chǎn) 物 阻 遏 由 某 代 謝 途 徑 末 端 產(chǎn) 物 的 過(guò) 量 累 積 引 起 的 阻 遏 。 酶 合 成 阻 遏 的 現(xiàn) 象 ： 實(shí) 驗(yàn) ： （ 1） 大 腸 桿 菌 生 長(zhǎng) 在 無(wú) 機(jī) 鹽 和 葡 萄 糖 的 培 養(yǎng) 基 上 時(shí) ， 檢 測(cè) 到 細(xì) 胞 內(nèi) 有 色 氨 酸 合 成 酶 的 存 在 ； （ 2） 在 上 述 培 養(yǎng) 基 中 加 入 色 氨 酸 ， 檢 測(cè) 發(fā) 現(xiàn) 細(xì) 胞 內(nèi) 色氨 酸 合 成 酶 的 活 性 降 低 ， 直 至 消 失 。 （ 3） 表 明 色 氨 酸 的 存 在 阻 止 了 色 氨 酸 合 成 酶 的 合 成 ，體 現(xiàn) 了 菌 體 生 長(zhǎng) 的 經(jīng) 濟(jì) 原 則 :不 需 要 就 不 合 成 。 色 氨 酸 操 縱 子 酶 的 阻 遏調(diào) 節(jié) 基 因 操 縱 基 因 結(jié) 構(gòu) 基 因mRNA酶 蛋 白阻 遏 蛋 白 不 能 與 操 縱 基 因 結(jié) 合 ，結(jié) 構(gòu) 基 因 表 達(dá) 調(diào) 節(jié) 基 因 操 縱 基 因 結(jié) 構(gòu) 基 因輔 阻 遏 物代 謝 產(chǎn) 物 與 阻 遏 蛋 白 結(jié)合 ， 使 之 構(gòu) 象 發(fā) 生 變 化與 操 縱 基 因 結(jié) 合 ， 結(jié) 構(gòu)基因 不 能 表 達(dá) 酶的誘導(dǎo)和阻遏操縱子模型 B.有 活 性 阻 遏 蛋 白 加 誘 導(dǎo) 劑A.有 活 性 阻 遏 蛋 白C.無(wú) 活 性 阻 遏 蛋 白 D.無(wú) 活 性 阻 遏 蛋 白 加 輔 阻 遏 劑 操 縱 基 因啟 動(dòng) 基 因調(diào) 節(jié) 基 因 結(jié) 構(gòu) 基 因 阻 遏 蛋 白(有 活 性 ) 阻 遏 蛋 白 阻 擋 操 縱 基 因結(jié) 構(gòu) 基 因 不 表 達(dá)誘 導(dǎo) 物 誘 導(dǎo) 物 與 阻 遏 蛋 白 結(jié) 合 ,使 阻 遏 蛋 白 不 能 起到 阻 擋 操 縱 基 因 的 作 用 ,結(jié) 構(gòu) 基 因 可 以 表 達(dá)酶 蛋 白mRNA 阻 遏 蛋 白 不 能 跟 操 縱 基 因 結(jié) 合 , 結(jié) 構(gòu) 基 因 可 以 表 達(dá)阻 遏 蛋 白 (無(wú) 活 性 ) 酶 蛋 白mRNA代 謝 產(chǎn) 物 與 阻 遏 蛋 白 結(jié) 合 ,從 而 使 阻 遏 蛋白 能 夠 阻 擋 操 縱 基 因 ,結(jié) 構(gòu) 基 因 不 表 達(dá)代 謝 產(chǎn) 物 調(diào) 控 方 式 阻 遏 蛋 白 添 加 物 與 操 縱 基因 結(jié) 合 阻 遏 效 應(yīng) 舉 例酶 的 誘 導(dǎo) 有 活 性 不 轉(zhuǎn) 錄 ，繼 而 不 翻 譯誘 導(dǎo) 物 轉(zhuǎn) 錄 ，繼 而 翻 譯 乳 糖 操縱 子酶 的 阻 遏 無(wú) 活 性 阻 遏 物 不 轉(zhuǎn) 錄 ，繼 而 不 翻 譯 色 氨 酸操 縱 子酶 合 成 的 誘 導(dǎo) 與 阻 遏 操 縱 子 模 型 調(diào) 控 作 用 對(duì) 比 3.分 解 代 謝 物 阻 遏n 指 細(xì) 胞 內(nèi) 同 時(shí) 有 兩 種 分 解 底 物 （ 碳 源 或 氮源 ） 存 在 時(shí) ， 利 用 快 的 那 種 分 解 底 物 會(huì) 阻遏 利 用 慢 的 底 物 的 有 關(guān) 酶 合 成 的 現(xiàn) 象 。n 分 解 代 謝 物 的 阻 遏 作 用 ， 并 非 由 于 快 速 利用 的 甲 碳 源 本 身 直 接 作 用 的 結(jié) 果 ， 而 是 通過(guò) 甲 碳 源 （ 或 氮 源 等 ） 在 其 分 解 過(guò) 程 中 所產(chǎn) 生 的 中 間 代 謝 物 所 引 起 的 阻 遏 作 用 。 分 解 代 謝 物 阻 遏 現(xiàn) 象 ： 實(shí) 驗(yàn) ： 細(xì) 菌 在 含 有 葡 萄 糖 和 乳 糖 的 培 養(yǎng) 基 上 生 長(zhǎng) ， 優(yōu)先 利 用 葡 萄 糖 。 待 葡 萄 糖 耗 盡 后 才 開(kāi) 始 利 用 乳 糖 ， 產(chǎn)生 了 兩 個(gè) 對(duì) 數(shù) 生 長(zhǎng) 期 中 間 隔 開(kāi) 一 個(gè) 生 長(zhǎng) 延 滯 期 的 “ 二次 生 長(zhǎng) 現(xiàn) 象 ” (diauxie或 biphasic growth） 。 0 2 4 6 8020 4060 80 細(xì)胞濃度(OD) 時(shí) 間 (h) 這 一 現(xiàn) 象 又 稱 葡 萄 糖 效 應(yīng) ，產(chǎn) 生 的 原 因 是 由 于 葡 萄 糖 降 解物 阻 遏 了 分 解 乳 糖 酶 系 的 合 成 。此 調(diào) 節(jié) 基 因 的 產(chǎn) 物 是 環(huán) 腺 苷 酸受 體 蛋 白 （ CRP） ,亦 稱 降 解 物基 因 活 化 蛋 白 （ CAP） 。 分 解 代 謝 物 阻 遏R LacZ LacY LacamRNA mRNAZ mRNAY mRNAa 基 因 表達(dá)CAP基 因 結(jié) 構(gòu) 基 因TCAP OCAP結(jié)合 部 位 RNA聚 合 酶 TcAMP -CAP P 葡 萄 糖分 解 代謝 產(chǎn) 物腺 苷 酸環(huán) 化 酶磷 酸 二 酯酶ATPcAMP5-AMP 抑 制激 活葡 萄 糖 降 解 物 與 cAMP的 關(guān) 系cAMPCAP： 降 解 物 基 因 活 化 蛋 白 （ catabolic gene activation protein）降 低 cAMP濃 度使 CAP呈 失 活 狀 態(tài) 三 、 提 高 酶 產(chǎn) 量 的 策 略（ 一 ） 菌 種 選 育 （ 一 勞 永 逸 ） 1.誘 變 育 種 (1) 使 誘 導(dǎo) 型 變 為 組 成 型 選 育 組 成 型 突 變 株(2)使 阻 遏 型 變 為 去 阻 遏 型 選 育 營(yíng) 養(yǎng) 缺 陷 型 突 變 株解 除 反 饋 阻 遏 選 育 結(jié) 構(gòu) 類 似 物 抗 性 突 變 株解 除 分 解 代 謝 物 阻 遏 選 育 抗 分 解 代 謝 阻 遏 突 變 株 2. 基 因 工 程 育 種 （ 二 ） 條 件 控 制1. 添 加 誘 導(dǎo) 物 酶 的 底 物 類 似 物 最 有 效 。2. 降 低 阻 遏 物 濃 度 除 去 終 產(chǎn) 物產(chǎn) 物 阻 遏 添 加 阻 止 產(chǎn) 物 形 成 的 抑 制 劑 避 免 使 用 葡 萄 糖分 解 代 謝 物 阻 遏 避 免 培 養(yǎng) 基 過(guò) 于 豐 富 添 加 一 定 量 的 cAMP 3.添 加 表 面 活 性 劑 離 子 型 對(duì) 細(xì) 胞 有 毒 害 作 用表 面 活 性 劑 Tween 80 非 離 子 型 增 加 細(xì) 胞 通 透 性 TritonX 1004. 添 加 產(chǎn) 酶 促 進(jìn) 劑 第 二 節(jié) 酶 發(fā) 酵 動(dòng) 力 學(xué) 一 、 細(xì) 胞 生 長(zhǎng) 動(dòng) 力 學(xué) 在 分 批 培 養(yǎng) (batch culture)過(guò) 程 中 ， 細(xì) 胞生 長(zhǎng) 一 般 要 經(jīng) 歷 延 遲 期 、 指 數(shù) 生 長(zhǎng) 期 、 減 速 期 、靜 止 期 和 衰 亡 期 5個(gè) 階 段 。 EDCBAO細(xì) 胞濃度 (g/L ) 培 養(yǎng) 時(shí) 間 (h ) 細(xì) 胞 生 長(zhǎng) 曲 線 O-A 延 遲 期 A-B指 數(shù) 生 長(zhǎng) 期 B-C減 速 期 C-D 靜 止 期 D-E 衰 亡 期 營(yíng) 養(yǎng) 物 濃 度 （ 生 長(zhǎng) 限 制 基 質(zhì) 濃 度 ） 和 生 長(zhǎng) 速 率之 間 的 動(dòng) 力 學(xué) 關(guān) 系 ： Monod模 型n :比 生 長(zhǎng) 速 率 （ 1/h） （ specific growth rate）n max： 最 大 比 生 長(zhǎng) 速 率 （ 1/h）n S： 營(yíng) 養(yǎng) 物 濃 度 （ 生 長(zhǎng) 限 制 基 質(zhì) 濃 度 ） 克 /Ln Ks： 莫 諾 德 常 數(shù) 或 飽 和 常 數(shù) 或 營(yíng) 養(yǎng) 物 利 用 常 數(shù) 克 /L，或 mol/L SK SXdtdX sm 1 二 、 產(chǎn) 酶 動(dòng) 力 學(xué) （ 一 ） 酶 生 物 合 成 的 模 式 根 據(jù) 酶 的 合 成 與 細(xì) 胞 生 長(zhǎng) 之 間 的 關(guān) 系 ， 可 將 酶的 生 物 合 成 分 為 3種 模 式 ， 即 ： 同 步 合 成 型 生 長(zhǎng) 偶 聯(lián) 型 中 期 合 成 型 部 分 生 長(zhǎng) 偶 聯(lián) 型 延 續(xù) 合 成 型 非 生 長(zhǎng) 偶 聯(lián) 型 滯 后 合 成 型 1. 生 長(zhǎng) 偶 聯(lián) 型 （ 又 稱 同 步 合 成 型 ） 酶 的 生 物 合 成 與 細(xì) 胞 生 長(zhǎng) 同 步 。特 點(diǎn) ： 酶 的 合 成 可 以 誘 導(dǎo) ， 但 不 受 分 解 代 謝 物 阻 遏和 反 應(yīng) 產(chǎn) 物 阻 遏 。 當(dāng) 去 除 誘 導(dǎo) 物 、 細(xì) 胞 進(jìn) 入 平 衡 期 后 ， 酶 的 合 成立 即 停 止 ， 表 明 這 類 酶 所 對(duì) 應(yīng) 的 mRNA很 不 穩(wěn) 定 。 a 酶 細(xì) 胞 細(xì)胞或酶濃 度 時(shí) 間 生 長(zhǎng) 偶 聯(lián) 型 中 的 特 殊 形 式 中 期 合 成 型 酶 的 合 成 在 細(xì) 胞 生 長(zhǎng) 一 段 時(shí) 間 后 才 開(kāi) 始 ， 而 在 細(xì)胞 生 長(zhǎng) 進(jìn) 入 平 衡 期 以 后 ， 酶 的 合 成 也 隨 著 停 止 。特 點(diǎn) ： 酶 的 合 成 受 產(chǎn) 物 的 反 饋 阻 遏 或 分 解 代 謝 物 阻 遏 。 所 對(duì) 應(yīng) 的 mRNA是 不 穩(wěn) 定 的 。 0 2 4 6 8 100.00.10.20.30.4 0.5 細(xì) 胞 濃 度 酶 濃 度細(xì)胞濃度 (OD 500) 酶濃度(U/mL) 時(shí) 間 (h) 枯 草 桿 菌 堿 性 磷 酸 酶 合 成 曲 線 2.部 分 生 長(zhǎng) 偶 聯(lián) 型 （ 又 稱 延 續(xù) 合 成 型 ） 酶 的 合 成 在 細(xì) 胞 的 生 長(zhǎng) 階 段 開(kāi) 始 ， 在 細(xì) 胞 生 長(zhǎng) 進(jìn)入 平 衡 期 后 ， 酶 還 可 以 延 續(xù) 合 成 較 長(zhǎng) 一 段 時(shí) 間 。特 點(diǎn) ： 可 受 誘 導(dǎo) ， 一 般 不 受 分 解 代 謝 物 和 產(chǎn) 物 阻 遏 。 所 對(duì) 應(yīng) 的 mRNA相 當(dāng) 穩(wěn) 定 。 b酶 細(xì) 胞 細(xì)胞 或酶濃度 時(shí) 間 0 40 80 12002040 60 細(xì)胞濃度 酶濃度酶濃度(單位/ml) 時(shí)間 (h) 0.012.525.037.550.0 細(xì)胞濃度(g/L) 黑 曲 霉 聚 半 乳 糖 醛 酸 酶 合 成 曲 線 3. 非 生 長(zhǎng) 偶 聯(lián) 型 （ 又 稱 滯 后 合 成 型 ） 只 有 當(dāng) 細(xì) 胞 生 長(zhǎng) 進(jìn) 入 平 衡 期 以 后 ， 酶 才 開(kāi) 始 合 成并 大 量 積 累 。 許 多 水 解 酶 的 生 物 合 成 都 屬 于 這 一 類 型 。特 點(diǎn) ： 受 分 解 代 謝 物 的 阻 遏 作 用 。 所 對(duì) 應(yīng) 的 mRNA穩(wěn) 定 性 高 。 c酶細(xì) 胞細(xì)胞或酶濃度 時(shí) 間 0 20 40 60 80010203040 50 酶 濃 度 細(xì) 胞 濃 度細(xì)胞濃度 (g/L) 時(shí) 間 (h) 01020304050 酶濃度 (U) 黑 曲 霉 酸 性 蛋 白 酶 合 成 曲 線 總 結(jié) ： 影 響 酶 生 物 合 成 模 式 的 主 要 因 素 高 ： 可 在 細(xì) 胞 停 止 生 長(zhǎng) 后 繼 1） mRNA的 穩(wěn) 定 性 續(xù) 合 成 酶 差 ： 隨 著 細(xì) 胞 停 止 生 長(zhǎng) 而 終 止 酶 的 合 成 2） 培 養(yǎng) 基 中 阻 遏 物 的 存 在 不 受 阻 遏 ： 隨 著 細(xì) 胞 的 生 長(zhǎng) 而 開(kāi) 始 酶 的 合 成 。 受 阻 遏 ： 細(xì) 胞 生 長(zhǎng) 一 段 時(shí) 間 或 平 衡 期 后 ， 酶 才 開(kāi) 始 合 成 。 酶 生 產(chǎn) 中 最 理 想 的 合 成 模 式 ：延 續(xù) 合 成 型 ： 發(fā) 酵 過(guò) 程 中 沒(méi) 有 生 長(zhǎng) 期 和 產(chǎn) 酶 期 的 明 顯差 別 。 細(xì) 胞 開(kāi) 始 生 長(zhǎng) 就 有 酶 的 產(chǎn) 生 ， 直 至 細(xì) 胞 生 長(zhǎng) 進(jìn)入 平 衡 期 后 ， 酶 還 可 以 繼 續(xù) 生 成 一 段 時(shí) 間 。 對(duì) 于 ：同 步 合 成 型 ： 提 高 對(duì) 應(yīng) 的 mRNA的 穩(wěn) 定 性 ， 如 降 低 發(fā) 酵 溫 度 。滯 后 合 成 型 ： 盡 量 減 少 甚 至 解 除 分 解 代 謝 物 阻 遏 ， 使 酶 的 合 成 提 早 開(kāi) 始 。中 期 合 成 型 ： 要 在 提 高 mRNA穩(wěn) 定 性 以 及 解 除 阻 遏 兩 方 面 努 力 。 (二 ) 產(chǎn) 酶 動(dòng) 力 學(xué)一 般 產(chǎn) 酶 動(dòng) 力 學(xué) 方 程 可 表 達(dá) 為 ： XdtdE 式 中 X 細(xì) 胞 濃 度 (g /L) 細(xì) 胞 比 生 長(zhǎng) 速 率 (h-1) 生 長(zhǎng) 偶 聯(lián) 的 比 產(chǎn) 酶 系 數(shù) (IU/g) 非 生 長(zhǎng) 偶 聯(lián) 的 比 產(chǎn) 酶 速 率 (IU/(gh) E 酶 濃 度 (IU/L) t 時(shí) 間 (h) 生 長(zhǎng) 偶 聯(lián) 型 XdtdE 部 分 生 長(zhǎng) 偶 聯(lián) 型 XXdtdE 非 生 長(zhǎng) 偶 聯(lián) 型 XdtdE 第 三 節(jié) 微 生 物 發(fā) 酵 產(chǎn) 酶 一 、 產(chǎn) 酶 微 生 物 的 分 離 和 選 育 1.優(yōu) 良 產(chǎn) 酶 菌 種 應(yīng) 具 備 的 條 件 （ 1） 酶 產(chǎn) 量 高 （ 2） 易 培 養(yǎng) （ 生 長(zhǎng) 速 率 高 、 營(yíng) 養(yǎng) 要 求 低 ） （ 3） 遺 傳 性 能 穩(wěn) 定 ， 不 易 退 化 （ 4） 易 分 離 提 純 （ 5） 安 全 可 靠 （ 不 是 致 病 菌 ） 2.常 用 的 產(chǎn) 酶 微 生 物Escherichia coli Pseudomonas Bacillus subtilis Micrococcus Streptococcus StreptomycesAspergillus nigerAspergillus oryzae MonascusPenicilliumTrichoderma Rhizopus Mucor Absidia Saccharomyces cerevisiae Candida 3. 產(chǎn) 酶 微 生 物 的 分 離 和 篩 選 1)樣 品 的 采 集 :從 富 含 該 酶 作 用 底 物 的 場(chǎng) 所 采 集 樣 品 2)富 集 培 養(yǎng) : 投 其 所 好 ， 取 其 所 抗 3)分 離 獲 得 微 生 物 的 純 培 養(yǎng) （ pure culture） 。 4)初 篩 ： 選 出 產(chǎn) 酶 菌 種 ， 以 多 為 主 。 5)復(fù) 篩 ： 選 出 產(chǎn) 酶 水 平 相 對(duì) 較 高 的 菌 株 ， 以 質(zhì) 為 主 。 -淀 粉 酶 的 篩 選 蛋 白 酶 產(chǎn) 生 菌 的 獲 得 方 法應(yīng)用含酪蛋白的培養(yǎng)基 4.產(chǎn) 酶 微 生 物 優(yōu) 良 菌 種 的 選 育 誘 變 育 種 原 生 質(zhì) 體 融 合 育 種 基 因 工 程 育 種 二 .微 生 物 發(fā) 酵 產(chǎn) 酶 方 法 1.固 體 培 養(yǎng) :特 別 適 合 于 霉 菌 培 養(yǎng) 2.液 體 培 養(yǎng) :目 前 酶 發(fā) 酵 生 產(chǎn) 的 主 要 方 式 3.固 定 化 細(xì) 胞 :需 要 特 殊 的 固 定 化 細(xì) 胞 反 應(yīng) 器 三 .微 生 物 酶 的 類 型 1.胞 外 酶 ： 大 多 是 水 解 酶 （ 如 淀 粉 酶 、 蛋 白 酶 、 纖 維 素 酶 、 果 膠 酶 ） ， 是 微 生 物 為 了 利 用 環(huán) 境 中 的大 分 子 而 釋 放 到 細(xì) 胞 外 的 ， 即 使 胞 外 濃 度 很 高 ， 胞內(nèi) 也 能 維 持 較 低 水 平 ， 受 到 的 調(diào) 節(jié) 控 制 少 。 2.胞 內(nèi) 酶 ： 指 合 成 后 仍 留 在 細(xì) 胞 內(nèi) 發(fā) 揮 作 用 的 酶 ，酶 活 性 和 濃 度 受 到 中 間 產(chǎn) 物 和 終 產(chǎn) 物 的 調(diào) 控 。 試 管 菌 種 培 養(yǎng) 茄 瓶 菌 種 培 養(yǎng) 搖 瓶 菌 種 培 養(yǎng) 孢 子 （ 菌 體 ） 懸 液 制 備 種 子 罐 菌 種 培 養(yǎng) 發(fā) 酵 罐 發(fā) 酵 發(fā) 酵 液 預(yù) 處 理 酶 的 分 離 純 化 精 制 酶 發(fā) 酵 生 產(chǎn) 的 一 般 工 藝 流 程 第 四 節(jié) 動(dòng) 、 植 物 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 產(chǎn) 酶 與 微 生 物 細(xì) 胞 相 比 ， 動(dòng) 物 細(xì) 胞和 植 物 細(xì) 胞 具 有 各 自 不 同 的 特 性 ，需 采 用 各 自 不 同 的 培 養(yǎng) 工 藝 。 動(dòng) 物 細(xì) 胞 模 式 圖 植 物 細(xì) 胞 結(jié) 構(gòu) 植 物 、 動(dòng) 物 、 微 生 物 細(xì) 胞 的 特 性 比 較細(xì) 胞 種 類 植 物 細(xì) 胞 微 生 物 細(xì) 胞 動(dòng) 物 細(xì) 胞細(xì) 胞 大 小 /um 200 300 1 10 10 100倍 增 時(shí) 間 /h 12 0.3-6 15營(yíng) 養(yǎng) 要 求 簡(jiǎn) 單 簡(jiǎn) 單 復(fù) 雜光 照 要 求 大 多 數(shù) 要 求 不 要 求 不 要 求對(duì) 剪 切 力 敏 感 大 多 數(shù) 不 敏 感 非 常 敏 感主 要 產(chǎn) 物 色 素 、 藥 物 、香 精 、 酶 等 醇 、 有 機(jī) 酸 、 氨基 酸 、 抗 生 素 、核 苷 酸 、 酶 等 疫 苗 、 激 素 、單 克 隆 抗 體 、酶 等 三 者 之 間 的 差 異 主 要 有 ：植 物 細(xì) 胞 動(dòng) 物 細(xì) 胞 微 生 物 細(xì) 胞 。動(dòng) 物 細(xì) 胞 、 植 物 細(xì) 胞 的 生 產(chǎn) 周 期 比 微 生 物 長(zhǎng) 。植 物 細(xì) 胞 和 微 生 物 細(xì) 胞 的 營(yíng) 養(yǎng) 要 求 較 簡(jiǎn) 單 。植 物 細(xì) 胞 的 生 長(zhǎng) 以 及 次 級(jí) 代 謝 物 的 生 產(chǎn) 要 求 一 定 的光 照 。植 物 細(xì) 胞 和 動(dòng) 物 細(xì) 胞 對(duì) 剪 切 力 敏 感 。植 物 、 微 生 物 和 動(dòng) 物 細(xì) 胞 的 主 要 目 的 產(chǎn) 物 各 不 相 同 。 一 、 植 物 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 產(chǎn) 酶 1.植 物 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 的 特 點(diǎn) 2.培 養(yǎng) 基 特 點(diǎn) 應(yīng) 用 最 廣 的 是 MS培 養(yǎng) 基 和 LS培 養(yǎng) 基 MS培 養(yǎng) 基 是 1962年 由 Murashinge和 Skoog為 煙 草 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 而 設(shè) 計(jì) 的 培 養(yǎng) 基 。 LS培 養(yǎng) 基 是在 其 基 礎(chǔ) 上 演 變 而 來(lái) 的 。 3.培 養(yǎng) 方 法 ： 懸 浮 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 細(xì) 胞 株 的 建 立 ； 外 植 體 與 愈 傷 組 織 擴(kuò) 大 培 養(yǎng) ； 大 罐 培 養(yǎng) ； 外 植 體 ： 從 植 株 取 出 ， 經(jīng) 過(guò) 預(yù) 處 理 后 ， 用 于 植 物 組織 培 養(yǎng) 的 植 物 組 織 （ 包 括 根 、 莖 、 葉 、 芽 、 花 、果 實(shí) 、 種 子 等 ） 的 片 段 或 小 塊 。愈 傷 組 織 ： 將 上 述 外 植 體 植 入 誘 導(dǎo) 培 養(yǎng) 基 中 ， 于 25左 右 培 養(yǎng) 一 段 時(shí) 間 ， 從 外 植 體 的 切 口 部 位 長(zhǎng) 出小 細(xì) 胞 團(tuán) 。 水 稻 的 外 植 體 （ 幼胚 ） 和 愈 傷 組 織外 植 體 愈 傷 組 織 4. 培 養(yǎng) 條 件 的 影 響 與 控 制（ 1） 溫 度（ 2） pH（ 3） 通 氣 與 攪 拌（ 4） 光 照 的 控 制（ 5） 前 體 的 添 加 （ 飼 喂 ）（ 6） 誘 導(dǎo) 子 （ elicitors） 的 應(yīng) 用 5.植 物 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 產(chǎn) 酶 實(shí) 例 以 大 蒜 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 生 產(chǎn) 超 氧 化 物 歧 化 酶 （ SOD） 為 例(1)大 蒜 愈 傷 組 織 的 誘 導(dǎo) 選 取 結(jié) 實(shí) 、 飽 滿 、 無(wú) 病 蟲(chóng) 害 的 大 蒜 蒜 瓣 ，去 除 外 皮 ， 先 用 70%乙 醇 消 毒 20s， 再 用 0.1%升汞 消 毒 10min， 然 后 無(wú) 菌 水 漂 洗 3次 。 在 無(wú) 菌 條 件 下 ， 切 成 0.5cm3的 小 塊 ， 植 入含 有 3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA 的 半 固 體 MS培 養(yǎng) 基 中 ， 在 25 ， 600lux， 12h/d光 照 條 件下 培 養(yǎng) 18d， 誘 導(dǎo) 得 到 愈 傷 組 織 ， 每 18天 繼 代一 次 。 (2)大 蒜 懸 浮 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 將 上 述 在 半 固 體 MS培 養(yǎng) 基 上 培 養(yǎng) 18d的 愈傷 組 織 ， 在 無(wú) 菌 條 件 下 轉(zhuǎn) 入 含 有 3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA （ 芐 基 腺 嘌 呤 ） 的 液 體 MS培 養(yǎng) 基 中 ， 加 入 滅 菌 的 玻 璃 珠 ， 25 ，600lux， 12h/d光 照 條 件 下 震 蕩 培 養(yǎng) 18d， 使愈 傷 組 織 分 散 成 為 小 細(xì) 胞 團(tuán) 或 單 細(xì) 胞 。 然 后 在 無(wú) 菌 條 件 下 ， 經(jīng) 過(guò) 篩 網(wǎng) 將 小 細(xì) 胞團(tuán) 或 單 細(xì) 胞 轉(zhuǎn) 入 含 有 3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA 的 液 體 MS培 養(yǎng) 基 中 ， 25 ,600lux，12h/d光 照 條 件 下 震 蕩 培 養(yǎng) 18d。 (3)酶 的 分 離 純 化 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 完 成 后 ， 收 集 細(xì) 胞 ， 經(jīng) 過(guò) 細(xì) 胞破 碎 、 提 取 、 分 離 得 到 超 氧 化 物 歧 化 酶 。 二 、 動(dòng) 物 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 產(chǎn) 酶 1.動(dòng) 物 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 的 特 點(diǎn)細(xì) 胞 生 長(zhǎng) 速 度 慢 。 （ 需 添 加 抗 生 素 ）細(xì) 胞 體 積 大 ， 無(wú) 細(xì) 胞 壁 保 護(hù) ， 對(duì) 剪 切 力 敏 感 。反 應(yīng) 過(guò) 程 成 本 高 ， 產(chǎn) 品 價(jià) 格 貴 。細(xì) 胞 具 有 錨 地 依 賴 性 。原 代 細(xì) 胞 一 般 繁 殖 50代 。 2.培 養(yǎng) 基 天 然 培 養(yǎng) 基 合 成 培 養(yǎng) 基 無(wú) 血 清 培 養(yǎng) 基 無(wú) 血 清 培 養(yǎng) 基 的 優(yōu) 點(diǎn) ： 提 高 了 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 的 可 重 復(fù) 性 ， 避 免 了 血 清 批 次 之 間 差 異 的影 響 。 減 少 了 由 血 清 帶 來(lái) 的 病 毒 、 真 菌 如 支 原 體 等 微 生 物 污 染 的危 險(xiǎn) 。 供 應(yīng) 充 足 穩(wěn) 定 。 細(xì) 胞 產(chǎn) 品 易 于 優(yōu) 化 。 避 免 了 血 清 中 某 些 因 素 對(duì) 細(xì) 胞 的 毒 性 。 減 少 了 血 清 中 蛋 白 對(duì) 某 些 生 物 測(cè) 定 的 干 擾 。 3.培 養(yǎng) 方 法 (1)懸 浮 培 養(yǎng) (suspension culture)(2)貼 壁 培 養(yǎng) (anchorage-dependent culture)(3)貼 壁 懸 浮 培 養(yǎng) (pseudo-suspension culture) 微 載 體 培 養(yǎng) (microcarrier culture) 包 埋 (entrapment)和 微 囊 (microencapsulation)培 養(yǎng) 結(jié) 團(tuán) 培 養(yǎng) (aggregate culture) n 懸 浮 培 養(yǎng) 讓 細(xì) 胞 自 由 的 懸 浮 于 培 養(yǎng) 基 內(nèi) 生 長(zhǎng)繁 殖 的 培 養(yǎng) 方 法 。 優(yōu) 點(diǎn) ： 操 作 簡(jiǎn) 單 ， 培 養(yǎng) 條 件 均 一 ， 保質(zhì) 供 氧 好 ， 容 易 擴(kuò) 大 培 養(yǎng) 規(guī) 模 。 但 對(duì) 于大 多 數(shù) 具 有 錨 地 依 賴 性 的 動(dòng) 物 細(xì) 胞 ， 不能 采 用 懸 浮 培 養(yǎng) 方 式 。 n 貼 壁 培 養(yǎng) 讓 細(xì) 胞 貼 附 在 某 種 基 質(zhì) 上 生 長(zhǎng) 繁 殖 的培 養(yǎng) 方 式 。 優(yōu) 點(diǎn) 與 懸 浮 培 養(yǎng) 正 好 相 反 。 缺 點(diǎn) ： 操 作 麻 煩 ， 需 要 合 適 的 貼 附 材料 和 足 夠 的 面 積 ， 培 養(yǎng) 條 件 不 易 均 一 ，保 質(zhì) 和 供 氧 較 差 。 n 貼 壁 懸 浮 培 養(yǎng)n 又 稱 假 懸 浮 培 養(yǎng) ， 將 懸 浮 培 養(yǎng) 和 貼 壁 培養(yǎng) 巧 妙 結(jié) 合 的 培 養(yǎng) 方 法 ， 包 括 ： n a、 微 載 體 培 養(yǎng) (microcarrier culture)n 將 葡 聚 糖 等 微 小 顆 粒 加 入 到 培 養(yǎng) 基 ， 動(dòng)物 細(xì) 胞 可 貼 附 在 顆 粒 表 面 生 長(zhǎng) 。n 特 點(diǎn) ： 貼 附 面 積 大 ， 供 細(xì) 胞 貼 附 生 長(zhǎng) 繁殖 ； 載 體 體 積 小 ， 比 重 輕 ， 可 懸 浮 在 培養(yǎng) 基 內(nèi) 。 n b、 包 埋 (entrapment)和 微 囊(microencapsulation)培 養(yǎng) 與 微 載 體 的 不 同 之 處 ： 細(xì) 胞 不 是 貼 附 在 載體 表 面 ， 而 是 被 包 埋 或 包 裹 在 凝 膠 載 體 內(nèi) 。 優(yōu) 點(diǎn) ： 保 護(hù) 細(xì) 胞 免 受 剪 切 力 的 損 害 ； 實(shí) 現(xiàn)動(dòng) 物 細(xì) 胞 高 密 度 大 規(guī) 模 培 養(yǎng) ； 有 利 于 下 游 產(chǎn)物 純 化 。n c、 結(jié) 團(tuán) 培 養(yǎng) (aggregate culture) 利 用 細(xì) 胞 本 身 作 為 基 質(zhì) ， 相 互 貼 附 后 ， 再用 懸 浮 法 培 養(yǎng) 。 優(yōu) 點(diǎn) ： 操 作 簡(jiǎn) 便 ， 節(jié) 省 了 用 微 載 體 的 成 本 。 4.培 養(yǎng) 條 件 的 影 響 與 控 制（ 1） 溫 度 ： 一 般 控 制 在 36.5 .（ 2） pH值 ： 一 般 控 制 在 7.0-7.6的 微 堿 性 范 圍 內(nèi) 。（ 3） 滲 透 壓 : 應(yīng) 與 細(xì) 胞 內(nèi) 滲 透 壓 相 同 。（ 4） 溶 解 氧 ： 根 據(jù) 情 況 隨 時(shí) 調(diào) 節(jié) 。 思 考 題 ：1. 簡(jiǎn) 述 轉(zhuǎn) 錄 與 翻 譯 過(guò) 程 。2. 用 操 縱 子 模 型 解 釋 酶 的 誘 導(dǎo) 與 阻 遏 機(jī) 制 （ 末 端 產(chǎn) 物 、分 解 代 謝 產(chǎn) 物 ）3. 根 據(jù) 酶 生 物 合 成 的 調(diào) 節(jié) 類 型 及 機(jī) 制 說(shuō) 明 如 何 提 高 酶的 產(chǎn) 量 。4. 酶 生 物 合 成 的 模 式 及 影 響 因 素 。5. 優(yōu) 良 產(chǎn) 酶 微 生 物 菌 種 的 獲 得 途 徑 及 各 自 特 點(diǎn) （ 自 己整 理 ） 。6. 比 較 動(dòng) 物 植 物 和 微 生 物 在 細(xì) 胞 結(jié) 構(gòu) 、 培 養(yǎng) 基 和 培 養(yǎng)方 式 上 的 不 同 。7. 一 些 概 念 的 區(qū) 別 ： 操 縱 子 與 操 縱 基 因 、 誘 導(dǎo) 酶 與組 成 酶 、 胞 內(nèi) 酶 與 胞 外 酶 、 外 植 體 與 愈 傷 組 織 、 初 篩與 復(fù) 篩