發(fā)育生物學(xué)——發(fā)育生物學(xué)研究技術(shù)ppt課件

發(fā)育生物學(xué)研究技術(shù),常用發(fā)育生物學(xué)研究技術(shù)簡介,顯微鏡技術(shù) (成像imaging); 組織切片技術(shù) (經(jīng)典解剖形態(tài)學(xué)morphology); 生化分子生物學(xué); 原位雜交技術(shù) (in situ hybridization); 顯微注射; 報告基因技術(shù); 細(xì)胞標(biāo)記技術(shù);,顯微鏡技術(shù) 目的：觀察胚胎個體 分類： 光學(xué)(optical)顯微鏡: 體視顯微鏡: 組織分離用 熒光顯微鏡：,顯微鏡技術(shù) 激光共聚焦顯微鏡 (laser confocal)：熒光標(biāo)記，對胚胎或細(xì)胞中的特定蛋白質(zhì)或mRNA的分布進(jìn)行定性或定量研究；圖像采集的效果很好；細(xì)胞或組織的三維重塑 (reconstructing),組織切片技術(shù) 目的：觀察胚胎的內(nèi)部組織學(xué)結(jié)構(gòu) 分類： 石蠟組織切片：石蠟包埋，切片機(jī)切片 冷凍切片：低溫包埋劑包埋，低溫切片機(jī)切片，對樣品中核酸的保存較好，但切片的質(zhì)量差。,分子生物學(xué)技術(shù) 目的：檢測目的基因或蛋白質(zhì)在某一發(fā)育時期或特定組織中的表達(dá) 分類：,Polymerase chain reaction (PCR): DNA amplification Real-time quantitative PCR: RNA 定量 RT-PCR/Northern blotting: mRNA expression Western blotting: protein expression 免疫共沉淀 (Co-IP): protein-protein interaction,Northern Blotting Analysis,Southern Blotting Analysis,Real-time PCR 儀,原位雜交技術(shù) 目的：檢測某一特定基因mRNA在某胚胎和組織中的分布情況 分類：,放射性標(biāo)記探針：放射自顯影 非放射性標(biāo)記探針： 地高辛(DIG)-免疫組化 熒光素-熒光免疫組化 (FISH),原位探測基因表達(dá),Gene expressing guiding development When and where particular genes are active Intact embryos or sections of embryos In situ hybrid: probes-radioactive isotope, fluorescence tag or an enzyme Dectection: autoradiography, fluorescence microscope, enzyme-substrate reaction,原位探測基因表達(dá),原位探測基因表達(dá),Distribution of mRNA for the growth factor Vg-1 in the amphibian egg. In situ hybridization with a radioactive probe. (yellow signals),原位探測基因表達(dá),利用原位雜交技術(shù)研究基因表達(dá)的時空譜,mRNA的檢測,FISH 探測基因表達(dá),報道基因 (reporter gene) 技術(shù) 目的：用于啟動子/增強(qiáng)子的分析研究。采用一些產(chǎn)物易于檢測的基因(報道基因)與待研究的表達(dá)調(diào)控序列串聯(lián)，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入胚胎體內(nèi)，分析報道基因產(chǎn)物的表達(dá)來研究目的片斷的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性。 常用報道基因分類：,綠色熒光蛋白 (GFP): 分布用熒光顯微鏡觀察 lacZ基因: 編碼 -半乳糖苷酶, 用特異底物顯色研究其產(chǎn)物分布 熒光素酶 (luciferase): 常用體外基因表達(dá)活性分析，近年開始體內(nèi)研究,啟動子活性檢測法,表達(dá)載體的構(gòu)建：,利用大分子間的相互作用克隆新的基因,鑒定可與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列 分離靶蛋白質(zhì)，（可采用gel-shift assay) 克隆靶蛋白的表達(dá)基因。,利用DNA與蛋白質(zhì)間的相互作用,分離時空特異性表達(dá)基因的方法,利用蛋白質(zhì)之間的相互作用,酵母雙雜交法,顯微注射及細(xì)胞標(biāo)記技術(shù) 目的：將外源DNA、RNA或標(biāo)記物等導(dǎo)入早期胚胎細(xì)胞中，如運(yùn)用細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)對胚胎早期卵裂球分化命運(yùn)圖譜的研究。在小鼠和果蠅中常用于轉(zhuǎn)基因分析。 細(xì)胞標(biāo)記物分類：,早期：活體染料如尼羅藍(lán)或中性紅，不能標(biāo)記胚胎內(nèi)部組織 現(xiàn)在：細(xì)胞外-親脂性熒光染料如DiI/Dio，不適于組織切片 細(xì)胞內(nèi)-熒光標(biāo)記葡聚糖和HRP，需顯微注射，通過熒光顯微鏡或組織化學(xué)方法進(jìn)行定位。 示蹤基因：GFP和LacZ基因,染料細(xì)胞標(biāo)記,熒光細(xì)胞標(biāo)記,細(xì)胞移植,DNA/蛋白芯片 目的：高通量篩選不同胚胎細(xì)胞或組織中基因/蛋白表達(dá)圖譜，獲得不同時期或組織差異表達(dá)的基因或蛋白。,DNA chip Protein chip microRNA chip,分類：,應(yīng)用DNA microarrays 研究基因表達(dá),High output screening genes expressed differently in different tissues or at different stages in development,基因組時代：人類基因組計劃,控制發(fā)育的基因的鑒定及其表達(dá)和功能檢測方法,后基因組時代功能基因組時代,空間結(jié)構(gòu)？,胞內(nèi)分布及靶位？,影響器官？,基因類型？,底物？,影響途徑？,發(fā)育遺傳學(xué)技術(shù),發(fā)育生物學(xué)基本任務(wù)之一： 研究基因在胚胎發(fā)育中的作用 正向遺傳學(xué)技術(shù)：大規(guī)模隨機(jī)誘變，產(chǎn)生發(fā)育異常的突變個體，然后再尋找突變的基因。 1. 大規(guī)模誘變篩選; 2. 插入誘變篩選; 3. 突變基因的克隆;,從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因,從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因,自然群體中的突變體； 化學(xué)誘變劑處理，如亞硝基乙脲乙亞硝基脲 (N-nitroso-N-ethylurea ethylnitrosourea, ENU)； 外源DNA插入法，如DNA注射、病毒感染、轉(zhuǎn)座子利用等； X射線或 r射線照射,獲得突變體的方法,自發(fā)突變 (spontaneous mutation),Recessive mutation (純合體狀態(tài)) /Dominant (雜合體狀態(tài)) /semi-dominant,自發(fā)突變 (spontaneouse mutation),semi-dominant mutation (半顯性突變),斑馬魚上ENU化學(xué)突變研究的成就(1996),從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因,化學(xué)誘變法,大規(guī)模誘變篩選,通過射線或化學(xué)誘變劑處理父本個體，在其生殖系細(xì)胞中產(chǎn)生隨機(jī)突變，然后與wild-type母本個體雜交，F(xiàn)1個體中可能攜帶有基因突變。F1與野生型，F(xiàn)2 (50% 雜合突變體)群體內(nèi)雜交，F(xiàn)3 (25%)可出現(xiàn)純合突變個體，發(fā)育異常,DNA插入誘變法,反轉(zhuǎn)錄病毒插入引起的突變的鑒定,DNA插入誘變法,大規(guī)模誘變篩選,突變后的表型改變： 致死性 功能喪失：最常見。突變后的蛋白質(zhì)比野生型活性差；某一蛋白質(zhì)完全失活的突變?yōu)闊o效突變 (null mutation) 功能獲得：如某些受體突變后活化,插入誘變篩選,利用轉(zhuǎn)座子(transposon)或病毒載體做誘變劑。果蠅中為P-因子，可以隨即插入基因組中，并可以在基因組中移動，包括特殊序列和轉(zhuǎn)座酶，后代生殖細(xì)胞中，轉(zhuǎn)座酶就會誘導(dǎo)P-因子在基因中隨即轉(zhuǎn)座造成基因突變。,突變基因的克隆,突變體獲得后，克隆引起該突變的基因 插入突變：利用P-因子序列作為探針，從突變體文庫中篩選出含P-因子的克隆，從而確定其插入點及被阻斷的基因。 化學(xué)誘變或射線突變：定位克隆 (positional cloning)根據(jù)目的基因在染色體上的位置進(jìn)行基因分離的。通過分析突變位點與已知分子標(biāo)記的連鎖關(guān)系來確定突變基因的染色體位置。常用的分子標(biāo)記包括單核苷酸多態(tài)性 (SNPs)。,Positional cloning: 1) 確定突變基因的染色體定位 2) 獲取該片斷的基因組序列：數(shù)據(jù)庫 3) 生物信息學(xué)確定該片段可能含有的基因，結(jié)合其可能的功能和該突變體的表型，確定候選基因 4) 實驗驗證：功能異常，野生型rescue, RNAi,發(fā)育遺傳學(xué)技術(shù),反向遺傳學(xué)技術(shù)：通過功能喪失 (loss of function) 或功能獲得 (gain of function) 實驗，研究胚胎個體所產(chǎn)生的表型而分析目的基因的功能。 基因修飾 1. 基因敲除; 2. 條件基因敲除; 3. 轉(zhuǎn)基因;,Constructing knockout mice,獲得攜帶有特定基因突變個體的技術(shù)，研究基因在發(fā)育中功能的重要方法。 1) 構(gòu)建用于基因重組的突變基因結(jié)構(gòu) 2) 重組基因?qū)肱咛ジ杉?xì)胞 (ES) 3) 注射ES入胚胎中以獲得雜合性小鼠 4) 小鼠雜交獲得純合體小鼠并進(jìn)行表型分析。,Conditional knockout,僅使靶基因在特定的組織或發(fā)育時期失活。Cre-lox 系統(tǒng) 1) Cre編碼一種重組酶，可識別并結(jié)合位點并切除位于兩個LoxP 位點之間的序列。 2) 兩個品系：靶基因兩側(cè)都加入LoxP 位點; 轉(zhuǎn)入由組織特異性啟動子控制的cre基因 3) 小鼠雜交， cre基因會在特異性組織中表達(dá)，切除靶基因，使之失活。,Transgenic technique,1) 將外源基因注射到受精卵的細(xì)胞核中， 缺點是無法控制外源基因的插入情況， 只能通過后代檢查DNA。 2) 將外源基因轉(zhuǎn)化到ES中，同gene knockout 3) 小鼠雜交。,發(fā)育遺傳學(xué)技術(shù),反向遺傳學(xué)技術(shù)： 通過抑制性因子抑制目的基因的功能 1. RNA干擾; 2. 嗎啉代寡聚核苷酸 (MO): 利用反義寡聚核苷酸抑制特定mRNA (5-UTR) 的翻譯而阻斷目的基因功能的方法。主要應(yīng)用在斑馬魚和爪蟾研究中，但現(xiàn)在也用于miRNA研究中。,RNAi 技術(shù),1) 雙鏈RNA抑制含其同源序列基因的表達(dá)，抑制基因表達(dá)的新方法 2) 線蟲中：直接導(dǎo)入dsRNA; 脊椎動物中siRNA (21-23 nt),發(fā)育遺傳學(xué)技術(shù),反向遺傳學(xué)技術(shù)： 其它手段： 1. 顯性抑制 (dominant negative): 通過過量表達(dá)顯性抑制型蛋白 (是通過某種修飾或加工，可以抑制野生型蛋白功能的缺陷型蛋白) 以阻斷內(nèi)源蛋白的活性，研究其功能的方法。如將某些信號傳導(dǎo)受體的膜內(nèi)區(qū)域缺失等。 2. 基因捕獲 (gene trap) 與增強(qiáng)子捕獲 (enhancer trap): 是一種報道基因轉(zhuǎn)基因技術(shù)，用于獲得在某些組織中特異性表達(dá)的基因。如報道基因轉(zhuǎn)入體內(nèi)，如附近有內(nèi)源性增強(qiáng)子，就可啟動報道基因的啟動子激活。,