紫外分光光度法和熒光分析法.ppt

一、紫外可見光分光光度法,光譜分析法,二、熒光分析法,基本原理,儀器主要部件,紫外-可見光分光光度法,主要應(yīng)用,基本原理,概述：紫外-可見分光光度法是通過被測物質(zhì)在紫外-可見光區(qū)的特定波長或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度，對該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。主要用于藥品的鑒別、檢查和含量測定。范圍：,可見光區(qū)（400760nm）,紫外光區(qū)（200400nm）,Beer-Lambort定律,*A為吸收度；*T為透光率；*E為吸收系數(shù)（以表示，溶液濃度為1%（g/ml），厚度為1cm時(shí)的吸光度值）*c為溶液濃度；*l為樣品總厚度。,適用條件：,入射光為單色光溶液是稀溶液固體、液體和氣體樣品在同一波長下，各組分吸光度具有加和性,儀器主要部件,光源:常采用氘燈和鎢鹵燈鎢燈最適宜的使用波長范圍為3201000nm。氘燈能發(fā)出光的波長范圍一般為190400nm單色器：棱鏡或光柵吸收池：玻璃或石英吸收池檢測器：光電池、光電管、光電倍增管及二極管陣列檢測器,儀器分類,單光束紫外可見分光光度計(jì)準(zhǔn)雙光束紫外可見分光光度計(jì)雙光束紫外可見分光光度計(jì)雙波長紫外可見分光光度計(jì),主要應(yīng)用,利用藥物與雜質(zhì)對光的選擇性吸收性質(zhì)的差異，若藥物在雜質(zhì)的最大吸收波長處沒有吸收，則可在此波長處測樣品溶液的吸收度，通過控制樣品溶液吸收度來控制雜質(zhì)的量。例：地蒽酚中二羥基蒽醌的檢查二羥基蒽醌的三氯甲烷溶液在432nm處有最大吸收，而地蒽酚在該處幾乎無吸收。,1、藥物的雜質(zhì)檢查,2、藥物的含量測定,如巴比妥類藥物的含量測定（巴比妥類藥物在堿性介質(zhì)中電離為具有紫外吸收特征的結(jié)構(gòu)）、芳酸及其脂類藥物含量測定、維生素A含量測定（在325328nm的波長范圍內(nèi)有最大吸收）等。,三點(diǎn)校正法本方法是在三個(gè)波長處測得吸光度，根據(jù)校正公式計(jì)算吸光度校正值后，再計(jì)算含量。其原理主要基于以下兩點(diǎn)：雜質(zhì)的無關(guān)吸收再310340nm的波長范圍內(nèi)幾乎呈一條直線，且隨波長的增大吸光度下降。物質(zhì)對光吸收呈加和性的原理，即在某一樣品的吸收曲線上，各波長的吸光度是維生素A與雜質(zhì)吸光度的代數(shù)和，因而吸收曲線也是二者吸收的疊加。,3、藥物的鑒別,對比吸收光譜特征數(shù)據(jù)對比吸收度（或吸收系數(shù)）的比值對比吸收光譜的一致性,例苯磺舒：用含鹽酸的乙醇取鹽酸溶液（9-1000）2ml，加乙醇制成100ml制成沒1ml中含20ug的溶液，在225nm與249nm的波長處有最大吸收，在249nm波長處的吸收度為0.67。甾體激素類藥物：丙酸倍氯米松的乙醇溶液（20ug/ml），在239nm的波長處應(yīng)有最大吸收，吸光度為0.570.60;在239nm與263nm波長處的吸光度比值應(yīng)為2.252.45,1.判別物質(zhì)的異構(gòu)體，如互變異構(gòu)體，順反異構(gòu)體，開鏈和成環(huán)異構(gòu)體，旋光異構(gòu)體，空間異構(gòu)體等。反式異構(gòu)體空間位阻小，共軛程度較完全。最大吸收峰波長，最大摩爾吸收系數(shù)，大于順式。2.推測物質(zhì)的共軛體系和部分骨架一般需與色譜，紅外，質(zhì)譜，波譜等多種儀器聯(lián)合作物質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析。,4.結(jié)構(gòu)分析,紫外分光光度測定方法,普通測定分光光度法1.單組分的測定通常采用A-C標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量測定。2.多組分的同時(shí)測定若各組分的吸收曲線互不重疊，則可在各自最大吸收波長處分別進(jìn)行測定。這本質(zhì)上與單組分測定沒有區(qū)別。若各組分的吸收曲線互有重疊，則可根據(jù)吸光度的加合性求解聯(lián)立方程組得出各組分的含量。A1=a1bcab1bcbA2=a2bcab2bcb,差示分光光度法,普通分光光度法一般只適于測定微量組分，當(dāng)待測組分含量較高時(shí)，將產(chǎn)生較大的誤差。需采用示差法。即提高入射光強(qiáng)度，并采用濃度稍低于待測溶液濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作參比溶液。設(shè)：待測溶液濃度為cx，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為cs(cs<cx)。則：Ax=bcxAs=bcsxs=b(cxcs）=bc測得的吸光度相當(dāng)于普通法中待測溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度之差。示差法測得的吸光度與c呈直線關(guān)系。由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的c值，則待測溶液濃度cx：cx=cs+c,雙波長分光光度法,不需空白溶液作參比；但需要兩個(gè)單色器獲得兩束單色光(1和2)；以參比波長1處的吸光度A1作為參比，來消除干擾。在分析渾濁或背景吸收較大的復(fù)雜試樣時(shí)顯示出很大的優(yōu)越性。靈敏度、選擇性、測量精密度等方面都比單波長法有所提高。A2A1（21)bc兩波長處測得的吸光度差值與待測組分濃度成正比（例子：課本366頁）,導(dǎo)數(shù)分光光度法,導(dǎo)數(shù)分光光度法在多組分同時(shí)測定、渾濁樣品分析、消除背景干擾、加強(qiáng)光譜的精細(xì)結(jié)構(gòu)以及復(fù)雜光譜的辨析等方面，顯示了很大的優(yōu)越性。利用吸光度(或透光度)對波長的導(dǎo)數(shù)曲線來進(jìn)行分析：0e-bc假定入射光強(qiáng)度0在整個(gè)波長范圍內(nèi)保持恒定：dI0/d0則：dI/d0bce-bcd/d0bcd/d（例子：課本233頁）,其他,卡爾曼濾波法偏最小二乘法小波變換三波長分光光度法系數(shù)倍率法,與紫外-可見法異同點(diǎn),應(yīng)用,熒光分析法,原理,原理,熒光分子吸收電磁波后，從其最低激發(fā)態(tài)重新發(fā)射紫外線或可見光的現(xiàn)象利用某些物質(zhì)被一定波長的光照射后所產(chǎn)生的，能夠反映該物質(zhì)特性的熒光來進(jìn)行定性定量的分析方法熒光分析法。,在溶液中，當(dāng)熒光物質(zhì)的濃度較低時(shí),其熒光強(qiáng)度與該物質(zhì)的濃度通常有良好的正比關(guān)系,即IF=KC,光照分子基態(tài)激發(fā)態(tài)輻射躍遷熒光若光源是：由熒光波長可確定物質(zhì)分子可見-紫外光源分子熒光分析法具有結(jié)構(gòu)由熒光強(qiáng)度可測物質(zhì)的含量原子特征光譜作光源原子熒光分析X射線作光源X射線熒光分析,構(gòu)件,光源：為高壓汞蒸氣燈或氙弧燈，后者能發(fā)射出強(qiáng)度較大的連續(xù)光譜，且在300nm400nm范圍內(nèi)強(qiáng)度幾乎相等，故較常用。激發(fā)單色器：置于光源和樣品室之間的為激發(fā)單色器或第一單色器，篩選出特定的激發(fā)光譜。發(fā)射單色器：置于樣品室和檢測器之間的為發(fā)射單色器或第二單色器，常采用光柵為單色器。篩選出特定的發(fā)射光譜樣品室：通常由石英池(液體樣品用)或固體樣品架(粉末或片狀樣品)組成。檢測器：一般用光電管或光電倍增管作檢測器?？蓪⒐庑盘柗糯蟛⑥D(zhuǎn)為電信號。,熒光分析法與紫外-可見分析法異同點(diǎn),熒光分析法與紫外-可見比較：均屬于分子光譜儀器構(gòu)造基本相似熒光可見-紫外本質(zhì)發(fā)射光譜吸收光譜靈敏度10-10-10-12g/ml10-4-10-7g/ml選擇性高一般,應(yīng)用,硫色素?zé)晒夥y定維生素B1維生素B1在堿性溶液中被鐵氰化鉀氧化成硫色素，在紫（365nm）照射下呈藍(lán)色熒光（435nm）通過與對照品熒光強(qiáng)度比較。即可測得供試品含量（課本260頁）熒光分光光度法測定維生素E采用同步熒光掃描法測定血清中維生素E，有效的消除溶劑拉曼光譜的干擾，提高靈敏度和準(zhǔn)確性。（課本277頁）,時(shí)間分辨熒光光譜基于不同發(fā)光體發(fā)光衰減速度不同.壽命不同.在進(jìn)行這種測量時(shí)要求帶有時(shí)間延遲設(shè)備的脈沖光源和帶有門控時(shí)間電路的檢測器件,從而可在固定延遲時(shí)間td和門控時(shí)間tg,用發(fā)射單色器進(jìn)行掃描.可得到時(shí)間分辨發(fā)射光譜。同步掃描根據(jù)激發(fā)光和發(fā)射單色器在掃描過程中彼此間所保持的關(guān)系,參考文獻(xiàn),劉文英，藥物分析.袁觀宇，生物物理學(xué).李昌厚，紫外分光光度計(jì).陳偉,林新華.紫外-可見分光光度法新技術(shù)在藥物分析中應(yīng)用的進(jìn)展.JournalofFujianMedicalUniversity.2001;35:300-303.王雷,楊新建,寇欣.紫外分光光度法在中藥分析中的應(yīng)用進(jìn)展.天津藥學(xué).2003;第15卷第5期,