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1、單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,#,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,#,檸檬酸發(fā)酵機(jī)制,重點(diǎn)：,檸檬酸生物合成途徑；檸檬酸生物合成的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制。,難點(diǎn)：,檸檬酸生物合成的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制。,1,一、檸檬酸簡介,檸檬酸又名枸櫞酸，學(xué)名,-,羥基丙烷三羧酸，是生物體主要代謝產(chǎn)物之一。化學(xué)名稱,2-,羥基丙三羧酸，英文文獻(xiàn)俗名,citric acid,，分子式,C,6,H,8,O,7,。無色或白色晶體，無臭，味極酸，易溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反應(yīng)。,第一節(jié) 概述,2,食品工業(yè)：,酸味劑
2、、增溶劑、抗氧化劑，除腥脫臭劑；,醫(yī)藥工業(yè)：,化學(xué)工業(yè)：,美容品、化妝品,二、檸檬酸及其鹽的應(yīng)用概況,3,三、我國檸檬酸生產(chǎn)現(xiàn)狀,生產(chǎn)狀況：,60,年代開始，生產(chǎn)檸檬酸年總產(chǎn)量居世界第一，出口量一直占國內(nèi)總產(chǎn)量的,50%,以上。目前，生產(chǎn)廠家近百家，萬噸級以上的有,6,家。主要有,安徽豐原生物化學(xué)集團(tuán)公司,（生產(chǎn)能力為,12.0,萬噸,/,年）、,江蘇無錫羅氏中亞檸檬酸有限公司,（生產(chǎn)能力為,4.0,萬噸,/,年）、,安徽華源生物藥業(yè)有限公司,（生產(chǎn)能力為,3.5,萬噸,/,年）等。,存在問題：,出口量增長過快，技術(shù)創(chuàng)新相對滯后，加上國際市場競爭激烈，已出現(xiàn)嚴(yán)重的供大于求的局面，設(shè)備利用率不到
3、,60%,，行業(yè)經(jīng)濟(jì)效益呈滑坡態(tài)勢。,4,5,第二節(jié) 檸檬酸合成途徑與代謝調(diào)控,1940,年，,Krebs:TCA,；,1953,年，,Jagnnathan,證實(shí)黑曲霉中存在,EMP,途徑所有酶；,1954,年，,Shu,提出葡萄糖,80%,經(jīng),EMP,途徑代謝；,1954-1955,年，,Ramakrishman,等發(fā)現(xiàn)黑曲霉中存在,TCA,循環(huán)。,一、檸檬酸合成途徑的發(fā)現(xiàn),6,二、黑曲霉檸檬酸生物合成途徑,7,黑曲霉利用糖類發(fā)酵生成檸檬酸其生物合成途徑是，葡萄糖經(jīng),EMP,、,HMP,途徑降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脫羧生成乙酰,CoA,，另一方面經(jīng),CO,2,固定化反應(yīng)生成草酰乙酸，
4、草酰乙酸與乙酰,CoA,縮合生成檸檬酸。,(1),生長期與產(chǎn)酸期都存在,EMP,與,HMP,途徑，前者,EMP:HMP=2:1,，后者,EMP:HMP=4,：,1,(2),黑曲霉檸檬酸產(chǎn)生菌中存在,TCA,循環(huán)與乙醛酸循環(huán)，在以糖質(zhì)原料發(fā)酵時，當(dāng)檸檬酸積累時，,TCA,和乙醛酸循環(huán)被,阻斷或減弱,。,(3),由于,TCA,和乙醛酸循環(huán)被阻斷或減弱，,草酰乙酸,是由丙酮酸（,PYR,）或磷酸烯醇式丙酮酸（,PEP,）羧化生成的。即由兩個,CO,2,固定化反應(yīng)體系，其中以丙酮酸羧化酶作用下固定化,CO,2,生成草酰乙酸為主。,8,三、檸檬酸生物合成的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制,9,1,、磷酸果糖激酶（,PFK,
5、）：,（一）糖酵解及丙酮酸代謝的調(diào)節(jié),Mn,2+,濃度對磷酸果糖激酶的影響,Mn,2+,缺乏為何會使,NH,4,+,濃度升高呢,？,當(dāng)培養(yǎng)基中,Mn,2+,缺乏時，微生物體內(nèi)積累幾種氨基酸（,GA,、,GLu,、,Arg,、,Oin,等），這些氨基酸的積累，意味著體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成受阻，而外源蛋白質(zhì)的分解速度則不受到影響，這樣,NH,4,+,的消耗下降，,NH,4,+,濃度就會升高。,10,2,、丙酮酸羧化酶：,催化生成草酰乙酸。,3,、丙酮酸脫氫酶：,催化生成乙酰,CoA,11,（二）三羧酸循環(huán)的調(diào)節(jié),1,、檸檬酸合成酶的調(diào)節(jié)：,檸檬酸合成酶是,TCA,循環(huán)第一個酶。但黑曲霉中檸檬酸合成酶沒有
6、調(diào)節(jié)作用。,2,、順烏頭酸水合酶、異檸檬酸脫氫酶的調(diào)節(jié)：,順烏頭酸水合酶、,NAD,和,NADP-,異檸檬酸脫氫酶,在檸檬酸產(chǎn)生與不產(chǎn)生時，這,3,種酶均存在，而當(dāng)銅離子,0.3mg/L,，鐵離子,2mg/L,和,pH2.0,情況下，這,3,種酶均不出現(xiàn)活力，發(fā)酵中檸檬酸正是在這個,pH,條件下積累的。,順烏頭酸水合酶,是催化檸檬酸,順烏頭酸,異檸檬酸正逆反應(yīng)的酶，研究表明，黑曲霉中有一種單純的位于線粒體上的順烏頭酸水合酶，它在催化時能建立下面的平衡：檸檬酸,:,順烏頭酸,:,異檸檬酸,90:3:7,。,12,3,、,-,酮戊二酸脫氫酶的調(diào)節(jié),在黑曲霉檸檬酸產(chǎn)生菌中，,TCA,循環(huán)的一個顯著特
7、點(diǎn)是，,-,酮戊二酸脫氫酶的合成受葡萄糖和銨離子的阻遏。因此當(dāng)以葡萄糖為碳源時，在檸檬酸生成期，菌體內(nèi)不存在,-,酮戊二酸脫氫酶或活力很低。,-,酮戊二酸脫氫酶催化的反應(yīng)是,TCA,循環(huán)中唯一不可逆反應(yīng)，一旦,-,酮戊二酸脫氫酶喪失，就會引起：,TCA,循環(huán)中的蘋果酸、富馬酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆,TCA,循環(huán)生成，使,TCA,循環(huán)成,“,馬蹄形,”,。,-,酮戊二酸又抑制異檸檬酸脫氫酶的活性。,13,(,三,),氧對檸檬酸積累的調(diào)節(jié),乙酰,CoA,和草酰乙酸結(jié)合生成檸檬酸過程中要引進(jìn)一個氧原子，因此氧也可以看作為檸檬酸生物合成底物。它對檸檬酸發(fā)酵的作用為：,(1),氧是發(fā)酵過程生成的,NAD
8、H2,重新氧化的氫受體。,(2),近來的研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉中除了具有一條標(biāo)準(zhǔn)呼吸鏈以外，還有一條側(cè)系呼吸鏈。,當(dāng)缺氧時，只要很短時間中斷供氧，就會導(dǎo)致此側(cè)系呼吸鏈的不可逆失活，而導(dǎo)致檸檬酸產(chǎn)酸急劇下降。,14,（四）乙醛酸循環(huán)與醋酸發(fā)酵檸檬酸,乙醇,乙酸,3,醋酸,1,檸檬酸,生成的檸檬酸一半轉(zhuǎn)化為異檸檬酸,酵母,N,源耗盡后開始烷烴發(fā)酵，低濃度,AMP,抑制,NAD-,異檸檬酸脫氫酶的活性，檸檬酸大量合成并積累。此時順烏頭酸水合酶催化反應(yīng)平衡為：檸檬酸：異檸檬酸：順烏頭酸,=90,：,7,：,3,。細(xì)胞質(zhì)中積累大量異檸檬酸。,15,Mn,2+,缺乏抑制蛋白合成,NH,4,+,，有一條呼吸活動強(qiáng)
9、的不產(chǎn)生,ATP,的側(cè)呼吸鏈：,解除磷酸果糖激酶的代謝調(diào)節(jié),，,促進(jìn),EMP,途徑暢通。,丙酮酸羧化酶是組成型酶，不被調(diào)節(jié)控制。丙酮酸氧化脫羧生成乙酰,CoA,和,CO,2,的固定兩個反應(yīng)的平衡，以及檸檬酸合成酶不被調(diào)節(jié)，增強(qiáng)了合成檸檬酸的能力。,小結(jié)：,順烏頭酸水合酶在催化時建立了以下平衡：,檸檬酸：順烏頭酸：異檸檬酸,=90,：,3,：,7,同時控制,Fe,2+,含量時，順烏頭酸酶活力降低，使檸檬酸積累。,隨著檸檬酸積累，,pH,降低到一定程度時，使順烏頭酸酶和異檸檬酸脫氫酶失活，更有利于檸檬酸的積累。,16,（五）檸檬酸發(fā)酵的產(chǎn)率,1,、無,CO,2,固定反應(yīng)的產(chǎn)率,合成,1,分子檸檬酸
10、需要,3,分子乙酰輔酶,A,，也就是需要,1.5,分子的葡萄糖。,理論產(chǎn)率為：,192/(1801.5)=71.1%,17,2,、通過,CO,2,固定反應(yīng)提供,C,4,二羧酸,18,四、檸檬酸發(fā)酵過程的控制要點(diǎn),（,1,）控制,Mn,2+,、,NH,4,+,濃度，解除檸檬酸對,PFK,的抑制，使,EMP,暢通無阻。,（,3,）控制培養(yǎng)基中的,Fe,2+,的濃度，使順烏頭酸水合酶失活。,（,2,）控制溶氧，防止側(cè)系呼吸鏈?zhǔn)Щ睢?19,五、檸檬酸產(chǎn)生菌育種的傳統(tǒng)方法：,1.,透明圈大的菌株,平板：,10%,甘薯,+2%,的瓊脂,+0.5%CaCO,3,誘變后，涂布，透明圈大的則好,2.,顯色圈大小
11、,平板：麥汁培養(yǎng)基,+pH,值指示劑 誘變后，,33,培養(yǎng),3,天，透明圈大的則好。,20,3.,不分解檸檬酸的菌株,不利用檸檬酸為碳源的菌株，說明其,TCA,循環(huán)中檸檬酸后續(xù)酶的活性較低，或者喪失，這有利于積累檸檬酸。方法：以檸檬酸為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長不好的突變株。,4.,選育不長孢子、少長孢子、遲長孢子的菌株,在培養(yǎng)基中如果菌株能夠大量合成積累檸檬酸，自然會使,TCA,循環(huán)中的中間產(chǎn)物濃度降低，這樣不利于孢子的形成。,（為何？中間產(chǎn)物少，,C,架少，不利于合成代謝,）,21,思考題,1.,檸檬酸發(fā)酵過程中有哪幾個控制要點(diǎn)，如何控制？,2.,說明檸檬酸發(fā)酵過程中氧的重要性。,3.,簡述二氧化碳固定反應(yīng)對提高檸檬酸產(chǎn)率的意義。,22,
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