重組蛋白的表達(dá)系統(tǒng)(詳細(xì)版)（醫(yī)學(xué)研究）

重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)1.原核表達(dá)系統(tǒng)2.酵母表達(dá)系統(tǒng)3.昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)4.哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)5.轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)6.轉(zhuǎn)基因動物表達(dá)系統(tǒng)7.表達(dá)系統(tǒng)的選擇1醫(yī)藥材料一、原核表達(dá)系統(tǒng)原核表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展完善、流程簡單快速、成本低、產(chǎn)量高，對大部分蛋白來說都值得一試，尤其適宜于表達(dá)原核來源的以及不需要翻譯后修飾的真核蛋白。2醫(yī)藥材料1.1 表達(dá)菌株表達(dá)菌株原核表達(dá)系統(tǒng)剛用的宿主菌有E.coli，Bacillus等。其中革蘭式陽性的Bacillus更適宜在其周質(zhì)空間分泌表達(dá)重組蛋白；革蘭氏陰性的E.coli能夠廣譜表達(dá)異源蛋白。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前發(fā)展最完善的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。常用大腸桿菌菌株有BL21（DE3）、BL21（DE3）Star、B834（DE3）等，這些菌株都敲除了蛋白酶，并溶源了噬菌體DE3。DE3是的一種衍生噬菌體，帶有噬菌體21抗性區(qū)和 lacI基因，lacUV5啟動子，以及 T7 RNA聚合酶基因。這一區(qū)段被插入int基因，因此阻止了DE3在沒有輔助噬菌體時整合到染色體上或從染色體切出。一旦形成DE3溶原狀態(tài)，就只有受IPTG誘導(dǎo)的lacUV5啟動子指導(dǎo)T7 RNA聚合酶基因轉(zhuǎn)錄，在溶原培養(yǎng)體系中加入IPTG誘導(dǎo)T7 RNA聚合酶生產(chǎn)，繼而質(zhì)粒上的目的DNA開始轉(zhuǎn)錄。同時，還有一些特殊設(shè)計的菌株以表達(dá)有特殊需要的重組蛋白，如甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型表達(dá)硒代甲硫氨酸蛋白，溶解性增強(qiáng)的菌株表達(dá)毒性蛋白，補(bǔ)充了稀有密碼子的菌株表達(dá)真核蛋白等，表2給出了常用的大腸桿菌表達(dá)菌株。3醫(yī)藥材料表2 常用E.coli表達(dá)菌株4醫(yī)藥材料1.2 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)采用質(zhì)粒為表達(dá)載體，質(zhì)粒上的重要元件包括復(fù)制子，啟動子，終止子，多克隆位點，信號肽，融合標(biāo)簽，篩選標(biāo)記等（圖1）。原核表達(dá)載體已經(jīng)發(fā)展得比較完善，有多種質(zhì)?？晒┻x擇(表4)。復(fù)制子：復(fù)制子決定著質(zhì)粒載體在宿主中的拷貝數(shù)。通常情況下質(zhì)?？截悢?shù)越高，重組蛋白的表達(dá)量就越高，但是高拷貝的質(zhì)粒也會嚴(yán)重影響宿主的生長，質(zhì)粒本身也不穩(wěn)定，容易丟失和突變?？寺≥d體常采用拷貝數(shù)低、嚴(yán)謹(jǐn)復(fù)制的復(fù)制子，如pSC101；表達(dá)載體通常選用高拷貝的復(fù)制子，如pCoE1，pMBI（pUC），等。如果需要進(jìn)行多個質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)化，就要根據(jù)復(fù)制子的相容性選用不同復(fù)制系統(tǒng)的復(fù)制子，如pSC101和pUC共表達(dá)。5醫(yī)藥材料啟動子：表達(dá)重組蛋白時，我們需要考慮啟動子的強(qiáng)弱、作用方式、調(diào)控方式和本底表達(dá)水平。表達(dá)載體通常選用強(qiáng)啟動子以提高表達(dá)量，但弱啟動子也有其優(yōu)點，如降低本底表達(dá)、增加可溶表達(dá)、表達(dá)小量伴侶蛋白等。按照作用方式，啟動子可以分為兩類：組成型表達(dá)的啟動子使宿主不停地表達(dá)重組蛋白，常用于工業(yè)生產(chǎn)，如S等；誘導(dǎo)型表達(dá)的啟動子使宿主僅在受到誘導(dǎo)（誘導(dǎo)劑、溫度等）時表達(dá)目的蛋白，誘導(dǎo)型啟動子使重組蛋白的表達(dá)容易控制，同時降低了外源蛋白對細(xì)菌生長的影響。6醫(yī)藥材料圖1：大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET-22b(+)圖譜及多克隆位點7醫(yī)藥材料8醫(yī)藥材料早期大腸桿菌表達(dá)體系中，常見的啟動子是lac和lacUV5。lac是一個弱啟動子，很難使外源基因得到高表達(dá)。目前使用的含有需要小量共表達(dá)的蛋白(如分子伴侶，蛋白抑制劑等)的載體，有很多都采用了經(jīng)典的lac啟動子。強(qiáng)啟動子中，tac和trc是lac啟動子的變體，其重組蛋白產(chǎn)率能夠達(dá)到細(xì)胞總蛋白量的15-30%。araBAD啟動子的誘導(dǎo)劑是便宜無毒的L-阿拉伯糖，本底表達(dá)量低，啟動能力比tac稍弱。T7則是目前原核表達(dá)系統(tǒng)中最高效的啟動子，pET表達(dá)系統(tǒng)即是以它為中心構(gòu)建的。T7啟動子來源于噬菌體，專一與T7啟動子結(jié)合的T7 RNA聚合酶則被整合在宿主菌的基因組中。在噬菌體溶源的表達(dá)宿主菌，如BL21（DE3）中，lacI抑制T7 RNA聚合酶的表達(dá)，IPTG的加入可以解除這種抑制。當(dāng)受到誘導(dǎo)時，T7 RNA聚合酶開始表達(dá)并結(jié)合在T7啟動子上，啟動重組蛋白的表達(dá)。T7 RNA聚合酶活性很高，轉(zhuǎn)錄速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍，使其下游的重組蛋白得到高效表達(dá)，其產(chǎn)率可以達(dá)到細(xì)菌總蛋白量的50%以上。T7lac啟動子則在T7啟動子下游加入了一個lac操縱子，其中帶有一個常規(guī)啟動子和lac阻遏蛋白的編碼序列。lac阻遏蛋白可以抑制宿主合成T7 RNA聚合酶，并阻斷T7 RNA聚合酶導(dǎo)致的目的基因轉(zhuǎn)錄，從而降低重組蛋白的本底表達(dá)水平。PL、cspA啟動子使宿主菌能夠進(jìn)行溫度依賴型的表達(dá)。在溫度敏感型突變體菌株中，PL等啟動子使得宿主在30時抑制重組蛋白表達(dá)，而在42 時誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)；cspA啟動子則被高溫（37）抑制，低溫（10）啟動。溫度誘導(dǎo)型的啟動子避免了誘導(dǎo)劑的引入，降低了使用成本，同時也降低了誘導(dǎo)劑對細(xì)胞的傷害。9醫(yī)藥材料終止子：轉(zhuǎn)錄終止子按照是否依賴和不依賴因子的作用分為兩類，這兩類終止子均在終止點前含有一段7-20bp的回文序列。終止子可以保護(hù)mRNA在核外不被降解，顯著延長mRNA的壽命，由此提高重組蛋白的表達(dá)量。但是對于T7系統(tǒng)來說，由于T7 RNA聚合酶效率極高，宿主中隨時都有充足的mRNA以供翻譯，因此大部分在T7系統(tǒng)中表達(dá)的重組蛋白并不在意質(zhì)粒上是否有終止子，只有一些自身帶有翻譯起始信號的外源基因需要終止子。啟動子受細(xì)胞類型的限制，在不同的細(xì)胞系中有很大不同，因此需根據(jù)宿主細(xì)胞（尤其是真核宿主）的類型選擇不同的啟動子以便于目的基因的高效表達(dá)。10醫(yī)藥材料融合標(biāo)簽：融合標(biāo)簽是與目的蛋白共表達(dá)的一段多肽，方便重組蛋白的純化、固定和檢測，表3給出了常用的重組標(biāo)簽。如果不需要對重組蛋白進(jìn)行純化，盡量不要引入融合標(biāo)簽，以免影響蛋白性質(zhì)；如果重組蛋白本身能夠結(jié)合某種親和柱，如某些金屬結(jié)合蛋白可以結(jié)合Ni-NTA，某些糖結(jié)合蛋白能夠特異識別糖類，也不必引入標(biāo)簽。融合標(biāo)簽的引入能夠大大簡化重組蛋白的純化流程，并提高蛋白溶解度。商業(yè)化表達(dá)質(zhì)粒，如pET、pGEX等提供了各種純化標(biāo)簽和融合蛋白供選，應(yīng)根據(jù)蛋白具體情況進(jìn)行選擇。His-tag是最常用的純化標(biāo)簽，它具有很多優(yōu)點：標(biāo)簽較短（10-20個氨基酸殘基），不帶電（pH8.0），免疫原性差，通常不影響重組蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，Ni2+親和力高，能夠通過一步純化達(dá)到60%-90%的純度。如果蛋白質(zhì)溶解度不高，導(dǎo)致折疊困難、表達(dá)量低，可以選擇較大的融合標(biāo)簽（GST、MBP、Trx等）幫助重組蛋白表達(dá)和折疊，提高重組蛋白溶解度，從而提高表達(dá)量。較大的融合標(biāo)簽有時也會導(dǎo)致翻譯困難甚至提前中止，純化后發(fā)現(xiàn)大部分都是標(biāo)簽蛋白也是常見現(xiàn)象。翻譯的提前中止會大大影響重組蛋白產(chǎn)率和后續(xù)純化，所以在短標(biāo)簽?zāi)軌蜻_(dá)到目的的時候，盡量不要選擇大的融合標(biāo)簽。標(biāo)簽位置的選擇也很重要：N端標(biāo)簽（短的或長的）自身帶有啟動子和適應(yīng)宿主偏好的密碼子，可以幫助目的蛋白表達(dá)，提高表達(dá)量，但是提前中止翻譯的蛋白片段也會被一并純化出來，降低重組蛋白純度，對蛋白酶敏感的、自身容易降解的以及一級序列中有集中的疏水殘基區(qū)的蛋白尤其要避免使用N端標(biāo)簽；C端標(biāo)簽則可以保證只有完整蛋白得到純化。另外，如果蛋白的近N端或近C端有重要功能區(qū)，如酶活中心、配體結(jié)合位點、二硫鍵、多聚體穩(wěn)定界面、相互作用界面等，則要避免純化標(biāo)簽位于該末端，以免影響重組蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。如果融合標(biāo)簽對蛋白性質(zhì)有較大影響，但又是純化所必須的，就可以考慮在純化過程中去除標(biāo)簽。主要有三種方法：化學(xué)裂解，如溴化氰（CNBr）、羥胺（NH2OH）等，能夠簡單有效地去除標(biāo)簽，但反應(yīng)條件苛刻（羥胺需要在pH9.0下反應(yīng)），特異性較差，而且會引入不必要的修飾，除包含體蛋白的處理外已經(jīng)很少使用了；酶解，如PPase等，其底物一般是一段比較長的肽鏈，特異性強(qiáng)，是目前比較常用的方法，缺點是酶切反應(yīng)需要較長的時間，也增加了蛋白純化的步驟，使純化變得繁瑣；IMPACT質(zhì)粒，該質(zhì)粒在純化標(biāo)簽和目的蛋白之間插入了一個蛋白質(zhì)內(nèi)含子（intein），intein具有可誘導(dǎo)的自切割活性，使用IMPACT質(zhì)粒表達(dá)的重組蛋白，只需要改變緩沖液的pH和溫度，即可切掉融合標(biāo)簽。11醫(yī)藥材料表3：常用融合標(biāo)簽12醫(yī)藥材料篩選標(biāo)記：在沒有壓力的環(huán)境下培養(yǎng)時，細(xì)菌中的外源質(zhì)粒常常隨著細(xì)胞復(fù)制而丟失。為了穩(wěn)定質(zhì)粒、表達(dá)重組蛋白，需要在載體中加入篩選標(biāo)記，使宿主菌在原則壓力下生長。原核系統(tǒng)中，常見的篩選標(biāo)記有藍(lán)白斑篩選（主要用于克?。I養(yǎng)缺陷性篩選和抗生素篩選，也可以將幾種篩選手段混合起來使用。常見的抗生素篩選標(biāo)記有：青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性、四環(huán)素抗性等。氨芐青霉素由于會被抗性細(xì)菌分泌的-內(nèi)酰胺酶和酸性環(huán)境破壞掉，其篩選效果會隨時間降低，不適宜連續(xù)發(fā)酵，將抗性基因反轉(zhuǎn)或換用對低pH不敏感的羧芐青霉素可以部分解決這個問題；卡那霉素不會被破壞，抗性較強(qiáng)，但是不同菌株的抗性差異較大，平板培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)液有所不同，使用時常需要針對個別菌株摸索適宜濃度；氯霉素抗性常見于有特殊用途的菌株和質(zhì)粒，如pLysS。抗生素濃度的過高或過低都會降低重組蛋白的表達(dá)量，另外在使用多個載體進(jìn)行共表達(dá)時，應(yīng)注意不同的質(zhì)粒要攜帶不同的篩選標(biāo)記，抗生素濃度也要比單獨表達(dá)適當(dāng)降低。分泌表達(dá)：如果不希望重組蛋白表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，可以在重組蛋白的N端加入信號肽，引導(dǎo)蛋白穿越細(xì)胞膜。大腸桿菌的分泌表達(dá)一般是分泌到周質(zhì)空間，各種芽孢桿菌則可以分泌到培養(yǎng)基中，簡化純化流程。分泌表達(dá)的表達(dá)量通常遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于胞質(zhì)表達(dá)，但是也有其優(yōu)勢：跨膜過程可以幫助重組蛋白折疊，提高其溶解性和活性；周至空間和培養(yǎng)基的氧化環(huán)境能夠幫助二硫鍵形成；也可用于除去牢固結(jié)合在蛋白上的配體；分泌到細(xì)胞外還能降低有毒重組蛋白對細(xì)胞的影響。13醫(yī)藥材料表4：常用原核表達(dá)載體質(zhì)粒14醫(yī)藥材料1.3 優(yōu)化表達(dá)條件優(yōu)化表達(dá)條件重組蛋白的表達(dá)流程很少有一次成形的，為了提高蛋白表達(dá)量、改善蛋白質(zhì)量，表達(dá)條件和流程的優(yōu)化是必須的。當(dāng)重組蛋白不表達(dá)時：如果重組蛋白不表達(dá)（包含體和可溶蛋白都沒有），首先檢查cDNA和質(zhì)粒是否正確，蛋白對宿主菌是否有很大毒性，然后嘗試更換菌株、質(zhì)粒載體和融合標(biāo)簽。原核蛋白在大腸桿菌中不能表達(dá)的情況很少見，通常是真核蛋白不能表達(dá)。不能表達(dá)的重組蛋白，即使在更換了宿主、載體后可以表達(dá)，表達(dá)量也不會很高，如果需要大規(guī)模生產(chǎn)，最好嘗試酵母和昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。當(dāng)表達(dá)量不理想時：檢查密碼子構(gòu)成，使其適應(yīng)宿主菌的密碼子偏好。稀有密碼子，尤其是位于重組蛋白N端的和大量集中的稀有密碼子，會降低mRNA穩(wěn)定性，顯著降低翻譯速度，引起翻譯提前中止、翻譯移碼和突變。將這些稀有密碼子（尤其是N端！）突變?yōu)樗拗髌玫拿艽a子，能夠顯著提高表達(dá)水平，必要時可以根據(jù)宿主的偏好重新合成cDNA。另一個解決辦法是與能夠表達(dá)稀有tRNA的質(zhì)粒共表達(dá)或直接采用帶有該質(zhì)粒的宿主菌，如BL21 codon plus、Rosetta等。更換菌株容易引起一系列問題，如啟動子相溶性、額外的抗生素抗性等，使用時要多加注意。15醫(yī)藥材料檢查外源基因cDNA5端結(jié)構(gòu)，高GC含量、回文結(jié)構(gòu)和相距較近的兩個起始密碼子會阻礙轉(zhuǎn)錄起始，表達(dá)量不理想時應(yīng)予以去除；檢查終止密碼，mRNA的通讀會降低重組蛋白的質(zhì)量和穩(wěn)定性。不同終止密碼子的終止效率在不同的物種中有很大差異，酵母和哺乳動物偏愛UAA和UGA，昆蟲和大腸桿菌傾向于用UAA；終止密碼子3端緊鄰的堿基也會影響終止效率，對于UAG來說，終止效率U、ACG，其他終止密碼GU、AC；也可以多加一個終止密碼子，以確保翻譯在正確的位點結(jié)束。改變?nèi)诤蠘?biāo)簽的位置，N端的標(biāo)簽可以幫助翻譯起始，從而提高蛋白的表達(dá)量?？扇鼙磉_(dá)低時：錯誤折疊是引起重組蛋白可溶表達(dá)量低，包含體表達(dá)量高的一個重要原因。改善重組蛋白折疊的方法有：降低誘導(dǎo)后培養(yǎng)溫度。重組蛋白表達(dá)得越慢，其折疊效果就越好，大腸桿菌在4時依然可以表達(dá)重組蛋白，而將培養(yǎng)溫度降低至25-30就能顯著改善蛋白折疊。此方法不適用于溫度誘導(dǎo)的重組蛋白表達(dá)；減少誘導(dǎo)劑。誘導(dǎo)劑濃度可以降低至1/10；選用Lac滲透酶缺陷型菌株，如Tuner、Rosetta等，也有很好的效果。這類菌株能夠使進(jìn)入每個細(xì)胞的誘導(dǎo)劑濃度相同。重組蛋白在所有細(xì)胞中的表達(dá)水平相當(dāng)時，減少誘導(dǎo)劑的效果更好；增加一個融合標(biāo)簽，或者更換一個分子量更大的標(biāo)簽。一般來說，越大的融合標(biāo)簽在提高重組蛋白溶解度方面效果越好，如MBP、GST的效果要優(yōu)于His6標(biāo)簽。以改善溶解度為目的的融合標(biāo)簽最好放置在目的蛋白的N端；改善二硫鍵的形成。大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的還原環(huán)境會阻礙二硫鍵的形成，如果要表達(dá)有一對或多對二硫鍵、特別是需要二硫鍵來穩(wěn)定分子內(nèi)和分子間結(jié)構(gòu)的重組蛋白，最好選用經(jīng)過特別設(shè)計的載體和菌株，如pET39b(+)和pET40b質(zhì)粒、BL21trxB，Origami和Rosetta-gami菌株。也可以考慮將蛋白分泌至周至空間，利用周至空間的氧化環(huán)境和酶來幫助二硫鍵的形成；只表達(dá)蛋白的可溶片段。16醫(yī)藥材料可溶片段突變體與全蛋白之間經(jīng)常有很大差異，如等電點、抗原性、寡聚狀態(tài)、活性、細(xì)胞定位等，突變時一定要謹(jǐn)慎考慮；突變掉可能引起順反異構(gòu)的Pro。順反異構(gòu)伴隨著很高的能量躍遷，是蛋白折疊的能量壁壘。突變掉這樣的Pro可以顯著幫助重組蛋白折疊，但是同樣會改變蛋白性質(zhì)，要謹(jǐn)慎考慮；與分子伴侶和折疊酶共表達(dá)。微量的分子伴侶即可顯著改善重組蛋白的折疊狀況，與重組蛋白同源的分子伴侶效果更加明顯。引入分子伴侶同樣也會引起復(fù)制子相容性、額外的抗生素抗性等問題，常用的分子伴侶有ATP依賴的DnaK-DnaJ-GrpE和GroEL-GroES，以及定位于周質(zhì)空間的分子伴侶SurA、PpiD等。折疊酶可以幫助蛋白跨過折疊過程的能量壁壘，使重組蛋白更快更好的折疊；在重組蛋白N端加入信號肽，將其引導(dǎo)至周質(zhì)空間，用跨膜過程來幫助蛋白折疊和二硫鍵形成，并減輕蛋白降解；在培養(yǎng)基中加入重組蛋白的配體或底物類似物。配體結(jié)合，有時僅僅是配體的存在就能大幅度的改善蛋白的折疊和穩(wěn)定性，此法不適用于無法被細(xì)菌攝取的配體；如果是多個蛋白共表達(dá)，可以考慮用一段柔軟的linker將兩個蛋白連接起來，使溶解度好的蛋白幫助溶解度差的蛋白折疊；改善蛋白穩(wěn)定性。能夠引起蛋白降解的因素很多，從蛋白自身性質(zhì)到宿主性質(zhì)不一而足，如果重組蛋白在表達(dá)時就被降解，表達(dá)量和穩(wěn)定性就會受到很大影響。在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白，需要牢記N端法則：當(dāng)N端第二個殘基是Leu、Arg、Lys、Phe、Tyr和Trp時，重組蛋白半衰期只有2分鐘，而小側(cè)鏈的氨基酸殘基，如Ala，則可以提高蛋白穩(wěn)定性。因此在設(shè)計載體時，要特別注意第二個密碼子，避免上述殘基的出現(xiàn)。17醫(yī)藥材料處理高毒性蛋白：外源基因的表達(dá)對大腸桿菌總有或多或少的影響，一般來說，經(jīng)過改造的宿主可以在很大程度上容忍重組蛋白，重組蛋白可以占到細(xì)胞總蛋白量的50%或更高。但少數(shù)毒性極高的重組蛋白，其本底表達(dá)就會殺死原核宿主，質(zhì)粒容易丟失，使其在大腸桿菌中很難得到高表達(dá)。以下方法可以降低重組蛋白的本底表達(dá)量。在培養(yǎng)基中加入1%的葡萄糖。葡萄糖是大腸桿菌的第一碳源，它的存在可以顯著降低由其他碳源引起的本底表達(dá)。采用嚴(yán)格啟動的載體和宿主。如PBAD載體、pLacI宿主。采用低拷貝數(shù)的載體。降低表達(dá)載體質(zhì)粒的拷貝數(shù)，可以明顯降低基礎(chǔ)表達(dá)水平。如pETcoco載體在每個細(xì)胞中僅一個拷貝，而受到IPTG誘導(dǎo)時又可以高效表達(dá)重組蛋白。采用可表達(dá)T7溶菌酶的宿主。T7溶菌酶是T7RNA聚合酶的抑制劑，采用含有T7溶菌酶質(zhì)粒的宿主，如pLysS，可以降低重組蛋白在大腸桿菌快速生長期的本底表達(dá)量，在受到IPTG誘導(dǎo)時也能較好的表達(dá)蛋白。除此之外，也可以通過共表達(dá)重組蛋白的抑制劑、提高抗生素濃度等方法提高毒性蛋白的表達(dá)量。18醫(yī)藥材料1.4 包涵體表達(dá)：包涵體表達(dá)：在使用高效的E.coli表達(dá)系統(tǒng)時，過量表達(dá)的重組蛋白常會在細(xì)胞內(nèi)凝聚，形成無活性的包涵體沉淀。在早期實驗中，包涵體被認(rèn)為是重組蛋白表達(dá)的大敵：包涵體蛋白折疊混亂、二硫鍵配對混亂、沒有生物活性、變復(fù)性條件需要長時間摸索等，即使包涵體蛋白成功復(fù)性，其均一性和活性依然備受質(zhì)疑。但是包涵體表達(dá)也有其優(yōu)勢：能夠很輕松的獲得超高的表達(dá)量，不可溶的重組蛋白不會被宿主內(nèi)的蛋白酶降解，重組蛋白的毒性被大大抑制，雜蛋白含量低（10%），容易純化等。由于這些優(yōu)點以及蛋白質(zhì)復(fù)性條件的不斷發(fā)展，表達(dá)包涵體蛋白逐漸為人們所接受，成為重組蛋白表達(dá)的一個常用方案。與可溶蛋白相反，提高培養(yǎng)溫度、延長培養(yǎng)時間、在較高的菌密度下誘導(dǎo)都有利于包涵體的形成；在破菌和變性溶解時加入還原劑能夠打開錯配的二硫鍵；在復(fù)性液中加入二硫鍵異構(gòu)酶、脯氨酸異構(gòu)酶、分子伴侶和蛋白的輔助因子可以幫助重組蛋白折疊；精氨酸和高分子量PEG能減輕蛋白分子的聚集；嘗試多種物理手段，如透析、快速稀釋和柱上復(fù)性等，有時對復(fù)性有奇效。包涵體的表達(dá)相對簡單，但其復(fù)性過程仍是依賴經(jīng)驗的，沒有通用的方法可以套用。19醫(yī)藥材料2.酵母表達(dá)系統(tǒng)酵母表達(dá)系統(tǒng)酵母表達(dá)系統(tǒng)兼有原核和高等真核系統(tǒng)的優(yōu)點。酵母是一種單細(xì)胞低等真核生物，培養(yǎng)條件普通，生長繁殖速度迅速，能夠耐受較高的流體靜壓，用于表達(dá)基因工程產(chǎn)品時，可以大規(guī)模生產(chǎn)，有效降低了生產(chǎn)成本。酵母表達(dá)外源基因具有一定的翻譯后加工能力，收獲的外源蛋白質(zhì)具有一定程度上的折疊加工和糖基化修飾，性質(zhì)較原核表達(dá)的蛋白質(zhì)更加穩(wěn)定，特別適合于表達(dá)真核生物基因和制備有功能的表達(dá)蛋白質(zhì)。某些酵母表達(dá)系統(tǒng)具有外分泌信號序列，能夠?qū)⑺磉_(dá)的外源蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外，因此很容易純化。應(yīng)用酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)外源基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物時也有不足之處，如產(chǎn)物蛋白質(zhì)的不均一、信號肽加工不完全、內(nèi)部降解、多聚體形成等，造成表達(dá)蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上的不一致。另外，還時常遇到表達(dá)產(chǎn)物的過度糖基化情況。因此，表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)根據(jù)具體情況作適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)。20醫(yī)藥材料2.1 常用酵母表達(dá)系統(tǒng)常用酵母表達(dá)系統(tǒng)(宿主宿主-載體系統(tǒng)載體系統(tǒng))3.1.1 釀酒酵母釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)由于遺傳和生理背景清楚而且安全，釀酒酵母是最早應(yīng)用于重組蛋白表達(dá)的酵母宿主菌。表達(dá)菌株：表達(dá)菌株：INVSC1是釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的常用菌株，它是一種雙倍體營養(yǎng)缺陷細(xì)胞株，在缺少組氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶的培養(yǎng)基中（如SC基本培養(yǎng)基）不能生長。GAL1是釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)中常用的啟動子，以半乳糖作為碳源可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄起始，葡萄糖則抑制轉(zhuǎn)錄。在葡萄糖培養(yǎng)基中，重組蛋白只有本底水平的表達(dá)，收集菌體并轉(zhuǎn)入只含半乳糖的培養(yǎng)基可以誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。也可以使用棉子糖代替葡萄糖作為碳源，棉子糖對GAL1啟動子沒有影響，既不會抑制也不會激活，在菌體達(dá)到一定濃度之后直接加入半乳糖即可誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。釀酒酵母可以對重組蛋白進(jìn)行乙?；揎?，以及沒有位點特異性的Ser/Thr磷酸化修飾，還可以進(jìn)行Asn N-糖基化和Ser/Thr O-糖基化修飾。釀酒酵母的糖基化修飾采用單一的甘露糖殘基，N-糖基化修飾由1，3-和1，6-甘露糖殘基構(gòu)成，往往形成40-200個甘露糖殘基的較大糖鏈，通過基因改造可以阻斷N-糖基化過程，使糖鏈縮短為Man8GlcNAc2核心糖鏈，糖鏈末端為1,3-甘露糖，使重組蛋白的抗原性明顯增強(qiáng)。O-糖基化則由不超過5個的甘露糖殘基聚合而成。21醫(yī)藥材料表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)質(zhì)粒真核表達(dá)系統(tǒng)常采用穿梭質(zhì)粒為表達(dá)載體。穿梭質(zhì)粒含有兩套復(fù)制子和啟動子，以及相應(yīng)的篩選標(biāo)記，可以在原核和真核兩種宿主中分別完成復(fù)制和表達(dá)，以方便對質(zhì)粒進(jìn)行遺傳操作和大量制備。釀酒酵母本身含有質(zhì)粒，其表達(dá)載體可以有自主復(fù)制型和整合型兩種。自主復(fù)制型質(zhì)粒中，高拷貝載體通常采用酵母天然質(zhì)粒的復(fù)制子，如2復(fù)制子，以使載體在宿主中達(dá)到較高的拷貝數(shù)（10-40），并獨立于宿主染色體進(jìn)行復(fù)制；低拷貝復(fù)制子則采用從酵母染色體中的自主復(fù)制序列（ARS）作為復(fù)制子，在宿主中嚴(yán)緊復(fù)制，通常一個細(xì)胞只有1-2個拷貝。真核表達(dá)載體常用的篩選標(biāo)記有營養(yǎng)缺陷型（如URA3、TRP1）和抗生素抗性（如滅瘟素、G418等）。22醫(yī)藥材料表5：常用釀酒酵母表達(dá)載體23醫(yī)藥材料整合型質(zhì)粒（如Yip5）不含ARS，必需整合到染色體上，隨染色體復(fù)制而復(fù)制。整合過程是高特異性的，但是拷貝數(shù)一般很低。多拷貝整合載體pMIRY2通過將目的基因靶向整合到rDNA簇上(rDNA簇為酵母基因組中串聯(lián)存在的150個重復(fù)序列)克服了這個缺點，利用pMIRY2質(zhì)?？梢缘玫?00個以上的拷貝。釀酒酵母作為表達(dá)菌株具有一定的局限性，如缺乏強(qiáng)有力的啟動子，重組蛋白產(chǎn)率往往只有全細(xì)胞蛋白的5%左右；難于高密度培養(yǎng)；分泌效率低，幾乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白，有時蛋白只被分泌到周至空間而非培養(yǎng)基中；重組蛋白容易過度糖基化；內(nèi)部降解復(fù)雜，重組蛋白的C端往往被截短。因此，現(xiàn)在一般使用甲醇酵母代替釀酒酵母，用于重組蛋白質(zhì)的真核表達(dá)。24醫(yī)藥材料2.1.2 畢赤酵母（畢赤酵母（P.Pastoris）表達(dá)系統(tǒng)）表達(dá)系統(tǒng)畢赤酵母是一種甲醇營養(yǎng)型酵母，可以依賴甲醇作為唯一碳源生長，甲醇可以誘導(dǎo)代謝所需的酶的表達(dá)。目前發(fā)現(xiàn)的所有甲醇營養(yǎng)型酵母，其甲醇代謝途徑都是相同的，甲醇首先被乙醇氧化酶（AOX）氧化，生成甲醛和過氧化氫。為了避免過氧化氫毒害細(xì)胞，這步反應(yīng)在過氧化物酶體中進(jìn)行。在畢赤酵母中，AOX有兩個編碼基因：AOX1和AOX2，其中AOX1基因編碼了細(xì)胞內(nèi)絕大多數(shù)的乙醇氧化酶。AOX1的表達(dá)受AOX啟動子的嚴(yán)格調(diào)控，本底表達(dá)水平極低，而甲醇誘導(dǎo)表達(dá)量可以達(dá)到細(xì)胞總蛋白的30%以上，使用AOX啟動子使得重組蛋白可以達(dá)到很高的表達(dá)量。畢赤酵母中，His+轉(zhuǎn)化子可以自發(fā)的進(jìn)行高拷貝整合，概率為1-10%，選擇帶有HIS4基因的表達(dá)載體即可以提高外源基因的拷貝數(shù)，從而提高重組蛋白的表達(dá)水平。畢赤酵母也是重組蛋白分泌表達(dá)的理想宿主。畢赤酵母本身只分泌表達(dá)少量蛋白，而且可以使用不含蛋白的培養(yǎng)基，因此分泌表達(dá)的重組蛋白在培養(yǎng)基中占據(jù)了絕對優(yōu)勢，大大簡化了純化步驟。25醫(yī)藥材料表達(dá)菌株：表達(dá)菌株：畢赤酵母的表達(dá)菌株都是由野生型石油酵母NRRL-Y11430改造而來，含有一種或幾種營養(yǎng)缺陷（如his4、arg4等）以方便篩選（表6）。研究發(fā)現(xiàn)，敲除了AOX基因的菌株有時能更好的表達(dá)外源蛋白，而且誘導(dǎo)所需的甲醇量也大大降低了。按照AOX基因的敲除情況和利用甲醇的能力，畢赤酵母表達(dá)菌株可以分為3類：在甲醇培養(yǎng)基中快速生長的Mut+；敲除了AOX1，在甲醇培養(yǎng)基中慢速生長的MutS和敲除了兩個AOX基因，不能利用甲醇的Mut-。不同的表型可以用來檢測外源基因在畢赤酵母轉(zhuǎn)化子中的整合方式。除此之外，還有敲除了蛋白酶（prb1、pep4）的菌株，以保護(hù)重組蛋白不受宿主蛋白酶的攻擊。蛋白酶缺陷型的菌株生長比較緩慢。與釀酒酵母相同，畢赤酵母也可以進(jìn)行二硫鍵形成、磷酸化、乙酰化、糖基化等翻譯后修飾，也只能利用甘露糖殘基對蛋白進(jìn)行糖基化修飾。畢赤酵母的N-糖基化糖鏈較短，平均每個支鏈8-14個甘露糖殘基，有利于重組蛋白的分子均一性；而且糖鏈中和糖鏈末端都沒有1,3-甘露糖，對重組蛋白抗原性的影響也比釀酒酵母低。26醫(yī)藥材料表6：常用畢赤酵母表達(dá)菌株27醫(yī)藥材料表達(dá)載體：表達(dá)載體：畢赤酵母本身沒有質(zhì)粒，自主復(fù)制型載體通常不穩(wěn)定，因此一般采用整合型載體。整合型載體的外源基因表達(dá)盒由幾部分組成：AOX啟動子、多克隆位點、融合標(biāo)簽、AOX終止子，有時還有一段AOX1基因的3端非編碼區(qū)，以便將外源基因表達(dá)盒導(dǎo)入基因組中的AOX1位點。一些載體還含有外分泌信號肽，使重組蛋白分泌至培養(yǎng)基中。某些載體允許構(gòu)建多個串聯(lián)的外源基因表達(dá)盒，以彌補(bǔ)整合型載體拷貝數(shù)量的缺陷。組成型表達(dá)的GAP啟動子可以替代AOX啟動子：GAP啟動子不需要甲醇誘導(dǎo)，表達(dá)水平較高，操作簡單，但不能表達(dá)對宿主有高毒性的蛋白。除表達(dá)盒之外，載體上還有篩選標(biāo)記（營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)基因、抗生素抗性基因）和在細(xì)菌中進(jìn)行拷貝增殖所必須的序列（啟動子、終止子、復(fù)制子、抗生素抗性基因等）。遺傳霉素G418抗性和博來霉素Zeocin抗性是常用的抗生素篩選標(biāo)記，常用于外源基因多拷貝的篩選。博來霉素抗性由于基因很?。?75bp），易于操作，而且也能對原核宿主進(jìn)行篩選，逐漸成為人們偏愛的篩選標(biāo)記。載體質(zhì)粒需要首先進(jìn)行線性化，才能重組到宿主染色體中?？寺≥d體上一般有多個線性化酶切位點供選?；蛑亟M可以發(fā)生在基因組中AOX基因區(qū)域和相應(yīng)的質(zhì)粒AOX區(qū)域之間，包括AOX啟動子、終止子和3非編碼區(qū)。通過選擇不同的線性化位點控制重組和外源基因的插入，可以導(dǎo)致宿主的不同甲醇利用表型（Mut+/Muts）。如選擇AOX啟動子和3端非編碼區(qū)的酶切位點，會導(dǎo)致染色體中的AOX基因被置換下來，使Mut+表型的宿主變?yōu)镸uts。如果需要多拷貝的外源基因，可以使用帶有HIS4基因的載體，并選擇HIS4中的酶切位點進(jìn)行線性化。這個線性化位點不會影響宿主的甲醇利用表型，最終得到的表達(dá)菌株表型與宿主相同。28醫(yī)藥材料圖2：酵母表達(dá)載體pPIC9K質(zhì)粒圖譜29醫(yī)藥材料表7：常用畢赤酵母表達(dá)載體30醫(yī)藥材料2.2 表達(dá)條件的優(yōu)化：表達(dá)條件的優(yōu)化：檢查外源基因的一級序列：5端不能有回文結(jié)構(gòu)；密碼子構(gòu)成需要適應(yīng)宿主的密碼子偏好，特別是N端前幾個，如使用了酵母厭惡的密碼子會大大影響表達(dá)量；高AT含量的序列會使轉(zhuǎn)錄提前中止；檢查重組蛋白序列，分泌表達(dá)時需要糖基化位點Asn-X-Ser/Thr。宿主表型：嘗試Mut+/MutS/Mut-表型的宿主，不同的基因在不同的宿主菌中可能表達(dá)量截然不同，多試幾種菌株，挑選最優(yōu)的表達(dá)體系。胞內(nèi)表達(dá)盡量使用MutS和Mut-的宿主菌，以降低乙醇氧化酶的表達(dá)，提高重組蛋白產(chǎn)率。多拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選：在使用pPIC3.5、pPIC9等多拷貝載體時，需要對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行大量的篩選工作。以抗生素為篩選標(biāo)記時，由于酵母的耐受能力與細(xì)胞密度有關(guān)，可能會出現(xiàn)假陽性，對挑選出來的高抗性轉(zhuǎn)化子，還應(yīng)做進(jìn)一步的PCR驗證，也可以省略平板篩選，直接做PCR鑒定。高克隆并不能一定帶來高表達(dá)，表達(dá)菌株的最終確定應(yīng)以表達(dá)量為準(zhǔn)。在表達(dá)分子量不大的蛋白時可以考慮換用pAO815載體，pAO815可以精確控制外源基因拷貝數(shù)，一次轉(zhuǎn)化即可獲得含有正確數(shù)目插入的轉(zhuǎn)化子，從而省去了轉(zhuǎn)化子的篩選工作，其缺點是克隆復(fù)雜，載體較大。31醫(yī)藥材料細(xì)胞定位：不是所有蛋白都適合分泌表達(dá)，如果重組蛋白本身定位于胞質(zhì)中而且沒有糖基化位點，應(yīng)該嘗試胞內(nèi)表達(dá)。培養(yǎng)基：重組蛋白分泌表達(dá)時，最好選用pH可在較寬范圍內(nèi)變化的磷酸緩沖液培養(yǎng)基，優(yōu)化培養(yǎng)基pH值能提高蛋白表達(dá)量和穩(wěn)定性?；九囵B(yǎng)基可以簡化純化過程，豐富培養(yǎng)基則使表達(dá)菌株的生長更好，還有助于穩(wěn)定重組蛋白，表達(dá)量偏低時最好使用豐富培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中的甘油濃度有時也會影響重組蛋白的表達(dá)量和活性，甘油濃度過高會影響培養(yǎng)基溶氧量，需注意。甲醇濃度：不同的宿主-載體-重組蛋白體系的最優(yōu)甲醇誘導(dǎo)濃度是不同的，從0.5%-5%都有可能，是需要優(yōu)化的一個重要表達(dá)條件。搖瓶培養(yǎng)時甲醇濃度不易監(jiān)測，需要根據(jù)經(jīng)驗補(bǔ)加；發(fā)酵培養(yǎng)則可以實現(xiàn)甲醇濃度的精確控制，有利于重組蛋白的高表達(dá)。細(xì)胞密度：提高細(xì)胞密度能夠顯著提高重組蛋白的表達(dá)量。在培養(yǎng)基中添加不會抑制AOX啟動子的碳源，如山梨糖醇、甘露糖、海藻糖、丙氨酸等，可以提高生物量。搖瓶培養(yǎng)效果不佳時，可以考慮發(fā)酵培養(yǎng)。蛋白酶：酵母細(xì)胞中有多種蛋白酶，也會分泌一些中性蛋白酶至培養(yǎng)基中。如果重組蛋白對這些酶敏感，可以通過幾種方法減輕蛋白酶的影響：降低培養(yǎng)基pH值，使蛋白酶失活；提高培養(yǎng)基中的蛋白含量，加入1%酪蛋白水解物，用雜蛋白保護(hù)重組蛋白；換用蛋白酶敲除的宿主菌。溶氧量：越高越好。畢赤酵母的生長對氧氣要求不高，高效表達(dá)則需要大量氧氣。使用搖瓶表達(dá)時，減少培養(yǎng)基體積并提高轉(zhuǎn)速可以顯著提高菌液溶氧量，如果培養(yǎng)基中加有抗生素，甚至可以去掉棉塞，只用4-8層紗布封口。32醫(yī)藥材料溫度：培養(yǎng)溫度超過30將使酵母的生長和表達(dá)趨于停滯，如果搖床或發(fā)酵罐溫度不穩(wěn)，設(shè)置在28。過糖基化：重組蛋白的過糖基化不僅影響均一性，而且有時還會影響表達(dá)量。嘗試胞內(nèi)表達(dá)、敲除N-糖基化位點可以降低重組蛋白的糖基化水平，也可以在純化時加入酶切除過長的糖鏈以提高蛋白均一性。菌株老化：表達(dá)菌株多次傳代后表達(dá)量會明顯降低，有時表達(dá)第一次、第二次產(chǎn)量都很高，然后突然下降。長期表達(dá)時應(yīng)注意保持菌株的新鮮：用原始菌株多做一些甘油菌，-80凍存，每次表達(dá)之前都取出一管重新劃線。重組蛋白不分泌或分泌量低：在分泌之前，重組蛋白必須正確折疊并形成正確的二硫鍵，錯誤和不當(dāng)折疊都會干擾分泌通路。共表達(dá)輔助因子，如分子伴侶（Hsp70、90家族）、二硫鍵異構(gòu)酶Pdi，過表達(dá)未折疊蛋白相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Hac1p（誘導(dǎo)分子伴侶和分泌通路酶的表達(dá)）等方法可以幫助重組蛋白進(jìn)入分泌通路，提高分泌表達(dá)量和蛋白活性。33醫(yī)藥材料3.昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)昆蟲細(xì)胞表達(dá)體統(tǒng)適宜表達(dá)高等真核生物蛋白。昆蟲細(xì)胞在培養(yǎng)中可以達(dá)到較高的細(xì)胞密度，具有復(fù)雜的翻譯后修飾，如蛋白質(zhì)的正確折疊與切割、二硫鍵形成、糖基化、磷酸化、?；?、酰胺化、羧甲基化等，很多修飾過程與哺乳動物都是相同的。與酵母相同，昆蟲細(xì)胞也可以進(jìn)行胞內(nèi)和分泌表達(dá)，啟動子很強(qiáng)，重組蛋白表達(dá)量高，而且更適宜表達(dá)多元蛋白復(fù)合物。昆蟲細(xì)胞表達(dá)外源重組蛋白可利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和病毒載體的感染。利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可以獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，但實驗周期較長，需幾周甚至幾個月時間，適宜連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)；利用病毒表達(dá)系統(tǒng)則可快速感染細(xì)胞，在幾天內(nèi)使外源基因整合到病毒載體中，適用于目的蛋白的表達(dá)檢測。34醫(yī)藥材料3.1 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)目前常用的昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)有桿狀病毒-昆蟲系統(tǒng)、InsectSelect穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)和果蠅表達(dá)系統(tǒng)三種。35醫(yī)藥材料3.1.1 桿狀病毒桿狀病毒-昆蟲（昆蟲（Baculovirus Expression Vector System,BEVS）表達(dá)系統(tǒng)：）表達(dá)系統(tǒng)：桿狀病毒（baculovirus）是一類以昆蟲細(xì)胞為天然宿主的核型多角體病毒，其基因組為80-160kb大小的單一閉合雙鏈超螺旋DNA，約編碼154個基因。目前研究較多的是苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcNPV)。AcNPV基因組具有較大的柔韌性，可以容忍較大片斷的外源基因和多個外源基因的插入，病毒感染后期，宿主細(xì)胞會被裂解，因此BEVS不適于連續(xù)培養(yǎng)。AcNPV能夠感染大約30種鱗翅類昆蟲細(xì)胞，在一定條件下也可以感染果蠅細(xì)胞，其中草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda，Sf)卵巢細(xì)胞和粉紋夜蛾（Trichoplusia ni）胚胎細(xì)胞被發(fā)展成最常用的表達(dá)宿主。桿狀病毒常用的表達(dá)宿主有來源于草地貪夜蛾的Sf9、Sf21和來源于粉紋夜蛾的High-Five、Tn-368，這些細(xì)胞質(zhì)生長較快，能夠達(dá)到較高的細(xì)胞密度，適應(yīng)懸浮培養(yǎng)，可以使用無血清培養(yǎng)基，是重組蛋白表達(dá)的理想宿主。由于昆蟲細(xì)胞的N-糖基化與哺乳動物細(xì)胞有較大差異，人們設(shè)計了能夠持續(xù)表達(dá)多種糖基轉(zhuǎn)移酶的Mimic Sf9細(xì)胞，用以表達(dá)更高等生物的蛋白。36醫(yī)藥材料AcNPV的基因表達(dá)分為立早期表達(dá)、早期表達(dá)、晚期表達(dá)、極晚期表達(dá)4個階段。前兩個階段的基因表達(dá)早于DNA復(fù)制，而后兩個階段的基因表達(dá)則伴隨著一系列的病毒DNA合成。其中在極晚期基因表達(dá)過程中，有兩種高效表達(dá)的蛋白：多角體蛋白和P10蛋白。多角體蛋白是形成包含體的主要成分，感染后期在細(xì)胞中的積累可高達(dá)3050，是病毒復(fù)制非必需成分，但對病毒粒子卻有保護(hù)作用，可使之保持穩(wěn)定和感染能力；P10蛋白也是病毒復(fù)制非必需成分，可在細(xì)胞中形成纖維狀物質(zhì)，可能與細(xì)胞溶解有關(guān)。多角體基因和P10基因的啟動子具有較強(qiáng)的啟動能力，因此這兩個基因位點成為桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)理想的外源基因插入位點。如將外源基因取代多角體蛋白基因構(gòu)成重組病毒，病毒體內(nèi)不含有包含體。不形成包含體的病毒和形成包含體的病毒在平板中形成的空斑不同,利用這一特征篩選含有外源基因的重組病毒。使用BEVS系統(tǒng)需要將外源基因整合入桿狀病毒基因組中。解決這個問題主要有兩種思路：Bac-to-Bac系統(tǒng)改造了AcNPV基因組，將之構(gòu)建成為一個超大的穿梭質(zhì)粒（130k），使其能夠在大腸桿菌中復(fù)制（單拷貝），再將帶有外源基因的供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入帶有病毒質(zhì)粒的大腸桿菌中，使它們在原核宿主體內(nèi)完成重組過程，將表達(dá)盒插入多角蛋白啟動子下游，純化后感染昆蟲細(xì)胞收集重組病毒；In-Fusion系統(tǒng)將野生型桿狀病毒線性化，與帶有外源基因和同源重組序列的載體直接共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，只有正確重組的病毒才能進(jìn)行自我復(fù)制并裂解宿主，以此來制備重組病毒。不論使用哪種方法，都需要在收集到大量重組病毒后再感染新鮮宿主，以獲得高質(zhì)量的重組蛋白。37醫(yī)藥材料3.1.2 穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)InsectSelect系統(tǒng)和果蠅表達(dá)系統(tǒng)都是使用整合型質(zhì)粒載體的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。整合型載體可以實現(xiàn)重組蛋白的連續(xù)發(fā)酵，外源基因隨機(jī)整合入染色體，表達(dá)受插入位點的影響，同時還可能會改變宿主細(xì)胞的生長特性，因此需要做大量的篩選工作才能獲得穩(wěn)定的表達(dá)菌株。InsectSelect（IS）系統(tǒng)：）系統(tǒng)：IS系統(tǒng)可以進(jìn)行重組蛋白的昆蟲細(xì)胞連續(xù)分泌培養(yǎng)。此系統(tǒng)使用的載體為pMIB/V5-His A，B，C質(zhì)粒，包括OpIE2、OpIE1啟動子、蜜蜂蜂毒分泌信號肽（HBM）、滅瘟素抗性基因、C端V5抗原和His標(biāo)簽，以及在大腸桿菌中復(fù)制所必須的組分。OpIE2、OpIE1啟動子來源于桿狀病毒OpMNPV，該病毒的天然宿主為冷杉合毒蛾Orgyia pseudotsugata，常用的表達(dá)宿主有Sf9、Sf21、High Five、Kc1（果蠅）、S2（果蠅）。OpIE2啟動子比OpIE1強(qiáng)5-10倍，用于外源基因的表達(dá)，后者則用于滅瘟素抗性基因的表達(dá)。OpIE2為組成型強(qiáng)啟動子，與HBM信號肽協(xié)同，使得重組蛋白能夠在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行連續(xù)分泌培養(yǎng)。質(zhì)粒C端有可選的V5抗原和His標(biāo)簽，方便重組蛋白檢測和純化。外源基因插入載體后在大腸桿菌中擴(kuò)增，純化后轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。一旦宿主細(xì)胞成功表達(dá)重組蛋白，即可利用滅瘟素抗性進(jìn)行篩選，獲得高拷貝的細(xì)胞株進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵。IS系統(tǒng)使用的質(zhì)粒很?。?.6K），易于操作，表達(dá)流程相對簡單，可以進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵，有些重組蛋白在IS中的表達(dá)量比BEVS還高，是一種比較實用的昆蟲表達(dá)系統(tǒng)。38醫(yī)藥材料表3：昆蟲表達(dá)載體pMIB/V5-His B質(zhì)粒圖譜39醫(yī)藥材料果蠅表達(dá)系統(tǒng)（果蠅表達(dá)系統(tǒng)（Drosophila Expression System，DES)：果蠅表達(dá)系統(tǒng)使用S2果蠅細(xì)胞為表達(dá)宿主，可以進(jìn)行重組蛋白的胞內(nèi)、分泌表達(dá)，可以連續(xù)表達(dá)。在培養(yǎng)瓶中，S2松散半貼壁單層生長，同時也可以很好的適應(yīng)搖瓶和發(fā)酵罐的懸浮培養(yǎng)，可以使用無血清培養(yǎng)基。外源基因在S2細(xì)胞系一般能夠達(dá)到500-1000個拷貝。DES有多種表達(dá)載體，包括組成型/誘導(dǎo)表達(dá)、胞內(nèi)/分泌表達(dá)，可以適應(yīng)不同的需要。誘導(dǎo)表達(dá)的載體使用果蠅金屬硫蛋白基因（MT）啟動子。MT啟動子是一個嚴(yán)緊調(diào)控的強(qiáng)啟動子，即使在很高的拷貝數(shù)下也可以維持低水平的本底表達(dá)。硫酸銅或氯化鎘可以解除抑制，表達(dá)MT啟動子的下游基因。MT啟動子在其他昆蟲細(xì)胞系（如Sf9，Sf21，High Five）中表現(xiàn)不佳，僅能在S2細(xì)胞系中使用。DES的表達(dá)載體均沒有果蠅細(xì)胞的篩選標(biāo)記，只能用于短期表達(dá)，要建立穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，必須將帶有外源基因的載體和篩選載體共轉(zhuǎn)染。常用的篩選載體有攜帶潮霉素抗性基因的pCoHygro和攜帶滅瘟素抗性基因的pCoBlast。將篩選載體和表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，即可根據(jù)宿主耐藥性選出高拷貝的細(xì)胞株。40醫(yī)藥材料圖4：果蠅細(xì)胞表達(dá)載體pMT/V5-His質(zhì)粒圖譜41醫(yī)藥材料表8：果蠅表達(dá)體統(tǒng)常用載體42醫(yī)藥材料3.2 昆蟲細(xì)胞表達(dá)優(yōu)化：昆蟲細(xì)胞表達(dá)優(yōu)化：檢查外源基因的一級序列：外源基因5端不能有回文結(jié)構(gòu)；密碼子構(gòu)成需要適應(yīng)宿主的密碼子偏好，特別是N端前幾個；高AT含量的序列會使轉(zhuǎn)錄提前中止；檢查重組蛋白序列，分泌表達(dá)時需要糖基化位點Asn-X-Ser/Thr，避免蛋白N端出現(xiàn)“PEST”脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸，N端PEST使重組蛋白容易降解。嘗試各種外源基因-載體-宿主組合：不同的載體-宿主體統(tǒng)適合表達(dá)的蛋白是不同的，重組蛋白表達(dá)量不高時應(yīng)多嘗試幾種組合。宿主細(xì)胞狀態(tài)：桿狀病毒應(yīng)在適合的時機(jī)感染宿主細(xì)胞，生長階段、細(xì)胞密度、病毒量、收獲時間都值得優(yōu)化，特別是使用無血清培養(yǎng)基時，細(xì)胞密度要相應(yīng)增加。誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)同樣如此。培養(yǎng)基：培養(yǎng)基成分對重組蛋白表達(dá)量和質(zhì)量都有影響，可以考慮增加或減少培養(yǎng)基中某種組分（如血清等），也可以考慮將幾種培養(yǎng)基按比例混合使用。轉(zhuǎn)速和溶氧量：嬌嫩的昆蟲細(xì)胞不一定能適應(yīng)高轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，這就使培養(yǎng)基中的溶氧量受到了限制，優(yōu)化轉(zhuǎn)速使細(xì)胞狀態(tài)達(dá)到最佳，發(fā)酵培養(yǎng)時還應(yīng)優(yōu)化培養(yǎng)基氧氣飽和度，以提高外源蛋白的表達(dá)量。共表達(dá)輔助因子：在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中，過表達(dá)抗凋亡基因，如人源bcl-2和桿狀病毒P35可以延長宿主壽命；P-vank-1基因則可以提高分泌表達(dá)量。43醫(yī)藥材料4.哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)與其它系統(tǒng)相比，哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢在于能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊，提供復(fù)雜的N-糖基化和準(zhǔn)確的O-糖基化等多種翻譯后加工功能，因而表達(dá)產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然的高等生物蛋白質(zhì)分子。44醫(yī)藥材料4.1 表達(dá)宿主：表達(dá)宿主：哺乳動物細(xì)胞表達(dá)外源蛋白最初是將抗體基因重新導(dǎo)人淋巴細(xì)胞中由病毒(如SV40)或lgG的啟動子增強(qiáng)子引導(dǎo)。產(chǎn)生的抗體具有相應(yīng)的結(jié)合能力和數(shù)應(yīng)功能，但表達(dá)量很低。常用的非淋巴細(xì)胞類有中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、小倉鼠腎(BHK)細(xì)胞、非洲綠猴腎（COS）細(xì)胞、人類腎細(xì)胞（293）、幼倉鼠腎細(xì)胞（BHK）等。不同宿主表達(dá)的重組蛋白其穩(wěn)定性和翻譯后修飾有所不同，需根據(jù)目的蛋白選擇最佳的宿主細(xì)胞。CHO細(xì)胞是目前較常用的哺乳動物宿主細(xì)胞，被美國FDA確認(rèn)為安全的基因工程受體細(xì)胞（GRAS），廣泛應(yīng)用于醫(yī)療用重組蛋白的生產(chǎn)。它遺傳背景清楚，生理代謝穩(wěn)定，與人的親緣關(guān)系接近，外源蛋白修飾準(zhǔn)確，基因轉(zhuǎn)移和載體表達(dá)系統(tǒng)完善，對剪切力的耐受性好，便于大規(guī)模培養(yǎng)，而且能在無血清和蛋白培養(yǎng)基中生長。缺點是產(chǎn)率較低，重組蛋白一般僅占細(xì)胞總蛋白的2.5%。CHO細(xì)胞有多種亞細(xì)胞株，如脯氨酸缺陷型CHO-K1、紫外線敏感型UV20、UV41，二氫葉酸還原酶雙倍體基因缺失型(DHFR-)CHO和轉(zhuǎn)入了胰島素生長因子IGF基因和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因、更加適應(yīng)無血清培養(yǎng)基的超級CHO等。45醫(yī)藥材料COS細(xì)胞是進(jìn)行外源基因瞬時表達(dá)時最常用的宿主，源于1-1細(xì)胞株，基因組內(nèi)含有腺病毒SV40的T抗原基因，允許SV40進(jìn)行裂解生長，允許SV40早期突變體的復(fù)制。COS細(xì)胞載體易于構(gòu)建，便于使用，而且對插入DNA的量或者采用基因組DNA 序列的情況都沒有什么限制，可以通過檢測表達(dá)情況來確證cDNA的陽性克隆，也利于快速分析引入克隆化cDNA序列中的突變。來源于MadIin-Darby犬腎的高分化內(nèi)皮細(xì)胞株(MDCK)，懸浮培養(yǎng)時重組蛋白產(chǎn)率可以達(dá)到細(xì)胞總蛋白量的20，在細(xì)胞單層貼壁培養(yǎng)情況下表達(dá)量也可達(dá)到10 mg/L。在多種腎細(xì)胞獲得成功后，人源腎臟細(xì)胞293細(xì)胞也經(jīng)過改造成為常用的表達(dá)宿主。293細(xì)胞株整合了人類腺病毒5DNA的片段，顯著強(qiáng)化了宿主的部分啟動子，使得重組蛋白可以達(dá)到較高的表達(dá)量。293細(xì)胞能在無血清培養(yǎng)基中生長，其變種有快速生長型293-F、整合了猴腺病毒大T抗原的293-FT、融合了腺病毒部分基因的AD293和HEK293、貼壁好適宜錨定篩選的293-H等。46醫(yī)藥材料4.2 表達(dá)載體表達(dá)載體與酵母和昆蟲細(xì)胞類似，哺乳動物細(xì)胞表達(dá)外源重組蛋白也可以利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和病毒載體的感染。病毒載體病毒載體哺乳動物可用的病毒載體很多，有猿猴空泡病毒（SV40）、腺病毒（Adenovirus）、腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus）、人牛痘病毒（Vaccinia virus）、桿狀病毒（Baculovirus）、冠狀病毒（Coronavirus）、埃-巴二氏病毒（Epstein-Barr virus）、單純皰疹病毒（Herpes simplex virus）、慢病毒（Lentiviruses）、脊髓灰質(zhì)炎病毒（Poliovirus）、逆轉(zhuǎn)錄病毒（Retroviruses）、塞姆利基森林病毒（Semliki Forest virus）等。不同的病毒載體能夠裂解增殖或復(fù)制的宿主各不相同，應(yīng)根據(jù)需要選擇。47醫(yī)藥材料腺病毒（Adenovirus）：腺病毒為線狀雙鏈DNA病毒，基因組長36kb，DNA兩端各有一個反向重復(fù)序列ITR。腺病毒宿主范圍廣，可感染一系列哺乳動物細(xì)胞，其中人源細(xì)胞是腺病毒的允許細(xì)胞，腺病毒可以完成復(fù)制增殖裂解宿主的周期，不會插入人源細(xì)胞基因組中，因而不會致癌；而對嚙齒動物，大部分腺病毒都可以致癌。腺病毒基因按轉(zhuǎn)錄時間的先后，可以分為早期（E1-E4）和晚期轉(zhuǎn)錄單位（L1-L5）。E1蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝并激活其他早期基因的啟動子，E2啟動病毒DNA復(fù)制，E3與病毒復(fù)制無關(guān)，主要幫助病毒的成熟，E4主要與病毒mRNA的代謝有關(guān)。pAdEasy-1載體以人腺病毒AD5基因組為藍(lán)本，敲除了E1和E3，擴(kuò)大載體容量的同時，使病毒不能在非允許細(xì)胞中復(fù)制。目的基因首先克隆在一個帶有ITR和篩選標(biāo)記的穿梭質(zhì)粒（如pShuttle-CMV）中，線性化后與pAdEasy共轉(zhuǎn)染大腸桿菌，以抗生素篩選帶有重組病毒的原核宿主，提取純化后在融合有腺病毒E1基因的293細(xì)胞株（如AD293）中增殖和表達(dá)。重組病毒中，表達(dá)盒插入在腺病毒E1區(qū)，使用E1強(qiáng)啟動子表達(dá)重組蛋白。使用人源細(xì)胞株作為表達(dá)宿主時，腺病毒載體最終會裂解宿主，因此不適于連續(xù)表達(dá)。48醫(yī)藥材料慢病毒（Lentivirus）：慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，由潛伏期較長而得名。慢病毒既可以轉(zhuǎn)染處于有絲分裂活躍期的細(xì)胞，又可以轉(zhuǎn)染分裂緩慢及處于分裂終末期的細(xì)胞，包括造血干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞，處于分化終末的神經(jīng)元，肝實質(zhì)細(xì)胞等。根據(jù)其來源不同，慢病毒可以分為以下幾類：HIV I型、HIV II型、猿類免疫缺陷病毒、貓免疫缺陷病毒。其中HIV I型是目前最常用的慢病毒載體。慢病毒感染宿主細(xì)胞后馬上形成前病毒，前病毒的主要基因編碼區(qū)為5LTR-gag-pro-pol-env-3LTR，其中LTR為長末端重復(fù)序列、為整合信號，gag基因編碼病毒的核心蛋白，pol基因編碼病毒復(fù)制所需的酶類，env基因編碼病毒的包膜糖蛋白，pro基因則編碼切割蛋白前體所需的蛋白酶。HIV-I載體系統(tǒng)由輔助和載體兩個質(zhì)粒組成。載體質(zhì)粒含有整合信號、啟動子、多克隆位點以及包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的序列；輔助質(zhì)粒則與載體互補(bǔ)，編碼了產(chǎn)生病毒顆粒所必須的蛋白。將兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到宿主中，由于輔助質(zhì)粒不含整合信號，新生成的病毒中就只有目的基因。將重組病毒感染普通表達(dá)宿主，即可進(jìn)行重組蛋白的穩(wěn)定表達(dá)；如感染整合了gag、pol、env基因的宿主，即可進(jìn)行瞬時表達(dá)。慢病毒表達(dá)系統(tǒng)的一個主要缺陷是：載體和輔助質(zhì)粒有時會在宿主中發(fā)生同源重組，產(chǎn)生野生型病毒。為了解決這個問題，目前使用的表達(dá)系統(tǒng)將輔助質(zhì)粒又分成了三個質(zhì)粒，分別帶有逆轉(zhuǎn)錄酶rev基因、gag和pol基因、以及env的替代基因VSV-G（囊口腔炎病毒外殼蛋白）。將載體系統(tǒng)分成4個部分增加了野生病毒生成所需的重組步驟，使得HIV載體系統(tǒng)更加穩(wěn)定；外殼蛋白的單獨構(gòu)建，使得人們可以通過更換病毒外殼蛋白質(zhì)粒來方便的更換宿主種類。49醫(yī)藥材料單質(zhì)粒表達(dá)載體單質(zhì)粒表達(dá)載體以pcDNA3.1為例，它是一個不依賴病毒的載體，組成元件有人巨細(xì)胞病毒早期啟動子pCMV、多克隆位點、用于真核篩選的遺傳霉素抗性基因、f1和SV40復(fù)制子、polyA轉(zhuǎn)錄終止信號，以及原核復(fù)制子和氨芐青霉素抗性基因。pcDNA3.1載體的使用與類似的昆蟲表達(dá)載體相同：將目的基因克隆入載體中，在原核宿主中擴(kuò)增純化，轉(zhuǎn)染真核表達(dá)宿主，使用G418篩選高表達(dá)細(xì)胞株。pcDNA3.1載體很?。?.4kb），易于操作，宿主溶源SV40病毒時可以獨立于染色體自主復(fù)制；但是其表達(dá)流程復(fù)雜，對質(zhì)粒載體純度和轉(zhuǎn)染效率要求很高，篩選工作費時費力，而且表達(dá)盒的插入位點和拷貝數(shù)不可控制，可能影響宿主生理性質(zhì)。使用Flp-In宿主細(xì)胞株可以克服這些缺點。50醫(yī)藥材料圖5：A：Flp-In CHO細(xì)胞系；B：pEF/FRT/V5-DEST質(zhì)粒圖譜51醫(yī)藥材料常用的哺乳動物細(xì)胞株，如CHO、293等都可以改造為Flp-In細(xì)胞株。序列SV40啟動子ATGFRTlacZ-Zeocin整合在基因組中活躍表達(dá)的區(qū)域（圖5 A），使用博來霉素篩選宿主基因型，帶有外源基因的表達(dá)盒插入FRT位點，保證了目的基因的正確整合。使用Flp-In細(xì)胞株必須配合表達(dá)pOG44質(zhì)粒和帶有FRT重組序列的表達(dá)載體，如pEF/FRT/V5-DEST（圖5 B）。pOG44帶有編碼了Flp重組酶的基因，將其與表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染，F(xiàn)lp重組酶幫助表達(dá)盒插入宿主染色體的FRT位點，即可獲得穩(wěn)定表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞株。除以上介紹的兩種載體外，還有多種單質(zhì)粒載體可供選擇（表9）。52醫(yī)藥材料表9：常用哺乳動物單質(zhì)粒表達(dá)載體，新霉素是遺傳霉素類似物，也可用G418篩選53醫(yī)藥材料四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)：四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)：四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)載體是基于大腸桿菌四環(huán)素操縱子而設(shè)計的。大腸桿菌中，四環(huán)素抗性蛋白（TetR）調(diào)控著Tn 10轉(zhuǎn)座子上的四環(huán)素抗性操縱子。TetR結(jié)合在tet操縱序列（tetO）上，抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)環(huán)境中存在四環(huán)素時，四環(huán)素結(jié)合在TetR上，使其構(gòu)象發(fā)生改變，從DNA上脫落而解除抑制。TetR和tetO為哺乳動物四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)提供了調(diào)控與誘導(dǎo)表達(dá)的基礎(chǔ)。哺乳四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)有兩種：Tet-On和Tet-Off（圖6）。Tet-On系統(tǒng)在培養(yǎng)基中添加Dox（四環(huán)素類似物）時誘導(dǎo)外源基因表達(dá)；Tet-Off則在培養(yǎng)基去除Tet或Dox時誘導(dǎo)外源基因表達(dá)。這兩種系統(tǒng)都由2個質(zhì)粒組成：帶有經(jīng)過改造的TetR的調(diào)控質(zhì)粒和tetO及目的基因的表達(dá)質(zhì)粒。在Tet-Off的調(diào)控質(zhì)粒中，TetR的N端1-207與單純皰疹病毒VP16的活性結(jié)構(gòu)域（TA）融合，形成一個新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白tTA。tTA的功能與TetR相反，是一個轉(zhuǎn)錄激活因子，結(jié)合四環(huán)素或Dox時不能結(jié)合DNA，表達(dá)被抑制，去除配體時蛋白結(jié)合在操縱序列上，誘導(dǎo)外源基因表達(dá)。在Tet-On的調(diào)控質(zhì)粒中，tTA經(jīng)過4個氨基酸殘基的突變，被改造成抑制轉(zhuǎn)錄的“反向”tTA（rtTA）。rtTA只應(yīng)答Dox，四環(huán)素不能啟動轉(zhuǎn)錄。結(jié)合有Dox的rtTA能夠同時結(jié)合操縱序列并啟動轉(zhuǎn)錄，反之則從DNA上脫落，抑制轉(zhuǎn)錄。除調(diào)控蛋白編碼基因外，兩個系統(tǒng)的調(diào)控質(zhì)粒上還帶有CMV啟動子、新霉素抗性基因、polyA終止子、氨芐青霉素抗性基因及原核復(fù)制子Col E1?？梢允褂肎418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。54醫(yī)藥材料Tet-On和Tet-Off系統(tǒng)共用一種表達(dá)質(zhì)粒。其中，tetO的連續(xù)7個拷貝和最小化的CMV啟動子組成了Tet應(yīng)答啟動子hCMV*-1，當(dāng)調(diào)控蛋白（tTA或rtTA）結(jié)合在啟動子上時，下游的外源基因得到轉(zhuǎn)錄。將調(diào)控質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，利用G418篩選，即可獲得誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞株。由于四環(huán)素和Dox的半衰期較短，使用Tet-On系統(tǒng)需要在誘導(dǎo)后定時添加Dox，Tet-Off則需要在誘導(dǎo)前定時補(bǔ)加。四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)有很多優(yōu)點：嚴(yán)緊調(diào)控，本底表達(dá)量低；使用轉(zhuǎn)錄激活蛋白而不是抑制蛋白，進(jìn)一步降低了本底表達(dá)，并減少了響應(yīng)時間；特異性強(qiáng)，操縱子來源于原核生物，與表達(dá)宿主的同源性很低，調(diào)控蛋白只結(jié)合表達(dá)質(zhì)粒上的操縱序列；表達(dá)量與誘導(dǎo)劑濃度正相關(guān)，可以較精確的控制。除基本的Tet-On/Off系統(tǒng)外，還有嚴(yán)緊調(diào)控的pTRE-Tight載體、帶有報告基因的pTRE-Tight-DsRed2載體、經(jīng)過進(jìn)一步改造更加適應(yīng)哺乳動物宿主的Tet-On/Off 3G載體等，使用時可以根據(jù)需要選擇。5