熒光定量PCR原理及操作步驟ppt課件
熒光定量PCRreal time-PCR,1,定量PCR反應體系,2,定量與常規(guī)PCR的差別,常規(guī)PCR技術： 對PCR擴增反應的終產物進行定量及定性分析,定量PCR技術： 通過對PCR擴增反應中每一個循環(huán)產物熒光信號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析,三個關鍵詞： 實時，定量，熒光,3,PCR分四個階段,4,如何定量？,Ct值的概念 Ct值的定義是PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數增長階段的閾值所對應的循環(huán)次數。,5,定量原理,確定初始模板的濃度,初始 DNA量越多, 熒光達到某一值（域值）時所需要的循環(huán)數越少 Log濃度與循環(huán)數呈線性關系，根據樣品擴增達到域值的循環(huán)數就可計算出樣品中所含的模板量,6,7,起點定量與終點定量,8,熒光化學,SYBR Green 1,TaqMan,9,TaqMan,10,SYBR Green I 工作原理,。 SYBR Green 1 結合到雙鏈DNA的小溝部位 SYBR Green 1 染料只有和雙鏈DNA結合后才發(fā)熒光,未結合SYBR Green 1 dye,變性: 無熒光信號,11,SYBR Green I 應用范圍,起始模板濃度定量 融解曲線分析 -可區(qū)分單一產物、變異產物、多種產物和（或）引物二聚體 基因型分析,12,SYBR Green I 優(yōu)點,SYBR Green I 缺點,13,14,PCR程序指南,15,UNG酶使用原理,16,金牌Tag酶活性,17,參比熒光：管家熒光ROX,18,ROX校正效果,19,96孔板設置舉例,20,PCR曲線,21,標準曲線,22,
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熒光定量PCRreal time-PCR,1,定量PCR反應體系,2,定量與常規(guī)PCR的差別,常規(guī)PCR技術： 對PCR擴增反應的終產物進行定量及定性分析,定量PCR技術： 通過對PCR擴增反應中每一個循環(huán)產物熒光信號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析,三個關鍵詞： 實時，定量，熒光,3,PCR分四個階段,4,如何定量？,Ct值的概念 Ct值的定義是PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數增長階段的閾值所對應的循環(huán)次數。,5,定量原理,確定初始模板的濃度,初始 DNA量越多, 熒光達到某一值（域值）時所需要的循環(huán)數越少 Log濃度與循環(huán)數呈線性關系，根據樣品擴增達到域值的循環(huán)數就可計算出樣品中所含的模板量,6,7,起點定量與終點定量,8,熒光化學,SYBR Green 1,TaqMan,9,TaqMan,10,SYBR Green I 工作原理,。 SYBR Green 1 結合到雙鏈DNA的小溝部位 SYBR Green 1 染料只有和雙鏈DNA結合后才發(fā)熒光,未結合SYBR Green 1 dye,變性: 無熒光信號,11,SYBR Green I 應用范圍,起始模板濃度定量 融解曲線分析 -可區(qū)分單一產物、變異產物、多種產物和（或）引物二聚體 基因型分析,12,SYBR Green I 優(yōu)點,SYBR Green I 缺點,13,14,PCR程序指南,15,UNG酶使用原理,16,金牌Tag酶活性,17,參比熒光：管家熒光ROX,18,ROX校正效果,19,96孔板設置舉例,20,PCR曲線,21,標準曲線,22,
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