【基金標書】2010CB945600-組織干細胞的干性維持、分化控制和免疫調節(jié)研究

項目名稱： 組織干細胞的干性維持、分化控制和免疫調節(jié)研究首席科學家： 時玉舫 中國科學院上海生命科學研究院起止年限： 2010 年 1 月-2014 年 8 月依托部門： 中國科學院 上海市科委一、研究內(nèi)容1、組織干細胞靜息和活化狀態(tài)的轉換及多潛能性研究研究干細胞靜息和活化狀態(tài)的轉換，評價其分化的多潛能性，以認識組織干細胞的干性維持機制。擬應 用已知的可能的組織干細胞的標志，制備組織干細胞遺傳標記小鼠模型或進行離體標記，以顯微切割系統(tǒng)進行單細胞水平的分離，利用已建立的組織干細胞長期培養(yǎng)觀察系統(tǒng)進行培養(yǎng)觀察，借助 SOLiD TM 技術平臺對組織干細胞進行單細胞表達譜分析，以識別和鑒定組織干細胞，識別靜息和活化的組織干細胞的特征， 發(fā)現(xiàn)不同狀態(tài)下組織干細胞的特異性分子標志，掌握靜息和活化狀態(tài)轉換的分子機制；研究免疫因子對組織干細胞干性維持的影響及其機制；通過比較不同階段的多潛能干細胞和單潛能前體細胞的 mRNA 和蛋白質表達譜以及表觀遺傳學譜，確定組織干細胞在遺傳及表觀遺傳方面的特性標志，分析維持組織干細胞多潛能性的遺傳和表觀遺傳作用機制，揭示組織干細胞干性維持的規(guī)律。2、組織干細胞分化啟動和分化定向研究研究分化啟動關鍵因子、抑分化因子和促分化因子平衡、免疫因子與分化的相關性、分化過程的階段特性，以及異位再殖的分化特性。擬采用活體組織中干細胞遺傳標記及其譜系示蹤模型小鼠，制 備組織干細胞分化模型，在不同的時間點（即不同的分化階段）直接從活體中采取標記細胞和組織標 本，采用原位和離體的方法對組織干細胞分化活動的過程及其調控進行具有 時空特性的綜合研究，其中包括：組織干細胞分化進程中結構空間特性的認識 、不同分化階段特征的鑒別、分化啟動和分化定向關 鍵調控因子的鑒定。在此基礎上，也 進行不同胚層來源的組織的組織干細胞之間的比較研究，以 認識分化事件 調控的基本規(guī)律。3、組織干細胞分化的遺傳及表觀遺傳調控機制研究研究與組織干細胞分化相關的關鍵因子的遺傳和表觀遺傳調控機制，加深對組織干細胞分化調控基本規(guī)律的認識。擬采用遺傳學和表 觀遺傳學研究體系，探討已知的表觀調控因子（包括組蛋白修飾分子、染色 質 重塑分子和 microRNA）的生物學功能和作用機制；發(fā)現(xiàn)和鑒定新的表觀遺傳調 控因子及其作用機制；研究免疫因子對組織干細胞分化的遺傳及表觀遺傳調節(jié)的影響及其機制；運用生物信息學方法，整合不同層次的數(shù)據(jù)（ mRNA、轉錄因子、microRNA 和表觀遺傳調控相關分子），探索組織干細胞分化調控規(guī)律， 為干預組織干細胞的分化提供依據(jù)。4、組織干細胞免疫調節(jié)研究研究組織干細胞的免疫生物學特性及機體免疫因素對組織干細胞的調控。擬利用功能基因組和蛋白質基因組高通量平臺分析不同狀 態(tài)和階段的組織干細胞免疫相關分子表達差異，明確組織干細胞免疫相關分子及其功能的 識別和鑒定標志，研究免疫因子對組織 干細胞干性維持、分化和免疫功能的影響， 發(fā)現(xiàn)關鍵的免疫調控因子及其作用機制。 進而在組織損傷和疾病 動物模型中，研究機體微環(huán)境免疫因素對植入和內(nèi)在的組織干細胞的激活、 動員 、向損傷靶組織定向遷移、分化、生長 和凋亡的作用及其機制， 發(fā)現(xiàn)干預調 控靶點。研究組織干細胞移植對組織損傷和疾病動物的免疫影響和損傷修復作用，同時也研究間充質干細胞等移植可能產(chǎn)生的副作用，并研究 組織干細胞移植的免疫排斥及可能的干 預手段，探討組織干細胞移植修復治 療及再生醫(yī)學的新策略。二、預期目標總體目標以發(fā)現(xiàn)組織干細胞生物學的基本規(guī)律，發(fā)展精準調控組織干細胞的新策略，并將其應用于修復組織和治療疾病為最終目標。本著“突出我國 領域優(yōu)勢，著重解決符合重大需求的關 鍵問題、瞄準國際基礎理論前沿” 的原則，立足于中國科學院干細胞重點 實驗室和上海干細胞研究所，并在我們研究已取得重要突破的基礎上，利用項目組具有特色的技術平臺和研究體系，研究組織干細胞發(fā) 育的多潛能性、分化 調控 過程及其與機體免疫的交互作用，多層次地分析組織干 細胞干性維持，分化啟 動 及分化調控、免疫 調控等關鍵制動節(jié)點。以期闡明組織 干細胞干性維持、分化啟動和分化定向的關鍵分子機制，確定其干預調控靶點，深入理解組織干細胞調控網(wǎng) 絡。 認識組織干細胞與機體免疫交互作用的規(guī)律，為組織干細胞安全有效地應用于組織修復和疾病治療，提供重要理論基礎和技術支撐。進一步加快我國干細胞研究與再生醫(yī)學、免疫和分子遺傳等領域的銜接和交叉，形成高水平的學術研究人才梯隊。五年目標與預期突破：1、確定組織干細胞靜息及活化狀態(tài)的識別標志，揭示組織干細胞干性維持的規(guī)律建立組織干細胞靜息和活化狀態(tài)的指紋圖譜，確定組織干細胞的細胞編程差異及干細胞靜息與活化狀態(tài)的識別標志，發(fā)現(xiàn)組織干細胞共性及特性標志。研究并發(fā)現(xiàn)調控組織干細胞靜息與活化狀態(tài)的關鍵因子及多潛能性維持的遺傳及表觀遺傳規(guī)律。并揭示不同 組織的組織干細胞及其在體外和體內(nèi)環(huán)境下干性維持的異同。通過對組織干細 胞活化異常的干預研究，為干細胞療法提供新的藥物靶標。2、發(fā)現(xiàn)組織干細胞分化啟動和分化定向的關鍵調控因子，明晰組織干細胞分化途徑建立組織干細胞的遺傳標記和分化譜系示蹤的技術體系，實現(xiàn)分化階段的劃分及其 mRNA、microRNA 和蛋白質水平指紋圖譜的建立，發(fā)現(xiàn)分化啟動及其后續(xù)各主要分化階段的關鍵調控因子，并繪制可以反映主要分化方向和主要分化等級的分子“ 分化樹” ，以豐富組織干細胞的分化過程及其分化調控分子基礎方面的知識體系，進而為活體中組織干細胞分化行為人為干預體系的建立提供理論基礎。3、闡明組織干細胞分化的遺傳和表觀遺傳調控機制，認識組織干細胞分化調控規(guī)律闡明與組織干細胞分化相關的關鍵因子的遺傳和表觀遺傳調控機制；發(fā)現(xiàn)和鑒定新的表觀遺傳調控分子；整合不同層次的數(shù)據(jù)（mRNA 、轉錄因子、microRNA 和表 觀遺傳調 控相關分子）， 認識組織干 細胞分化調控網(wǎng)絡。為干預組織干細胞的分化提供依據(jù)。4、闡明組織干細胞與機體免疫因素的相互作用影響，提供組織干細胞移植治療的免疫評價指標和免疫調節(jié)新策略篩選并確定組織干細胞特異性表達的免疫相關分子，建立組織干細胞免疫學功能的識別鑒定體系，發(fā)現(xiàn)調控組織干細胞免疫功能的關鍵因子。建立研究組織干細胞遷移的技術體系， 認識組織干細胞遷移的特征。闡明組織干細胞與機體免疫因素的相互作用及其分子機制，發(fā)現(xiàn)免疫干預調節(jié)的關鍵靶點，提供免疫調節(jié)新策略。基于以上目標，本項目將發(fā)表 SCI 收錄的學術論文 100 篇以上，其中在相關領域的國際權威刊物上發(fā)表論文 30 篇以上，申報發(fā)明專利 30 項，取得具有國際影響的原創(chuàng)性成果 3-5 項，培養(yǎng)碩博士研究生 30-50 名；并形成組織干細胞領域的杰出人才梯隊。三、研究方案學術思路本項目針對制約組織干細胞研究和應用的理論瓶頸問題，以“ 確定組織干細胞靜息狀態(tài)、活化狀態(tài)及分化 過程的識別標志、揭示組織干細胞干性維持的規(guī)律、認識組織干細胞分化啟動和分化定向的機制、闡明組織干細胞分化的調控網(wǎng)絡及其遺傳和表觀遺傳機制和建立組織干細胞移植修復治療中免疫影響的評價和調控體系”為 研究目標，集成細胞和分子生物學、表觀遺傳學、基因組學、轉錄組學、蛋白質組學及生物影像學、免疫學、生物信息學等優(yōu)勢學科力量，開展多學科交叉綜合性研究，集中攻關關鍵科學問題。依據(jù) 組織 干細胞生物學活動的過程，以研究組織干細胞靜息和活化狀態(tài)的轉換及多潛能性為起點，探索組織干細胞分化啟動和分化定向的關鍵分子和靶點、分化調控網(wǎng)絡及其遺傳和表觀遺傳調控機制，進而研究組織干細 胞與機體免疫的相互作用，以深入理解組織干細胞分化調控的基本規(guī)律以及組織干細胞移植的免疫調控機制，為組織干細胞臨床應用奠定重要理論基礎。技術途徑1. 利用相關組織干細胞的分子標志，建立組織干細胞遺傳標記的基因工程小鼠品系，以形成活體組織遺傳標記和分化譜系示蹤的研究平臺。2. 采用已建立的細胞顯微成像技術、單細胞激光捕獲技術和單細胞表達譜研究分析平臺系統(tǒng)，在單細胞水平對組織干細胞進行識別鑒定、靜息與活化狀態(tài)轉換和多潛能性維持機制的研究。3. 利用組織干細胞遺傳標記的基因工程小鼠品系，制備相應的分化模型，在不同的時間點直接從體內(nèi)采取標記細胞及相應的組織標本進行mRNA、microRNA、蛋白質 、細胞及組織水平的分析。進而利用 RNA 干擾和基因敲除的技術體系，研究所發(fā)現(xiàn)的關鍵分子在組織干細胞分化中的作用。4. 采用 ChIP-chip (seq)、MeDIP-chip (seq)技術和 microRNA 深度測序技術分析不同組織干細胞表觀遺傳差異，建立它們的表觀遺傳指紋圖譜，進而達到對其進行識別和鑒定的目的。5. 通過 DNA 甲基化檢測、染色質免疫共沉淀、組蛋白密碼分析、染色質重塑分子基因敲除等方法，探討 DNA 甲基化、組蛋白修飾和染色質重塑等表觀遺傳調控在組織干細胞分化中的作用。6. 運用生物信息學方法，整合不同層次的數(shù)據(jù)（mRNA 、轉錄因子、microRNA和表觀遺傳調控相關分子），認識組織干細胞分化相關的調控網(wǎng)絡。7. 利用功能基因組和蛋白質組高通量分析平臺，建立組織干細胞免疫學功能的識別鑒定體系。運用趨化因子及其受體分析平臺，研究組織干細胞的遷移特征與分子調控機制。8. 利用多種組織損傷和疾病動物模型，研究組織干細胞移植的免疫影響和損傷修復作用，同時研究組織損傷和疾病狀態(tài)時，機體免疫因素對組織干細胞的免疫相關分子表達、動員、激活、趨化遷移、分化、生長和凋亡等的影響。以上各研究內(nèi)容相對獨立，而同時密切配合，交叉互用，形成一個有機整體。創(chuàng)新點和特色：本項目針對組織干細胞的干性維持、分化啟動、分化定向和組織干細胞與機體微環(huán)境之間的相互影響等關鍵科學問題進行系統(tǒng)研究，其在理論上和技術上的創(chuàng)新與特色，主要體現(xiàn)在以下幾個方面：1、靜息狀態(tài)組織干細胞的基本特性。采用已建立的組織干細胞遺傳標記技術體系， 結合先進的細胞成像技術、 單細胞激光捕獲 技術，以及 SOLiD TM單細胞表達譜研究分析平臺系統(tǒng)，構建靜息與活化狀態(tài)的組織干細胞的指紋圖譜，探尋可用于其識別和鑒定的特異性分子標志，以此進一步探討和闡明組織干細胞靜息和活化狀態(tài)相互轉換和組織干細胞多潛能性維持的分子基礎與調控機制。同時結合上述研究，采用組織 干細胞體外培養(yǎng)體系， 進 一步探討組織干細胞體內(nèi)及體外的生物學行為異同性。2、活體組織干細胞分化行為的時空特性。采用基于 Cre-loxP 的基因工程小鼠技術體系，進行組織干細 胞活體內(nèi)遺傳標記，及其后續(xù)分化譜系的示蹤。并采用原位和離體的分析技術，建立不同分化階段的指紋圖譜，探尋組織干細胞分化啟動和分化定向的關鍵調控因子，繪制組織干細胞“ 分化樹”，從時間和空間的角度，解析組織干細胞分化過 程及其調控作用的分子基礎。同時也進行體外組織干細胞分化的研究，進一步分析 組織干細胞體內(nèi)、體外分化行為的特點。3、組織干細胞分化調控的基本規(guī)律。 采用遺傳學、表觀遺傳學和生物信息學的研究體系，探討調控組織 干細胞分化啟動和分化定向等的關鍵因子及作用機制。進而整合不同角度的研究數(shù)據(jù)（mRNA 、轉錄因子、microRNA 和表觀遺傳調控相關分子），認識組織干細胞分化調控網(wǎng)絡，探索組織干細胞分化調控機制的基本規(guī)律，為干預組織干細胞分化提供依據(jù)。4、組織干細胞與機體微環(huán)境的交互作用。 結合研究組織干細胞對機體修復和免疫調控作用，同時觀察機體局部微環(huán)境對前者分化發(fā)育和功能的調控影響，是本項目的又一新特色。在此基礎上， 進一步圍繞免疫微環(huán)境對組織干細胞的遷移和募集作用，研究病生理狀態(tài)下， 趨化因子及其受體以及黏附分子等對組織干細胞的動員和招募調控機制，構建組織干細胞趨化因子受體表達譜，以此進一步分析組織干細胞的靶向趨化效應。通過上述幾個關鍵問題的研究，若達預期目標，本 項目不僅突顯了在組織干細胞生物學研究領域的原創(chuàng)性，也將豐富和充實干細胞生物學的知識體系，為組織干細胞在細胞治療和再生醫(yī)學中的應用奠定新的理論基礎?？尚行苑治霰卷椖恳罁?jù)組織干細胞最新研究動態(tài)和發(fā)展前景，立足于已有工作基礎和技術平臺， 圍繞“ 組織干細胞的干性 維持、分化控制及免疫調節(jié)”的重大科學問題，經(jīng)過充分科學論證，展開系 統(tǒng)研究，從而保證該項目的立項和實施的可行性。1、研究隊伍：本項目組成員均為來自國家及部門干細胞等重點實驗室的科研一線優(yōu)秀中青年專家，已在干細胞、免疫學、細胞和分子生物學以及 結構和功能基因組學研究等方面取得了具有國際影響力的學術成績。擬推薦的首席科學家時玉舫教授是中央組織部首批“引進海外高層次人才” ，各課題負責人也都在組織干細胞領域有突出成就，承擔和完成了多項國家、省部級的相關研究課題， 有深厚的研究造詣和豐富的課題管理經(jīng)驗。2、工作積累：本項目組成員多年從事干細胞及相關領域的系統(tǒng)研究，具有較豐富的工作積累和取得了一批重要的創(chuàng)新突破，為本項目的實施奠定了堅實的基礎。在國 際上首次分離培養(yǎng)了鼠肝干 細胞系， 證明了其具有肝向和膽向分化的潛能，以及再殖損傷肝臟的能力（ Stem Cells. 2006, 24: 322），在此基礎上，進一步發(fā)現(xiàn)和提出了其肝向分化啟動的“開關效應” 學說；首先在 側腦室的室管層中發(fā)現(xiàn)了處于分化上游（靜息活化期）的神經(jīng)干細胞的存在，并確定其特異性的分子標志（Proceedings of the National Academy of Sciences. 2008, 105: 1026)；采用構建基因剔除動物模型和基因芯片等方法，發(fā)現(xiàn)了一批干性維持、自我更新和分化相關基因（Blood. 2009, 113: 1455；Frontiers in Bioscience. 2007, 12: 1691；Journal of Cellular Biochemistry. 2009, 106: 16）。發(fā)現(xiàn)人的胚胎干細胞的基因拷貝數(shù)指紋圖譜在體外培養(yǎng)和分化中可以保持穩(wěn)定（Stem Cells. 2008, 26: 1484）。這些工作積累為本項目的課題設定和深入研究提供了科學保障。發(fā)現(xiàn)影響不同的人胚胎干細胞株分化方向的不同表觀遺傳特征（Proceedings of the National Academy of Sciences. 2007, 104: 13821）。利用 遺傳和表觀遺傳技術平臺，揭示了細胞凋亡調 控基因 TIP30 調控下游基因表達的分子機制（Hepatology. 2008, 48: 265；Cancer Research. 2008, 68: 4133；Clinical Cancer Research. 2008, 14: 7405）。通 過對神經(jīng)元中甲基化 CpG 結合蛋白 MeCP2 的功能研究，首次確定其結合靶基因 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因 BDNF（Science. 2003, 302: 890）。這些表觀遺傳領 域的研究成果為本項目的 實施提供了豐富知識積累。首先發(fā)現(xiàn)間充質干細胞免疫調控的體內(nèi)作用機制（Cell Stem Cell. 2008, 2: 141）及免疫因子誘導干細胞產(chǎn)生細胞生長因子（Stem Cells. 2009, In press）促進了對干細胞的全新認識。早在 1989 年即提出了激活誘導細胞死亡的重要學說（Nature. 1989, 339: 625）。首次成功地在體外用胚胎肝造血干細胞誘導分化了樹突狀細胞（dendritic cells，DC），并發(fā)現(xiàn)胚胎時期 DC 和自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）細胞分化途徑和可逆性 轉變及其關 鍵調控因子（Blood. 2000, 95: 138）。首先通過趨化因子直接招募大量 DC 前體細胞以制備疫苗，開拓了趨化因子研究的新領域（Journal of the National Cancer Institute. 2004, 96: 201；Journal of Leukocyte Biology. 2008, 84: 1549）。發(fā)現(xiàn)骨髓干 細胞移植后的 GVHD 病程發(fā)展與異體反應 T 細胞表達的趨化因子受體的調控作用密切相關（ Journal of Immunology. 2008, 181: 7581）。這些是組織干細胞免疫特性及其與機體免疫交互影響研究的重要學術思想源泉和進一步取得創(chuàng)新突破的基石。在生物信息學方面，建立了多種生物信息學模型(Bioinformatics. 2003, 19: 2161 )，并將生物學信息學成功地 應用到了生物具體問題中 (Journal of Biological Chemistry. 2004, 279: 2719；Human Mutation. 2009, In press 等) 。這些為本項目的跨學科合作提供了經(jīng)驗和基礎。3、技術平臺和儀器設備：本項目組擁有較成熟的技術平臺和先進的儀器設備。如基于轉基因/基因剔除模型、RNA 干擾技術、自動 DNA 測序儀和高通量芯片的基因功能組學平臺；原位遺傳標記技術、單細胞水平高通量顯微分離和SOLiD TM單細胞表達譜研究平臺；DNA 甲基化分析系 統(tǒng)、 ChIP-chip (seq)、MeDIP-chip (seq)技術和 microRNA 深度測序技術；活體熒光成像儀，激光共聚焦顯微鏡、投射/掃描電鏡等 細胞影像分析平臺；多色高速流式 細胞儀、SPF 級的動物研究室、干細胞培養(yǎng)室。4、組織形式：瞄準戰(zhàn)略目標，追求持 續(xù)發(fā)展，開展系統(tǒng)化研究。項目組織管理和運作體制分項目和課題兩個層次。項目設一名負責人，負責整個項目的組織和實施。 項目負責人聘請各相關科學領域成就卓著的專家組成項目專家組，參與項目的組織、運行領導和管理，協(xié)助項目負責人，審 核和確定項目的學術思想、技術路線以及研究計劃，指 導協(xié)調各課題的工作，督促并考核各課題的進展情況。實施整體性運作方案，集成 發(fā)展技術平臺，充分 發(fā)揮項 目各課題組及承擔單位的學科優(yōu)勢和關鍵研究實力，形成功能配套、布局合理、機制靈活、銳意進取的研究體系。各課題間的關系根據(jù)本項目的總體研究方案，以研究組織干細胞的干性維持、分化過程及其與機體免疫的交互作用為核心，針對關鍵問題選擇突破點，將項目設臵為四個課題。課題 一，利用活體內(nèi)干細胞遺傳標記和分化譜系示蹤技術以及單細胞分離和分析平臺系統(tǒng)，建立靜息及活化的組織干細胞的分子標志系統(tǒng)，研究調控組織干細胞靜息與活化狀態(tài)轉換和多潛能性維持的機制，揭示組織干細胞干性維持的規(guī)律；課題二，利用特定的分化模型，研究組織干細 胞分化啟動及其分化定向的分子基礎，探索關鍵因子在分化命運決定中的作用；課題三，利用染色質免疫共沉淀芯片、甲基化 DNA 免疫沉淀芯片等技 術，研究 組織干細胞分化調控的遺傳和表觀遺傳調控機制，并利用生物信息學手段，構建 組織干細胞的調控網(wǎng)絡模型，闡明組織干細胞分化的規(guī)律；課題四，利用活體示蹤體系及組織損傷和疾病動物模型，研究組織干細胞體內(nèi)遷移模式、組織干細胞與機體免疫系統(tǒng)的交互作用及調控靶點，并進一步探討組織 干細胞移植治療和再生醫(yī)學的新策略。課題 1 ： 組織干細胞靜息和活化狀態(tài)的轉換及多潛能性研究 研究目標： 本課題擬利用高分辨率顯微分離系統(tǒng)、活細胞顯微成像和單細胞深度測序技術，對組織干細胞進行單細 胞分離和表達譜分析，以識別和鑒定組織干細胞的靜息與活化狀態(tài)，建立指紋圖譜， 進而建立靜息和活化的組織干細胞的分子標志系統(tǒng)；比較肝臟、間充質、神經(jīng)和乳腺等不同組織的 組織干細胞共性與特性。 進行 mRNA 和蛋白質表達譜以及表觀遺傳學譜分析，揭示組織干細胞在靜息和活化狀態(tài)之間轉換和多潛能性維持的關鍵因子及其作用機制。進一步還將研究不同組織的組織干細胞及其在體外和體內(nèi)環(huán)境下干性維持的異同。本課題將為調控組織干細胞的靜息和活化狀態(tài)提供理論基礎，并為干細胞替代療法和藥物研發(fā)提供新思路。 研究內(nèi)容： 研究干細胞靜息和活化狀態(tài)的轉換，評價其分化的多潛能性，以認識組織干細胞的干性維持機制。擬應 用已知的可能的組織干細胞的標志，制備組織干細胞遺傳標記小鼠模型或進行離體標記，以顯微切割系統(tǒng)進行單細胞水平的分離，利用已建立的組織干細胞長期培養(yǎng)觀察系統(tǒng)進行培養(yǎng)觀察，借助 SOLiD TM 技術平臺對組織干細胞進行單細胞表達譜分析，以識別和鑒定組織干細胞，識別靜息和活化的組織干細胞的特征， 發(fā)現(xiàn)不同狀態(tài)下組織干細胞的特異性分子標志，掌握靜息和活化狀態(tài)轉換的分子機制；研究免疫因子對組織干細胞干性維持的影響及其機制；通過比較不同階段的多潛能干細胞和單潛能前體細胞的 mRNA 和蛋白質表達譜以及表觀遺傳學譜，確定組織干細胞在遺傳及表觀遺傳方面的特性標志，分析維持組織干細胞多潛能性的遺傳和表觀遺傳作用機制，揭示組織干細胞干性維持的規(guī)律。 經(jīng)費比例： 20% 承擔單位： 同濟大學 課題負責人： 劉小青 學術骨干： 吳昊、陳炳官、袁瓊蘭、羅玉萍、 楊勝東、李惠萍 課題 2 ： 組織干細胞分化啟動和分化定向的研究 研究目標： 本課題擬采用組織干細胞的遺傳標記和分化譜系示蹤的手段，利用特定的分化模型，在不同的時間點上直接采取標記細胞和組織標本，從RNA、microRNA、蛋白質 、細胞和組織等不同層面或角度，對組織干細胞分化啟動及其分化定向的分子基礎進行探討，發(fā)現(xiàn)決定分化命運的關鍵分子及其相互關系，并繪制反映主要分化方向和分化等級的分子“ 分化樹”，以豐富組織干細胞生物學中關于分化啟動與分化定向的調控機制、分化階段的判斷，以及組織干細胞異位分化的調控因素等方面的知識體系。 研究內(nèi)容： 研究分化啟動關鍵因子、抑分化因子和促分化因子平衡、免疫因子與分化的相關性、分化過程的階段特性，以及異位再殖的分化特性。擬采用活體組織中干細胞遺傳標記及其譜系示蹤模型小鼠，制備組織干細胞分化模型，在不同的時間點（即不同的分化階段）直接從活體中采取標記細胞和組織標本，采用原位和離體的方法對組織干細胞分化活動的過程及其調控進行具有時空特性的綜合研究，其中包括：組織干細胞分化進程中結構空間特性的認識、不同分化階段特征的鑒別、分化啟動和分化定向關 鍵調控因子的鑒定。在此基礎上，也 進行不同胚層來源的組織的組織干細胞之間的比較研究，以認識分化事件調控的基本規(guī)律。 經(jīng)費比例： 25% 承擔單位： 中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學、上海交通大學 課題負責人： 胡以平 學術骨干： 諸江、謝志芳、余宏宇、 陳美玨、李文林課題 3 ： 組織干細胞分化的遺傳和表觀遺傳調控機制研究 研究目標： 闡明與組織干細胞分化相關的關鍵因子的遺傳和表觀遺傳調控機制，發(fā)現(xiàn)和鑒定新的表觀遺傳調控分子，整合不同層次的數(shù)據(jù)（mRNA 、轉錄因子、microRNA 和表 觀遺傳調 控相關分子），構建不同胚 層來源的組織的組織干細胞分化調控網(wǎng)絡模型，為干預組織干細胞的分化提供依據(jù)。 研究內(nèi)容： 研究與組織干細胞分化相關的關鍵因子的遺傳和表觀遺傳調控機制，加深對組織干細胞分化調控基本規(guī)律的認識。擬采用遺傳學和表觀遺傳學研究體系，探討已知的表觀調控因子（包括組蛋白修飾分子、染色質重塑分子和 microRNA）的生物學功能和作用機制；發(fā)現(xiàn)和鑒定新的表觀遺傳調控因子及其作用機制；研究免疫因子對組織干細胞分化的遺傳及表觀遺傳調節(jié)的影響及其機制；運用生物信息學方法，整合不同層次的數(shù)據(jù)（mRNA 、轉錄因子、microRNA 和表觀遺傳調控相關分子），探索組織干細胞分化調控規(guī)律， 為干預組織干細胞的分化提供依據(jù)。 經(jīng)費比例： 20% 承擔單位： 中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學、中國科學院上海生命科學研究院 課題負責人： 趙健 學術骨干： 沈百榮、張巖、陸斌、劉祖梅、周娟、王建永 課題 4 ： 組織干細胞免疫調節(jié)研究 研究目標： 本課題擬著重研究組織干細胞與機體免疫的交互作用及其分子機制?；谝呀⒌墓δ芑蚪M和蛋白質組高通量技術平臺，篩選并明確不同階段組織干細胞免疫識別相關的特異性分子標志，發(fā)現(xiàn)調控組織干細胞免疫功能的關鍵因子；采用細胞示蹤技術，研究 組織干細胞的體內(nèi)遷移模式；在組織損傷和疾病動物模型體內(nèi)研究免疫因素與組織干細胞的交互作用及其影響。以期建立組織干細胞免疫學功能的識別鑒定體系和組織干細胞遷移及功能示蹤的技術體系，闡明組織干細胞的免疫調控分子機制，發(fā)現(xiàn)干預調節(jié)的新靶點和提供免疫調控的新策略。 研究內(nèi)容： 研究組織干細胞的免疫生物學特性及機體免疫因素對組織干細胞的調控。擬利用功能基因組和蛋白質基因組高通量平臺分析不同狀 態(tài)和階段的組織干細胞免疫相關分子表達差異，明確組織干細胞免疫相關分子及其功能的 識別和鑒定標志，研究免疫因子對組織 干細胞干性維持、分化和免疫功能的影響， 發(fā)現(xiàn)關鍵的免疫調控因子及其作用機制。 進而在組織損傷和疾病 動物模型中，研究機體微環(huán)境免疫因素對植入和內(nèi)在的組織干細胞的激活、動員、向損傷靶組織定向遷移、分化、生長和凋亡的作用及其機制， 發(fā)現(xiàn)干預調 控靶點。研究組織干細胞移植對組織損傷和疾病動物的免疫影響和損傷修復作用，同時也研究間充質干細胞等移植可能產(chǎn)生的副作用，并研究組織干細胞移植的免疫排斥及可能的干預手段，探討組織干細胞移植修復治療及再生醫(yī)學的新策略。經(jīng)費比例： 35% 承擔單位： 中國科學院上海生命科學研究院、中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學 課題負責人： 時玉舫 學術骨干： 張雁云、杜艷芝、衛(wèi)立辛、張曉玲、于 鳳海、金敏、劉強 四、年度計劃時 間研究內(nèi)容 預期目標第一年1、 以顯微切割系統(tǒng)分離 CD133 基因位點帶 GFP 遺傳標記的不同來源的多種組織干細胞。2、 對單個 CD133+細胞進行長期培養(yǎng)觀察，測定克隆形成的過程，并結合免疫熒光染色對子代細胞的去向進行可能的標簽跟蹤，確定 CD133+中組織干細胞的比例。3、 借助 SOLiDTM 技術平臺對CD133+組織干細胞進行單細胞表達譜系統(tǒng)分析，包括建立轉錄圖譜以及表觀遺傳譜。4、 建立組織干細胞特異分子標志基因（如肝干細胞的 Foxl1）的啟動子所驅動的 GFP 的轉基因小鼠品系；5、 建立干細胞動員和分化的小鼠模型，比較分析分化前后表達譜差異，篩選抑分化基因；1、 建立和完善不同來源的多種CD133+組織干細胞的篩分方法。2、 確定不同組織來源的 CD133+細胞中組織干細胞的比例。3、 在單細胞水平上建立組織干細胞在靜息、活化狀態(tài)轉換的轉錄圖譜以及表觀遺傳譜，以識別和鑒定組織干細胞，發(fā)現(xiàn)可用于鑒別不同狀態(tài)下的組織干細胞的特異性分子標記，從而為揭示組織干細胞的靜息和活化狀態(tài)轉換的分子機制提供重要信息。 4、 得到組織干細胞遺傳標記的小鼠品系；5、實現(xiàn)組織干細胞從分化模型中的分離、富集及其表達譜分析；6、 建立干預分化模型小鼠的慢病毒干擾系統(tǒng)；7、獲得抑分化因子與干細胞分化啟動的相關性信息；6、 構建慢病毒干擾載體，以用于分化模型小鼠的干預處理，觀察抑分化基因被 knock-down 后對活體組織中干細胞動員的影響；7、 觀察抑分化候選因子在組織干細胞分化進程中的表達特點，分析抑分化因子與干細胞分化啟動的相關性。8、 利用已經(jīng)建立的肝干細胞、神經(jīng)干細胞、間充質干細胞分離和鑒定的技術平臺，探討Hes1、FoxL1、Fbxw7、Xbp1、Nestin、GFAP 等重要轉錄因子在組織干細胞分化中的轉錄和轉錄后調節(jié)機制；9、 建立 NanogLoxP/小鼠模型；10、 對已經(jīng)構建成功的 Mll5 基因敲除小鼠進行初步分析，利用組織化學與免疫生物學等方法，檢測 Mll5 基因敲除后肝、神經(jīng)、間充質、乳腺等組織干細胞的變化；8、 建立研究轉錄和轉錄后調控機制的相關實驗體系和技術平臺；9、 建立 NanogLoxP/小鼠模型為探討 Nanog 在 組織干細胞分化調控中的作用奠定基礎；10、 初步探討 Mll5 染色質重塑分子在組織干細胞分化中的作用；11、 篩查與組織干細胞分化相關的關鍵 miRNA 分子；12、 建立組織干細胞體外和體內(nèi)分析系統(tǒng)，為后期分析組織干細胞在不同階段的免疫相關分子的表達情況建立技術平臺；13、 了解組織干細胞對 DC 分化、成熟和功能的調控作用，為進一步了解其作用機理奠定基礎。14、 發(fā)表 SCI 收錄的學 術論文14 篇，其中在相關領域的國際權威刊物上發(fā)表 3 篇，培養(yǎng)研究生8 名。11、 通過大規(guī)模、高通量的深度測序（Deep-sequencing）的方式分析肝、神經(jīng)、間充質等若干重要組織干細胞的 small RNA 表達譜式, 運用單細胞 Real-time PCR 的方式驗證分析 miRNA 在不同類群組織干細胞中的表達分布特征。12、 利用功能基因組平臺和蛋白質組平臺，建立組織干細胞體外和體內(nèi)分析系統(tǒng)；13、 將不同狀態(tài)和階段的組織干細胞加入到 DC 培養(yǎng)系統(tǒng)中， 觀察組織干細胞對 DC 分化、成熟和功能的調控作用。14、 研究間充質干細胞移植的副作用第二年1、 建立在表達圖譜上有重大或特異差異的基因的功能缺失或獲得模型。2、對以上建立的模型進行靜息、活化狀態(tài)的鑒定，確定特異表達的分子標簽是維持組織干細胞功能1、 確定組織干細胞干性維持、靜息和活化狀態(tài)的關鍵因子。2、 揭示機體微環(huán)境對組織干細胞的靜息與活化狀態(tài)相互轉換及其多潛能性的調節(jié)機制。所必須的關鍵因子。3、 利用體內(nèi)各種基液(如腦積液)對不同來源的組織干細胞處理，研究其對組織干細胞靜息與活化狀態(tài)的相互轉化及潛能性的維持的作用機制。4、 將攜帶報告基因 Roser26R-LacZ /Roser26R-GFP 的小鼠與干細胞特異分子標志基因的啟動子所驅動的 Cre 小鼠 雜交，以獲得可用于干細胞標記和其分化譜系示蹤的小鼠品系，并制備相應干細胞的分化模型；5、 在模型制備過程中的不同時間點，利用流式細胞技術等手段直接從活體組織中分離被遺傳標記的細胞，進而進行 mRNA 和microRNA 表達 譜的分析，以構建各個分化階段的指紋圖譜；6、 收集各相應時間點的組織標本，進行原位分析，以追蹤其組織干細胞的分化命運，并構建其干細3、 得到干細胞遺傳標記和其分化譜系示蹤的小鼠品系；4、繪制組織干細胞各個分化階段的指紋圖譜； 5、 完成可反映組織干細胞主要分化方向和主要分化等級的分子“分化樹”；6、闡明轉錄和轉錄后調控在組織干細胞分化調節(jié)中的作用；7、 初步探討 Nanog 基因在組織干細胞損傷修復中的作用。8、 初步探討 Mll5 基因在組織干細胞損傷修復中的作用；9、 探討關鍵 miRNA 在組織干細胞分化中的作用及其作用機制；10、 了解組織干細胞在不同階段的免疫相關分子的表達情況；11、 闡明組織干細胞對 DC 分化、成熟和功能調控的作用機理；12、 了解組織干細胞與 T 細胞等免疫細胞的相互作用，重點闡明組織干細胞對 T 細胞的影響方式。胞的“分化樹 ”。7、繼續(xù)對重要轉錄因子在組織干細胞分化中的轉錄和轉錄后調節(jié)機制進行研究；8、對建立的 NanogLoxP/小鼠模型進行初步分析，根據(jù)小鼠表型選取不同時間段處死小鼠，收集各種組織器官，進行表型觀察和病理切片；9、 利用手術、伽馬射線或者化療藥物制造組織損傷，檢測 Mll5 基因敲除后，組織干細胞在損傷修復過程中的變化；10、 通過過表達、基因敲低及可誘導的 miRNA 轉基因模型研究組織干細胞分化過程中關鍵miRNA 的作用及其作用機制。11、 利用已建立的平臺技術分析組織干細胞在不同階段的免疫相關分子的表達情況；12、 針對已發(fā)現(xiàn)的組織干細胞對 DC 分化、成熟和功能的調控作用，進一步深入研究其中的作13、 發(fā)表 SCI 收錄的學 術論文16 篇，其中在相關領域的國際權威刊物上發(fā)表 3 篇，申請專利 3項，培養(yǎng)研究生 14 名。用機理；13、 在研究組織干細胞與 DC 細胞相互作用的基礎上，進一步研究組織干細胞與 T 細胞的相互作用，檢測組織干細胞對 T 細胞增殖及細胞因子分泌格局的影響。14、 研究組織干細胞移植的副作用第三年1、 建立多潛能組織干細胞和單潛能前體細胞的 mRNA 轉錄圖和表觀遺傳學譜。2、 從分化早期即發(fā)生改變的基因（從 mRNA 和 microRNA 水平）著手，結合 Go 功能聚類和pathway 聚類，篩選出候選的分化啟動和分化定向的關鍵因子；3、 采用基因功能丟失或基因功能獲得等策略，從體外和體內(nèi)兩個方面，逐個分析各候選關鍵因子對遺傳標記的組織干細胞多向分化的影響；4、 分析各種候選關鍵因子的不同1、 揭示多潛能組織干細胞和單潛能前體細胞的分子指紋圖譜，找出各自反應其潛能性的特異性分子標簽。2、 獲得候選分化啟動和分化定向的關鍵因子；3、 明確各候選關鍵因子對遺傳標記細胞分化啟動和分化中的作用； 4、 認識各種關鍵因子間的協(xié)同作用；5、 探討 DNA 甲基化在組織干細胞分化中的作用；6、 闡明 Nanog 基因調節(jié)組織干細胞分化的分子機制；組合對組織干細胞分化行為的影響。5、 通過亞硫酸氫鈉修飾、MSP 和BSP 測 序的方法，檢測 DNA 甲基化在肝干細胞、神經(jīng)干細胞和間充質干細胞分化中的作用；6、 利用原位雜交，免疫組化， Real-time PCR 和 Western blotting 等方法分別在 RNA 水平和蛋白質水平上詳細分析 Nanog 基因上下游相關分子表達情況及其它相關重要信號通路分子表達情況，從而確定 Nanog 基因在組織干細胞分化中的作用機制。7、 進一步探討 Mll5 在組織干細胞損傷修復中的作用和作用機制；8、 構建斑馬魚重要組織如肝臟、心臟等干細胞特異轉錄因子驅動的 GFP 表達的轉基因斑馬魚系，通過綠色熒光蛋白示蹤其組織干細胞的分布，建立干細胞在體遷移及功能示蹤的技術體系。9、 進一步分析比較組織干細胞對7、 闡明 Mll5 基因在組織干細胞損傷修復中的作用及作用機制；8、 建立干細胞在體遷移及功能示蹤的斑馬魚技術體系；9、 闡明組織干細胞對調節(jié)性 T 細胞轉化、淋巴細胞殺傷能力等的不同作用及其機理；10、 發(fā)現(xiàn)若干調控組織干細胞的免疫調控因子及其組合，并弄清其作用方式。11、 發(fā)表 SCI 收錄的學 術論文23 篇，其中在相關領域的國際權威刊物上發(fā)表 6 篇，申請專利 5項，培養(yǎng)研究生 17 名。調節(jié)性 T 細胞轉化、淋巴 細胞殺傷靶細胞的能力等的影響；10、 單獨或聯(lián)合應用各種免疫調控因子刺激組織干細胞，檢測和比較刺激前后組織干細胞免疫相關分子的表達差異，分析其增殖能力變化和自身細胞因子分泌格局。11、 研究組織干細胞移植的副作用。第四年1、 建立潛在的反應組織干細胞的多潛能性的特異分子標簽的基因敲除或 RNA 表達干涉或功能獲得模型模型。2、 對以上建立的功能缺失或功能獲得的模型進行潛能性測定。確定哪些特異表達的分子標簽是維持組織干細胞多潛能功能所必須的關鍵因子。 3、 將不同來源的組織干細胞分別植入 FAH-/-小鼠，在不同時間點觀察植入細胞的效率、空間分布以及成熟肝細胞功能標志，評1、 確定特異表達的分子標簽是維持組織干細胞多潛能功能所必須的關鍵因子。2、 明確不同來源組織干細胞的再殖能力與再殖特點；3、 明確組織干細胞再殖部位所浸潤的免疫細胞的類型；4、發(fā)現(xiàn)可以干預干細胞再殖效率的影響因子；5、 探討組蛋白修飾在組織干細胞分化中的調控；6、闡明 miRNA 在斑馬魚肝臟、心臟再生中的作用；價不同來源細胞的再殖能力與再殖特點。4、 研究骨髓間充質干細胞在肝臟中的再殖情況，其中包括肝向分化的階段劃分、各個分化階段的指紋圖譜，以及處于不同分化階段的干細胞異位再殖潛力。5、 針對一些特別的因子，對擬用于移植的細胞用基因功能丟失或基因功能獲得等手段處理，然后再將其植入 FAH-/-小鼠，評價其對再殖效率的影響。6、 結合各組織來源的間充質干細胞植入后不同時期形態(tài)學和不同種類淋巴細胞的特異性免疫學標記，分析參與免疫反應的淋巴細胞種類，以發(fā)現(xiàn)主導細胞移植免疫反應的免疫細胞類型。7、 利用組蛋白修飾的特異抗體，進行染色質免疫沉淀，分析肝臟、間充質、神經(jīng)和乳腺等組織干細胞中重要轉錄因子啟動子區(qū)域7、 探索組織干細胞分化調控的基本規(guī)律。8、 明晰組織干細胞免疫學功能相關的識別和鑒定標志；9、闡明有效免疫因子或其組合對組織干細胞的作用機制；10、 建立和完善趨化因子及其受體的分析技術平臺，闡明組織干細胞的遷移特征與分子調控機制。11、 發(fā)表 SCI 收錄的學 術論文25 篇，其中在相關領域的國際權威刊物上發(fā)表 10 篇，申請專利10 項，培養(yǎng)研究生 22 名。的組蛋白修飾特征，明確這些基因在組織干細胞分化中表達變化的調控機制。8、 利用 miRNA 芯片技術， 獲得斑馬魚心臟、肝臟再生過程中miRNA 的動態(tài)的表達變化譜式，再結合敲除特異 miRNA, 研究單個 miRNA 對于干細胞介導的再生過程的影響。9、 通過動態(tài)貝葉斯網(wǎng)絡方法建立組織干細胞的遺傳學和表觀遺傳學調控網(wǎng)絡,探索組織干細胞分化調控的基本規(guī)律。10、 分別將不同階段的組織干細胞移植到組織損傷的動物體內(nèi)，研究體內(nèi)的組織干細胞免疫相關分子表達，并對比體外培養(yǎng)體系中不同階段的組織干細胞免疫相關分子表達的差異，分析組織干細胞在不同階段特異性表達的免疫相關分子；11、 基于前期研究篩選出有效調控組織干細胞的關鍵因子，并闡明其作用機制。12、 在組織損傷和疾病動物模型中，分析靶組織和組織干細胞的炎癥因子、趨化因子及其受體、黏附分子等的表達譜，研究組織損傷后釋放的免疫炎癥因子對植入和內(nèi)在的組織干細胞的免疫相關分子表達、動員、激活、分化、生長和凋亡以及向損傷靶組織遷移的影響作用。第五年1. 利用免疫調節(jié)因子體內(nèi)各種基液( 如腦積液) 對不同來源的組織干細胞處理，研究其對組織干細胞靜息與活化狀態(tài)的相互轉化及潛能性的維持的調控作用。2. 利用免疫拮抗因子對不同來源的組織干細胞處理，研究其對組織干細胞靜息與活化狀態(tài)的相互轉化及潛能性的維持的調控作用。3. 利用生物信息學，對 mRNA 和1、 揭示免疫調節(jié)因子及免疫拮抗因子對組織干細胞的靜息與活化狀態(tài)相互轉換及其多潛能性的調節(jié)機制。2、為干細胞移植克服免疫排斥提供新戰(zhàn)略。3、認識組織干細胞分化啟動和分化定向的調節(jié)模塊；4、獲得細胞的植入及增殖與免疫細胞之間的認識；5、 在組織損傷和疾病動物模型體內(nèi)microRNA 層 面的數(shù)據(jù)進 行綜合分析，分析組織干細胞分化啟動和分化定向的關鍵因子的相互關系；4. 不同組織來源的組織干細胞間分化調控分子基礎的橫向比較，探討組織干細胞分化啟動和分化調控的基本規(guī)律；5. 分析免疫細胞在干細胞植入和增殖過程中的作用及其機制，并評價人為干預的可行性；6. 在組織損傷和疾病動物模型中，研究分析組織干細胞移植對機體免疫的影響作用及其機制；7. 通過檢測移植的組織干細胞在靶組織中的存活、分化能力和向各種靶組織細胞分化的比例，確定組織干細胞在體內(nèi)的分化狀態(tài)和對靶組織損傷的修復機制；8. 同時研究機體對植入組織干細胞的免疫排斥反應及其機制，探索誘導組織干細胞移植免疫耐受的新手段；研究免疫因素與組織干細胞的交互作用及其影響；6、發(fā)現(xiàn)組織干細胞與機體免疫交互作用的規(guī)律。 7、發(fā)表 SCI 收錄的學術論 文 30 篇，其中在相關領域的國際權威刊物上發(fā)表 12 篇，申請專利 12 項，培養(yǎng)研究生 22 名。9. 進一步利用轉基因或基因剔除等手段改變某些潛在調控因子的表達，研究由微環(huán)境中趨化因子和黏附分子分別介導的組織干細胞胞內(nèi)信號轉導，探索組織干細胞在組織損傷和修復治療中遷移的分子機制。