發(fā)育生物學——發(fā)育生物學研究技術ppt課件

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1、發(fā)育生物學研究技術,常用發(fā)育生物學研究技術簡介,顯微鏡技術 (成像imaging); 組織切片技術 (經(jīng)典解剖形態(tài)學morphology); 生化分子生物學; 原位雜交技術 (in situ hybridization); 顯微注射; 報告基因技術; 細胞標記技術;,顯微鏡技術 目的：觀察胚胎個體 分類： 光學(optical)顯微鏡: 體視顯微鏡: 組織分離用 熒光顯微鏡：,顯微鏡技術 激光共聚焦顯微鏡 (laser confocal)：熒光標記，對胚胎或細胞中的特定蛋白質(zhì)或mRNA的分布進行定性或定量研究；圖像采集的效果很好；細胞或組織的三維重塑 (reconstructing),組織切片

2、技術 目的：觀察胚胎的內(nèi)部組織學結(jié)構(gòu) 分類： 石蠟組織切片：石蠟包埋，切片機切片 冷凍切片：低溫包埋劑包埋，低溫切片機切片，對樣品中核酸的保存較好，但切片的質(zhì)量差。,分子生物學技術 目的：檢測目的基因或蛋白質(zhì)在某一發(fā)育時期或特定組織中的表達 分類：,Polymerase chain reaction (PCR): DNA amplification Real-time quantitative PCR: RNA 定量 RT-PCR/Northern blotting: mRNA expression Western blotting: protein expression 免疫共沉淀 (Co-

3、IP): protein-protein interaction,Northern Blotting Analysis,Southern Blotting Analysis,Real-time PCR 儀,原位雜交技術 目的：檢測某一特定基因mRNA在某胚胎和組織中的分布情況 分類：,放射性標記探針：放射自顯影 非放射性標記探針： 地高辛(DIG)-免疫組化 熒光素-熒光免疫組化 (FISH),原位探測基因表達,Gene expressing guiding development When and where particular genes are active Intact embryo

4、s or sections of embryos In situ hybrid: probes-radioactive isotope, fluorescence tag or an enzyme Dectection: autoradiography, fluorescence microscope, enzyme-substrate reaction,原位探測基因表達,原位探測基因表達,Distribution of mRNA for the growth factor Vg-1 in the amphibian egg. In situ hybridization with a radi

5、oactive probe. (yellow signals),原位探測基因表達,利用原位雜交技術研究基因表達的時空譜,mRNA的檢測,FISH 探測基因表達,報道基因 (reporter gene) 技術 目的：用于啟動子/增強子的分析研究。采用一些產(chǎn)物易于檢測的基因(報道基因)與待研究的表達調(diào)控序列串聯(lián)，通過轉(zhuǎn)基因技術導入胚胎體內(nèi)，分析報道基因產(chǎn)物的表達來研究目的片斷的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性。 常用報道基因分類：,綠色熒光蛋白 (GFP): 分布用熒光顯微鏡觀察 lacZ基因: 編碼 -半乳糖苷酶, 用特異底物顯色研究其產(chǎn)物分布 熒光素酶 (luciferase): 常用體外基因表達活性分析，近年開

6、始體內(nèi)研究,啟動子活性檢測法,表達載體的構(gòu)建：,利用大分子間的相互作用克隆新的基因,鑒定可與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列 分離靶蛋白質(zhì)，（可采用gel-shift assay) 克隆靶蛋白的表達基因。,利用DNA與蛋白質(zhì)間的相互作用,分離時空特異性表達基因的方法,利用蛋白質(zhì)之間的相互作用,酵母雙雜交法,顯微注射及細胞標記技術 目的：將外源DNA、RNA或標記物等導入早期胚胎細胞中，如運用細胞標記技術對胚胎早期卵裂球分化命運圖譜的研究。在小鼠和果蠅中常用于轉(zhuǎn)基因分析。 細胞標記物分類：,早期：活體染料如尼羅藍或中性紅，不能標記胚胎內(nèi)部組織 現(xiàn)在：細胞外-親脂性熒光染料如DiI/Dio，不適于組織切片

7、細胞內(nèi)-熒光標記葡聚糖和HRP，需顯微注射，通過熒光顯微鏡或組織化學方法進行定位。 示蹤基因：GFP和LacZ基因,染料細胞標記,熒光細胞標記,細胞移植,DNA/蛋白芯片 目的：高通量篩選不同胚胎細胞或組織中基因/蛋白表達圖譜，獲得不同時期或組織差異表達的基因或蛋白。,DNA chip Protein chip microRNA chip,分類：,應用DNA microarrays 研究基因表達,High output screening genes expressed differently in different tissues or at different stages in dev

8、elopment,基因組時代：人類基因組計劃,控制發(fā)育的基因的鑒定及其表達和功能檢測方法,后基因組時代功能基因組時代,空間結(jié)構(gòu)？,胞內(nèi)分布及靶位？,影響器官？,基因類型？,底物？,影響途徑？,發(fā)育遺傳學技術,發(fā)育生物學基本任務之一： 研究基因在胚胎發(fā)育中的作用 正向遺傳學技術：大規(guī)模隨機誘變，產(chǎn)生發(fā)育異常的突變個體，然后再尋找突變的基因。 1. 大規(guī)模誘變篩選; 2. 插入誘變篩選; 3. 突變基因的克隆;,從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因,從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因,自然群體中的突變體； 化學誘變劑處理，如亞硝基乙脲乙亞硝基脲 (N-nitroso-N-ethylu

9、rea ethylnitrosourea, ENU)； 外源DNA插入法，如DNA注射、病毒感染、轉(zhuǎn)座子利用等； X射線或 r射線照射,獲得突變體的方法,自發(fā)突變 (spontaneous mutation),Recessive mutation (純合體狀態(tài)) /Dominant (雜合體狀態(tài)) /semi-dominant,自發(fā)突變 (spontaneouse mutation),semi-dominant mutation (半顯性突變),斑馬魚上ENU化學突變研究的成就(1996),從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因,化學誘變法,大規(guī)模誘變篩選,通過射線或化學誘變劑處理父本個體

10、，在其生殖系細胞中產(chǎn)生隨機突變，然后與wild-type母本個體雜交，F(xiàn)1個體中可能攜帶有基因突變。F1與野生型，F(xiàn)2 (50% 雜合突變體)群體內(nèi)雜交，F(xiàn)3 (25%)可出現(xiàn)純合突變個體，發(fā)育異常,DNA插入誘變法,反轉(zhuǎn)錄病毒插入引起的突變的鑒定,DNA插入誘變法,大規(guī)模誘變篩選,突變后的表型改變： 致死性 功能喪失：最常見。突變后的蛋白質(zhì)比野生型活性差；某一蛋白質(zhì)完全失活的突變?yōu)闊o效突變 (null mutation) 功能獲得：如某些受體突變后活化,插入誘變篩選,利用轉(zhuǎn)座子(transposon)或病毒載體做誘變劑。果蠅中為P-因子，可以隨即插入基因組中，并可以在基因組中移動，包括特殊序

11、列和轉(zhuǎn)座酶，后代生殖細胞中，轉(zhuǎn)座酶就會誘導P-因子在基因中隨即轉(zhuǎn)座造成基因突變。,突變基因的克隆,突變體獲得后，克隆引起該突變的基因 插入突變：利用P-因子序列作為探針，從突變體文庫中篩選出含P-因子的克隆，從而確定其插入點及被阻斷的基因。 化學誘變或射線突變：定位克隆 (positional cloning)根據(jù)目的基因在染色體上的位置進行基因分離的。通過分析突變位點與已知分子標記的連鎖關系來確定突變基因的染色體位置。常用的分子標記包括單核苷酸多態(tài)性 (SNPs)。,Positional cloning: 1) 確定突變基因的染色體定位 2) 獲取該片斷的基因組序列：數(shù)據(jù)庫 3) 生物信息學

12、確定該片段可能含有的基因，結(jié)合其可能的功能和該突變體的表型，確定候選基因 4) 實驗驗證：功能異常，野生型rescue, RNAi,發(fā)育遺傳學技術,反向遺傳學技術：通過功能喪失 (loss of function) 或功能獲得 (gain of function) 實驗，研究胚胎個體所產(chǎn)生的表型而分析目的基因的功能。 基因修飾 1. 基因敲除; 2. 條件基因敲除; 3. 轉(zhuǎn)基因;,Constructing knockout mice,獲得攜帶有特定基因突變個體的技術，研究基因在發(fā)育中功能的重要方法。 1) 構(gòu)建用于基因重組的突變基因結(jié)構(gòu) 2) 重組基因?qū)肱咛ジ杉毎?(ES) 3) 注射ES

13、入胚胎中以獲得雜合性小鼠 4) 小鼠雜交獲得純合體小鼠并進行表型分析。,Conditional knockout,僅使靶基因在特定的組織或發(fā)育時期失活。Cre-lox 系統(tǒng) 1) Cre編碼一種重組酶，可識別并結(jié)合位點并切除位于兩個LoxP 位點之間的序列。 2) 兩個品系：靶基因兩側(cè)都加入LoxP 位點; 轉(zhuǎn)入由組織特異性啟動子控制的cre基因 3) 小鼠雜交， cre基因會在特異性組織中表達，切除靶基因，使之失活。,Transgenic technique,1) 將外源基因注射到受精卵的細胞核中， 缺點是無法控制外源基因的插入情況， 只能通過后代檢查DNA。 2) 將外源基因轉(zhuǎn)化到ES中，

14、同gene knockout 3) 小鼠雜交。,發(fā)育遺傳學技術,反向遺傳學技術： 通過抑制性因子抑制目的基因的功能 1. RNA干擾; 2. 嗎啉代寡聚核苷酸 (MO): 利用反義寡聚核苷酸抑制特定mRNA (5-UTR) 的翻譯而阻斷目的基因功能的方法。主要應用在斑馬魚和爪蟾研究中，但現(xiàn)在也用于miRNA研究中。,RNAi 技術,1) 雙鏈RNA抑制含其同源序列基因的表達，抑制基因表達的新方法 2) 線蟲中：直接導入dsRNA; 脊椎動物中siRNA (21-23 nt),發(fā)育遺傳學技術,反向遺傳學技術： 其它手段： 1. 顯性抑制 (dominant negative): 通過過量表達顯性抑制型蛋白 (是通過某種修飾或加工，可以抑制野生型蛋白功能的缺陷型蛋白) 以阻斷內(nèi)源蛋白的活性，研究其功能的方法。如將某些信號傳導受體的膜內(nèi)區(qū)域缺失等。 2. 基因捕獲 (gene trap) 與增強子捕獲 (enhancer trap): 是一種報道基因轉(zhuǎn)基因技術，用于獲得在某些組織中特異性表達的基因。如報道基因轉(zhuǎn)入體內(nèi)，如附近有內(nèi)源性增強子，就可啟動報道基因的啟動子激活。,