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1、中國(guó)藥典薄層色譜的基本要求 周蘭貴州省食品藥品檢驗(yàn)所中藥（民族藥）室 2014年5月 內(nèi)容薄層色譜技術(shù)在中藥標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)勢(shì)中國(guó)藥典薄層色譜的基本要求薄層色譜應(yīng)用的影響因素 薄層色譜技術(shù)在中藥標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)勢(shì)薄層色譜法（中國(guó)藥典2010年版一部附錄 B），系將供試品溶液點(diǎn)于薄層板上，在展開容器內(nèi)用展開劑展開，使供試品所含成分分離，將所得色譜圖與對(duì)照物按同法所得的色譜圖比較，并可用薄層掃描儀進(jìn)行掃描，用于鑒別、檢查或含量測(cè)定的方法。 薄層色譜技術(shù)在中藥標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)勢(shì)薄層色譜獨(dú)有的特點(diǎn)是分析結(jié)果以直觀的彩色圖像表達(dá)，為其它色譜技術(shù)所不能。而圖像給出的多層面的信息是文字難以表達(dá)的，而且豐富多彩的圖像可以給分析者更多
2、的思考判斷的空間。 提供直觀的彩色圖像是薄層色譜獨(dú)有的特點(diǎn) 離線操作的靈活性各單元操作既有關(guān)聯(lián)，又相互獨(dú)立，點(diǎn)樣器材和方法、展開方式、顯色試劑選擇、直觀比較或掃描比較可根據(jù)需要靈活變通。根據(jù)需要操作可以視實(shí)際需要和實(shí)驗(yàn)室條件分層次進(jìn)行和終止，節(jié)省分析時(shí)間和資源。 由于是離線操作，所以個(gè)人占機(jī)時(shí)間短。 正相色譜流動(dòng)相（展開劑）的廣泛適用性薄層色譜最常用的是以硅膠板為基礎(chǔ)固定相的正相色譜，有多種組合的有機(jī)溶劑展開系統(tǒng)可供選擇；甲苯系統(tǒng)；三氯甲烷系統(tǒng)；己烷系統(tǒng)；正丁醇系統(tǒng)；乙酸乙酯系統(tǒng)等等。 酸性、堿性、中性。高極性、中等極性、低極性。 色譜后衍生的專屬性色譜后靈活方便的衍生技術(shù)，同一色譜薄層板可生
3、成可見光譜、紫外光譜、熒光淬滅光譜或熒光光譜，給出豐富的檢測(cè)成分的化學(xué)類別信息。如三氯化鋁試劑是黃酮類化合物的專屬試劑；碘化鉍鉀是生物堿類成分的專屬試劑；三氯化鐵是酚類成分的專屬試劑；醋酐硫酸是三萜類和甾醇類成分的專屬試劑等。硫酸則是許多成分激發(fā)產(chǎn)生熒光的通用試劑，非常方便。 同板多個(gè)樣品平行比較成本相對(duì)低廉、色譜生成快速、同板可以同時(shí)產(chǎn)生多達(dá)1618個(gè)樣品色譜，共平行直觀地比較，色彩豐富的圖像給人的視覺沖擊遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于較為“呆板”的輪廓色譜圖，可以迅速地、粗略地，而且頗為有效地評(píng)價(jià)樣品色譜圖像之間的相試程度。 中 國(guó) 藥 典 薄 層 色 譜 的 基 本 要 求供 起 草 標(biāo) 準(zhǔn) 用 樣 品 的
4、要 求中 成 藥 薄 層 色 譜 鑒 別中 藥 材 薄 層 色 譜 鑒 別 中藥標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求原 則 保 證 用 藥 安 全科 學(xué) 、 先 進(jìn) 、 規(guī) 范 、 適 用促 進(jìn) 標(biāo) 準(zhǔn) 國(guó) 際 化 中藥標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求中 藥 標(biāo) 準(zhǔn) 制 定 國(guó) 家 藥 品 標(biāo) 準(zhǔn) 工 作 手 冊(cè) 中 藥 質(zhì) 量 標(biāo) 準(zhǔn) 研 究 制 定 技 術(shù) 要 求方 法 學(xué) 驗(yàn) 證 中 藥 質(zhì) 量 標(biāo) 準(zhǔn) 方 法 學(xué) 驗(yàn) 證 指 導(dǎo) 原 則（ 中 國(guó) 藥 典 2010版 一 部 ） 供起草用樣品的要求研 究 用 樣 品 應(yīng) 具 有 代 表 性 ， 覆 蓋 面 要 廣 ，一 般 至 少 收 集 15批 以 上 樣 品 供 研
5、究 用 ；對(duì) 于 多 來 源 品 種 ， 每 種 收 集 35種 ； 相 關(guān) 信 息 包 括 ： 產(chǎn) 地（ 如 有 可 能 表 明 野 生 或 家 種 ） 、 收 集 地 、 收 集 時(shí) 間 、 收 集 人獨(dú) 家 生 產(chǎn) 的 應(yīng) 不 少 于 10批 ， 多 家 企 業(yè) 生 產(chǎn) 的 應(yīng) 盡 量 收 集每 家 企 業(yè) 的 樣 品 ， 5家 以 上 企 業(yè) 生 產(chǎn) 的 應(yīng) 至 少 收 集 510家企 業(yè) 生 產(chǎn) 的 樣 品 樣 品 量 除 滿 足 起 草 研 究 、 留 樣 觀 察 外 ， 還 應(yīng) 有 不 少于 3倍 檢 驗(yàn) 量 的 樣 品 供 復(fù) 核 用 供起草用樣品的要求注 意 中 藥 材 、
6、飲 片 要 求 專 家 鑒 定對(duì) 于 具 有 多 種 不 同 規(guī) 格 的 中 成 藥 ， 應(yīng) 收 齊 全 部 規(guī) 格 的 樣 品 試 驗(yàn) 用 樣 品 必 須 采 用 合 格 原 輔 料 依 法 生 產(chǎn) 的 樣 品 ， 收 集 的 每 批樣 品 均 要 有 該 企 業(yè) 的 原 輔 料 和 成 品 的 自 檢 報(bào) 告 及 詳 細(xì) 生 產(chǎn) 工 藝 供起草用樣品的要求陰 性 對(duì) 照 樣 品 生 產(chǎn) 單 位 應(yīng) 盡 可 能 提 供研 究 單 位 自 制陰 性 樣 品 系 指 按 處 方 除 去 被 測(cè) 定 的 藥 味 ， 按 制 法 制 備 的樣 品 ， 注 意 應(yīng) 包 括 所 有 的 輔 料 和 工
7、藝 步 驟 ， 制 成 量 應(yīng) 與原 標(biāo) 準(zhǔn) 相 符 鑒別鑒 別 顯 微 鑒 別理 化 鑒 別色 譜 鑒 別 特 征 圖 譜 鑒 別 一 般 理 化 鑒 別熒 光 鑒 別光 譜 鑒 別薄 層 色 譜 鑒 別液 相 色 譜 鑒 別氣 相 色 譜 鑒 別 中藥材薄層色譜鑒別盡 量 采 用 對(duì) 照 品 和 對(duì) 照 提 取 物 或 對(duì) 照 藥 材 同 時(shí) 進(jìn) 行 對(duì) 照?qǐng)D 譜 清 晰 、 斑 點(diǎn) 明 顯 、 分 離 度 與 重 現(xiàn) 性 符 合 要 求根 據(jù) 被 測(cè) 物 的 特 性 選 擇 合 適 的 固 定 相 、 展 開 劑 及 顯色 方 法 等 色 譜 條 件色 譜 條 件 的 優(yōu) 化 應(yīng) 對(duì) 三
8、 個(gè) 以 上 的 展 開 系 統(tǒng) 進(jìn) 行 考 察 確 定 供 試 品 取 樣 量 、 提 取 和 純 化 方 法 、 點(diǎn) 樣 量 等 條 件選 擇 合 適 的 對(duì) 照 物 質(zhì) ， 確 定 對(duì) 照 物 質(zhì) 用 量 、濃 度 、 溶 劑 、 點(diǎn) 樣 量 等 中藥材薄層色譜鑒別驗(yàn) 證 專 屬 性重 復(fù) 性耐 用 性 重 現(xiàn) 性 多 來 源 藥 材 、 飲 片 的 色 譜 行 為 是否 一 致混 淆 品 的 區(qū) 別斑 點(diǎn) 是 否 重 疊不 同 品 牌 的 薄 層 板 或 自 制 薄 層 板 考 察考 察 至 少 23個(gè) 品 牌 或 廠 家 的 薄 層 板 ，不 同 溫 度 、 濕 度 考 察 ， 在
9、5 35考 察 高 低 2個(gè) 溫 度 ； 在 低 相 對(duì) 濕 度（ RH） 1530%和 高 相 對(duì) 濕 度 7590%各 考 察 一 個(gè) 相 對(duì) 濕 度 中 成 藥 薄 層 色 譜 鑒 別（ 1） 薄 層 色 譜 具 有 分 離 與 鑒 別 的 特 性 ， 并 具 有 直 觀 、 承 載 信息 大 、 專 屬 性 強(qiáng) 、 快 速 、 經(jīng) 濟(jì) 、 操 作 簡(jiǎn) 便 等 優(yōu) 點(diǎn) ， 是 中 成藥 鑒 別 的 首 選 方 法 。（ 2） 新 建 立 的 薄 層 色 譜 應(yīng) 該 圖 譜 清 晰 ， 斑 點(diǎn) 明 顯 ， 分 離度 、 專 屬 性 、 重 現(xiàn) 性 與 耐 用 性 符 合 要 求 ， 并 需
10、 要 提 供 圖 譜 ；（ 3） 應(yīng) 盡 量 與 該 藥 材 和 飲 片 的 薄 層 色 譜 鑒 別 方 法 一 致 ， 如 因 其 他 成 分干 擾 或 制 劑 的 提 取 方 法 不 同 ， 可 增 加 提 取 純 化 處 理 或 展 開 劑 優(yōu) 化 。 新增薄層色譜鑒別要求供 試 品 溶 液 的 制 備 ： 應(yīng) 盡 可 能 除 去 干 擾 ， 同 時(shí) 方 法 盡 量 簡(jiǎn) 便 ，首 先 進(jìn) 行 提 取 、 純 化 選 擇 ， 如 回 流 、 超 聲 提 取 方 法 ， 溶 劑 、 時(shí) 間 ，酸 堿 處 理 ， 溶 劑 萃 取 ， 柱 子 純 化 等 的 選 擇對(duì) 照 品 選 擇 ： 盡 量
11、 采 用 以 對(duì) 照 品 和 對(duì) 照 提 取 物 或 對(duì) 照 藥 材 同 時(shí) 進(jìn) 行對(duì) 照 。 當(dāng) 對(duì) 照 品 不 易 獲 得 時(shí) ， 可 采 用 對(duì) 照 提 取 物 或 對(duì) 照 藥 材 為 對(duì) 照薄 層 板 的 選 擇 ： 吸 附 劑 的 比 較 ， 選 硅 膠 G板 還 是 GF254板 新 增 薄 層 色 譜 鑒 別 要 求點(diǎn) 樣 量 選 擇 ： 不 同 點(diǎn) 樣 量 的 比 較展 開 劑 選 擇 ： 對(duì) 三 個(gè) 以 上 的 展 開 系 統(tǒng) 進(jìn) 行 考 察 比 較顯 色 條 件 選 擇 ： 日 光 、 紫 外 光 、 顯 色 劑陰 性 空 白 試 驗(yàn) ： 以 證 明 其 他 藥 味 無 干
12、 擾耐 用 性 ： 不 同 廠 牌 的 薄 層 板 、 溫 度 、 相 對(duì) 濕 度 等 注 意（ 1） 使 用 對(duì) 照 藥 材 應(yīng) 保 證 藥 材 的 主 斑 點(diǎn) 在 樣 品 中 均 有 對(duì) 應(yīng) 斑 點(diǎn) （ 可 參照 制 法 對(duì) 藥 材 進(jìn) 行 前 處 理 ） ， 供 試 品 色 譜 中 不 能 只 有 對(duì) 照 藥 材 色 譜 中 的12個(gè) 次 要 斑 點(diǎn) 相 對(duì) 應(yīng)（ 2） 盡 可 能 采 取 一 個(gè) 供 試 液 多 項(xiàng) 多 維 鑒 別 使 用 的 薄 層 色 譜 方 法 ， 達(dá) 到節(jié) 約 資 源 、 保 護(hù) 環(huán) 境 、 簡(jiǎn) 便 實(shí) 用 的 目 的（ 3） 注 意 ” 過 柱 “ 的 影 響
13、 ， 不 同 品 牌 、 不 同 批 號(hào) 的 吸 附 劑 吸 附 能 力 有 的 不 同（ 4） 對(duì) 原 方 法 的 驗(yàn) 證 注 意 原 標(biāo) 準(zhǔn) 點(diǎn) 樣 量 按 手 鋪 板 制 定 ， 現(xiàn) 用 市 售 薄 層 板 點(diǎn) 樣 量 過 大 分 離 度 差 ， 點(diǎn) 樣 量 可 減 少 薄層色譜應(yīng)用的影響因素樣品預(yù)處理薄層色譜的點(diǎn)樣技術(shù)吸附劑活性溶劑蒸汽在薄層色譜中的應(yīng)用溫濕度對(duì)薄層色譜的影響 薄層色譜的優(yōu)化及溶劑系統(tǒng)（展開劑）的選擇薄層板 樣品預(yù)處理要得到一個(gè)較為清晰的色譜，樣品提取物經(jīng)預(yù)處理，使供試品溶液得以凈化，往往是一個(gè)重要的有時(shí)甚至是關(guān)鍵的步驟提取溶劑的要求：溶解度不宜太大，黏度不宜太高，沸點(diǎn)
14、適中 供試品溶液凈化的方法（ 1） 單 一 溶 劑 提 取 法 根 據(jù) 被 測(cè) 物 質(zhì) 的 化 學(xué) 特 性 ， 有 選 擇 性 地 采 用 某 種 溶 劑 直接 提 取 制 備 。 （ 如 浙 貝 母 、 平 貝 母 、 華 山 參 、 洋 金 花 等 ）（ 2） 分 段 提 取 法 ； 被 檢 測(cè) 樣 品 不 同 極 性 部 位 分 別 提 取 后 制 成 相 應(yīng) 供 試 液 ，分 別 檢 測(cè) 分 析 （ 如 丹 參 ）（ 3） 特 殊 提 取 方 式 如 蜜 丸 等 含 糖 較 高 又 有 黏 性 的 樣 品 ， 有 機(jī) 溶 劑 較 難 滲 透到 樣 品 的 內(nèi) 部 ， 可 加 硅 藻 土
15、 、 滑 石 粉 等 分 散 劑 共 同 研 勻 后再 提 取 。 供試品溶液凈化的方法（ 4） 液 -液 萃 取 法 利 用 樣 品 與 雜 質(zhì) 在 兩 相 （ 水 相 和 有 機(jī) 相 ） 中 溶 解 度 的 不同 ， 達(dá) 到 凈 化 目 的 。 特 別 適 合 合 劑 、 口 服 液 、 糖 漿 劑 、 注 射 劑 等 的 處 理 。（ 5） 固 -液 萃 取 法 固 相 小 柱 萃 取 基 本 上 是 基 于 吸 附 、 鍵 合 相 分 配 、 正 相 、 反相 、 離 子 對(duì) 、 離 子 交 換 原 理 富 集 待 測(cè) 成 分 ， 去 除 部 分 雜 質(zhì)。 點(diǎn)樣 點(diǎn) 狀 或 條 帶 狀
16、 點(diǎn) 樣 ？ 點(diǎn) 狀 點(diǎn) 樣 ： 簡(jiǎn) 單 快 速 缺 點(diǎn) ： 接 觸 式 點(diǎn) 樣 ， 易 損 傷 薄 層 板 表 面 點(diǎn) 樣 量 小 斑 點(diǎn) 容 易 點(diǎn) 大 ， 易 產(chǎn) 生 容 積 環(huán) 形 色 譜 效 應(yīng) ， 影 響 分 離 效 果 條 帶 狀 點(diǎn) 樣 優(yōu) 點(diǎn) ： 一 般 噴 霧 式 ， 不 損 傷 薄 層 板 表 面 點(diǎn) 樣 量 比 點(diǎn) 狀 點(diǎn) 樣 大 原 點(diǎn) 不 會(huì) 上 下 擴(kuò) 散 ， 分 離 度 增 加 點(diǎn)樣點(diǎn)多少？ 常規(guī)的TLC：0.5-5 l， 高效TLC：HPTLC： 1 l；用什么點(diǎn)？ 常規(guī)：手工一般使用定量毛細(xì)管（0.5/1/2和5 l），點(diǎn)樣是毛細(xì)管必須完全充滿和完全排空，要
17、以垂直方向小心接觸TLC/ HPTLC板面，（玻璃毛細(xì)管不易損傷預(yù)制板的板面），切忌斑點(diǎn)或條帶在原點(diǎn)因溶劑過大造成原點(diǎn)的擴(kuò)散，一般建議控制在5 l以下。 裝置：手工點(diǎn)樣器 半自動(dòng)點(diǎn)樣器 全自動(dòng)點(diǎn)樣器 展開-展開溶劑使用的溶劑必須是“分析純”或“色譜純”有毒試劑如“苯”禁用，“三氯甲烷”慎用（三氯甲烷目前仍有使用，否則許多鑒別無法進(jìn)行，有的例子是難以取代的）；溶劑組成采用體積比（如乙酸乙酯-甲醇-甲酸=8:2:0.1，或?qū)懽?0:20:1 V/V/V)。甲酸一般雖然用量很微，但應(yīng)準(zhǔn)確加入。 溶劑總量應(yīng)足以使薄層板的浸入深度約為5mm（展開劑量的多少會(huì)影響斑點(diǎn)的Rf值）展開劑要求新鮮配制，一般不用
18、多次反復(fù)使用，如展開溶劑混合放置后有分層現(xiàn)象，則按要求放置分層后取需要的一相（上層或下層），備用。 展開-飽和與預(yù)平衡溶劑的蒸氣相在展開缸中也參與色譜展開而形成三維的層析過程，即固相-板上的吸附劑、液相-展開劑、氣相-溶劑蒸氣三相相互作用；如處理不好，會(huì)產(chǎn)生如下現(xiàn)象： 展開過程中展開劑的組分被固定相分離產(chǎn)生第二前沿。 未平衡或平衡時(shí)間不夠易產(chǎn)生邊緣效應(yīng)。 該怎樣飽和呢？展開缸預(yù)平衡或飽和：展開前將展開劑置展開缸中，其蒸氣在展開缸中平衡一段時(shí)間（15-20min）后迅速放入薄層板展開；預(yù)吸附：將薄層板放在展開缸中，不與展開劑接觸，吸附一定量的溶劑蒸氣可以改變層析行為，得到不同的色譜； 飽和方式方
19、法A（展開缸、薄層板均不飽和）方法B（展開缸飽和、薄層板不飽和）方法C（展開缸、薄層板均飽和） 展開-展開劑優(yōu)化展開劑在色譜展開中起著關(guān)鍵作用，至今植物藥分析的薄層展開劑的優(yōu)化基本上還是依靠經(jīng)驗(yàn)。主要是因?yàn)橹参锼幒刑嗟奈粗煞?，色譜行為各不相同，所以試錯(cuò)法仍然是中藥分析實(shí)驗(yàn)室在選擇展開劑時(shí)最常用的方法（包括借鑒他人的經(jīng)驗(yàn)） 展開劑的優(yōu)化主要考慮兩方面：溶劑的極性和溶劑的選擇性。 前者要求使待分離的主要物質(zhì)的Rf值在0.30.7之間；當(dāng)Rf值符合要求后，進(jìn)行等強(qiáng)度溶劑替換，直到分離度達(dá)到要求為止。對(duì)于硅膠等吸附薄層和正相分配色譜來說，展開劑的極性越大，溶劑強(qiáng)度就越大，洗脫能力就越強(qiáng)，即同一物
20、質(zhì)在薄層板上的Rf值越大。 根據(jù)文獻(xiàn)和樣品所含化合物類型選擇，并記錄色譜純?nèi)軇┰鰷p溶劑強(qiáng)度混合，改性試劑，添加酸堿、水等獲得最佳配比 常用溶劑的極性順序水（最大） 甲酰胺乙腈甲醇乙醇 丙醇丙酮二氧六環(huán)四氫呋喃甲乙酮正丁醇乙酸乙酯乙醚異丙醚二氯甲烷三氯甲烷溴乙烷笨四氯化碳二硫化碳環(huán)己烷己烷煤油（最小） 展開-展開距離是不是展距越大越好呢？ TLC:12-15cm HPTLC:5-7cm建議對(duì)展距進(jìn)行考察，選擇最佳展距，并做好記錄 溫度對(duì)薄層色譜的影響一般而言，溫度越低，Rf值越低；展開溫度對(duì)薄層色譜的影響不大，一般相差5時(shí)，Rf值的變動(dòng)一般不會(huì)超過0.02；因此，展開溫度一般控制在1525 之間
21、即可（一般空調(diào)實(shí)驗(yàn)室均能解決）； 記錄試驗(yàn)時(shí)的實(shí)際溫度。 相對(duì)濕度對(duì)薄層色譜的影響一般而言，濕度越低， Rf值越低；相對(duì)濕度是影響薄層色譜重現(xiàn)性差的主要原因之一；不同樣品或成分和所選用的展開劑對(duì)相對(duì)濕度的適應(yīng)能力不同； 因此，建議展開的濕度一般控制在50%記錄試驗(yàn)時(shí)實(shí)際的相對(duì)濕度 相對(duì)濕度的控制方法相對(duì)濕度（%）所需硫酸濃度（V/V）硫酸（ml）水（ml）1 8 1 0 0 9 5 .53 2 6 8 1 0 04 2 5 7 1 0 04 7 5 0 1 0 05 8 3 9 .5 1 0 06 5 3 4 1 0 07 2 2 7 .5 1 0 08 8 1 0 .8 1 0 0 顯色對(duì)同
22、一薄層板在UV254、365nm、可見光（衍生前和/或后）下觀察 給出豐富的化學(xué)結(jié)構(gòu)類型信息； TLC板上常含有UV指示劑（F-254），在UV254nm激發(fā)下產(chǎn)生有色熒光。對(duì)UV254nm有吸收的物質(zhì)存在于斑點(diǎn)上時(shí)發(fā)射的熒光會(huì)減弱（熒光淬滅）； 噴霧 優(yōu)點(diǎn)：快速、方便、試劑消耗少； 缺點(diǎn)：會(huì)產(chǎn)生有毒霧氣，重現(xiàn)性是個(gè)問題。浸漬 優(yōu)點(diǎn)：顯色均勻 缺點(diǎn)：試劑消耗量大，產(chǎn)生溶劑線，背景染色深； 顯色劑考察對(duì)顯色劑考察原則： 用對(duì)照品對(duì)照的樣品，通常選用針對(duì)對(duì)照品的專屬性顯色劑，如生物堿類藥材，選用改良碘化鉍鉀試液； 用對(duì)照藥材對(duì)照的樣品，通常選用顯色劑如10%硫酸乙醇溶液顯色；或選用針對(duì)該樣品活性成分或?qū)傩猿煞值膶傩燥@色劑。加熱顯色者須注意加熱的時(shí)間和溫度（做好時(shí)間和溫度的記錄） 有的成分加試劑后，如揮發(fā)油成分經(jīng)香草醛硫酸顯色，加熱溫度和時(shí)間長(zhǎng)短不同或放置時(shí)間不同均可能使斑點(diǎn)的顯色有所改變。 檢視分析結(jié)果采用相機(jī)或薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)（CAMAG）記錄
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