生物制藥工程：第二章 第十節(jié) 案例教學(xué) 基因工程菌生產(chǎn)人胰島素 定稿

生物制藥工程生物制藥工程 第二章第二章 第十節(jié)第十節(jié)重點(diǎn)講述胰島素的三種表達(dá)方法重點(diǎn)講述胰島素的三種表達(dá)方法通過本章節(jié)的學(xué)習(xí)，使學(xué)生對整通過本章節(jié)的學(xué)習(xí)，使學(xué)生對整個(gè)基因工程制藥的流程有個(gè)清晰個(gè)基因工程制藥的流程有個(gè)清晰的認(rèn)識。的認(rèn)識。胰島素的發(fā)現(xiàn)胰島素的發(fā)現(xiàn)1胰島素的結(jié)構(gòu)胰島素的結(jié)構(gòu)2胰島素類型胰島素類型3人胰島素的生產(chǎn)方法人胰島素的生產(chǎn)方法4 我國古代將糖尿病稱為我國古代將糖尿病稱為“消消渴癥渴癥”，例如唐朝初期的醫(yī)書上，例如唐朝初期的醫(yī)書上有這樣的記載：有這樣的記載：“渴而飲水，小渴而飲水，小便數(shù)便數(shù) 甜者，皆是消渴癥也。甜者，皆是消渴癥也?！背浞终f明，這些病人老是感到口充分說明，這些病人老是感到口干想喝，排尿特多，而排出的尿干想喝，排尿特多，而排出的尿呢，其甜無比。呢，其甜無比。19581958F.Sanger F.Sanger 桑桑 格格 英英 國國 測定胰島素的分子結(jié)構(gòu)測定胰島素的分子結(jié)構(gòu)生物化學(xué)獎生物化學(xué)獎19231923Frederick G. Frederick G. Banting; J.J.R.Banting; J.J.R.班廷班廷; ;麥克勞德麥克勞德 加拿大加拿大發(fā)現(xiàn)胰島素發(fā)現(xiàn)胰島素生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎19771977Rosalyn Yalow Rosalyn Yalow 雅雅 洛洛 美美 國國開發(fā)放射免疫分析法開發(fā)放射免疫分析法生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎 1965年年9月月17日，在世界上首次用人工方法合成了結(jié)日，在世界上首次用人工方法合成了結(jié)晶牛胰島素。晶牛胰島素。實(shí)驗(yàn)現(xiàn)場實(shí)驗(yàn)現(xiàn)場王應(yīng)睞，鄒承魯，龔岳亭王應(yīng)睞，鄒承魯，龔岳亭結(jié)晶牛胰島素結(jié)晶牛胰島素 胰島素由胰島素由A、B兩個(gè)肽鏈組成。兩個(gè)肽鏈組成。 人胰島素人胰島素(Insulin Human) A鏈有鏈有11種種21個(gè)個(gè)氨基酸，氨基酸，B鏈有鏈有15種種30個(gè)氨基酸，共個(gè)氨基酸，共26種種51個(gè)氨個(gè)氨基酸組成。基酸組成。 其中其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四個(gè)半胱氨酸中四個(gè)半胱氨酸中的巰基形成兩個(gè)二硫鍵，使的巰基形成兩個(gè)二硫鍵，使A、B兩鏈連接起來。此外兩鏈連接起來。此外A鏈中鏈中A6(Cys) 與與 A11(Cys)之間也存在一個(gè)二硫鍵。之間也存在一個(gè)二硫鍵。19821982年年 , , 美國美國Ely Ely LiLiLiLi公司首先使用重組大腸桿菌公司首先使用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素生產(chǎn)人胰島素 , , 成為世界上第一個(gè)上市的基因工程成為世界上第一個(gè)上市的基因工程藥物。藥物。19871987年年 , Novo, Novo公司公司 , , 上市的基因工程藥物。上市的基因工程藥物。19871987年年 , Novo, Novo公司又推出了利用重組酵母菌生產(chǎn)人公司又推出了利用重組酵母菌生產(chǎn)人胰島素的新工藝。胰島素的新工藝。 體外胰島素受體結(jié)合性能、淋巴細(xì)胞合成纖維細(xì)胞的應(yīng)答能體外胰島素受體結(jié)合性能、淋巴細(xì)胞合成纖維細(xì)胞的應(yīng)答能力、降血糖作用、血漿藥代動力學(xué)等指標(biāo)上均與天然胰島素沒有力、降血糖作用、血漿藥代動力學(xué)等指標(biāo)上均與天然胰島素沒有任何區(qū)別。任何區(qū)別。 具有無免疫原性、注射吸收迅速的特點(diǎn)。充分展示了基因工具有無免疫原性、注射吸收迅速的特點(diǎn)。充分展示了基因工程在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的巨大潛力。程在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的巨大潛力。（1） A鏈、鏈、B鏈分別表達(dá)法鏈分別表達(dá)法（2） 人胰島素原表達(dá)法人胰島素原表達(dá)法（3） 分泌型人胰島素原表達(dá)分泌型人胰島素原表達(dá)法法tacMet-GalMetA peptideoriAprN NC CMMtacMet-GalMetB peptideoriAprN NC CMM基基因因工工程程菌菌的的構(gòu)構(gòu)建建策策略略N NC CC CN NC CN NN NC CCNBr處理處理分離純化分離純化Cys體外氧化和重折疊體外氧化和重折疊N NC CN NC CS SS S|S|S|S|S表表達(dá)達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物物的的后后處處理理線線路路N NC CMM-GalA 鏈鏈N NC CMM-GalB 鏈鏈生生產(chǎn)產(chǎn)技技術(shù)術(shù)的的評評價(jià)價(jià) 由于由于A鏈和鏈和B鏈上共存在六個(gè)半胱氨酸殘基，體鏈上共存在六個(gè)半胱氨酸殘基，體外二硫鍵的正確配對率較低，通常只有外二硫鍵的正確配對率較低，通常只有10%20%，因此采用這條工藝線路生產(chǎn)的重組人胰島素每克成因此采用這條工藝線路生產(chǎn)的重組人胰島素每克成本高達(dá)本高達(dá)100美元美元以上。以上。 為了進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，美國為了進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，美國Ely LiLi公司公司隨后又建立了第二條生產(chǎn)重組人胰島素的工藝路線。隨后又建立了第二條生產(chǎn)重組人胰島素的工藝路線。NCMM基基因因工工程程菌菌的的構(gòu)構(gòu)建建策策略略轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化分離純化分離純化tacMet-GalMetA peptideoriAprC peptideB peptide人胰島素原的人胰島素原的cDNA胰蛋白酶CNBrNCNC表表達(dá)達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物物的的后后處處理理線線路路|S|S|SS|SS|S|S|SS|羧肽酶BC peptideB peptideA peptideRNRRKRM生生產(chǎn)產(chǎn)技技術(shù)術(shù)的的評評價(jià)價(jià) 在人胰島素原表達(dá)工藝中，由于在人胰島素原表達(dá)工藝中，由于C肽的存在，胰島素原肽的存在，胰島素原能形成良好的空間構(gòu)象，三對二硫鍵的正確配對率也相應(yīng)提能形成良好的空間構(gòu)象，三對二硫鍵的正確配對率也相應(yīng)提高，折疊率高達(dá)高，折疊率高達(dá)80%以上。雖然這條工藝路線并不比以上。雖然這條工藝路線并不比AB鏈分鏈分別表達(dá)法更為簡捷，而且還要使用兩種高純度的酶制劑，但別表達(dá)法更為簡捷，而且還要使用兩種高純度的酶制劑，但理想的折疊率在很大程度上彌補(bǔ)了工藝繁瑣的缺陷，使得每理想的折疊率在很大程度上彌補(bǔ)了工藝繁瑣的缺陷，使得每克最終產(chǎn)品的成本僅克最終產(chǎn)品的成本僅50美元美元。 目前，美國目前，美國Ely LiLi公司采用此工藝年產(chǎn)公司采用此工藝年產(chǎn)十幾噸十幾噸的重組人的重組人胰島素胰島素。NCMM基基因因工工程程菌菌的的構(gòu)構(gòu)建建策策略略轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化分離純化分離純化tacMet-內(nèi)酰胺酶MetA peptideoriAprC peptideB peptide人胰島素原的人胰島素原的cDNA（3）分泌型）分泌型人胰島素原表達(dá)法人胰島素原表達(dá)法 上述三種重組大腸桿菌的構(gòu)建路線均采用胰島素或胰島上述三種重組大腸桿菌的構(gòu)建路線均采用胰島素或胰島素原編碼序列與大腸桿菌素原編碼序列與大腸桿菌-半乳糖苷酶半乳糖苷酶基因拼接的方法，所基因拼接的方法，所產(chǎn)生的融合型重組蛋白表達(dá)率高、穩(wěn)定性強(qiáng)，但不能分泌，產(chǎn)生的融合型重組蛋白表達(dá)率高、穩(wěn)定性強(qiáng)，但不能分泌，只要以包涵體的形式存在于胞質(zhì)中。只要以包涵體的形式存在于胞質(zhì)中。 一種能促進(jìn)融合蛋白分泌的工程菌構(gòu)建策略是將胰島素一種能促進(jìn)融合蛋白分泌的工程菌構(gòu)建策略是將胰島素或胰島素原編碼序列與或胰島素原編碼序列與-內(nèi)酰胺酶內(nèi)酰胺酶基因拼接，基因拼接， -內(nèi)酰胺酶通內(nèi)酰胺酶通常能被大腸桿菌常能被大腸桿菌分泌到胞外分泌到胞外。由此獲得的工程菌同時(shí)具備了。由此獲得的工程菌同時(shí)具備了穩(wěn)定高效表達(dá)可分泌型融合蛋白的優(yōu)良特性，為胰島素的后穩(wěn)定高效表達(dá)可分泌型融合蛋白的優(yōu)良特性，為胰島素的后續(xù)分離純化工序減輕了負(fù)擔(dān)。續(xù)分離純化工序減輕了負(fù)擔(dān)。思考題人胰島素有那三種表人胰島素有那三種表達(dá)方法？達(dá)方法？Description of the contents12人胰島素三種表達(dá)方人胰島素三種表達(dá)方法有何優(yōu)缺點(diǎn)？法有何優(yōu)缺點(diǎn)？