用免疫親和層析柱作為預處理通過LC-MSMS法檢測農水產品中氯霉素的殘留分析研究 生物技術專業(yè)
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1、 目錄 摘要 3 Abstract 4 第一章 緒論 6 1.1 引言 6 1.2 新型樣品前處理技術的評價及發(fā)展 6 1.2.1 樣品前處理方法的評價 6 1.2.2 樣品預處理方式及適用條件 6 1.2.3 常用預處理方法:固相萃取技術 7 1.2.4 樣品預處理技術的發(fā)展 8 1.3 免疫分析 8 1.3.1 抗原 9 1.3.2 抗體 10 1.3.3 抗原抗體反應 10 1.4 免疫親和層析柱(IAC) 11 1.4.1 簡述及現(xiàn)狀 11 1.4.2 IAC 的原理 11 1.4.3 IAC的優(yōu)勢 12 第二章 氯
2、霉素單組分免疫親和色譜法的建立 13 2.1 氯霉素檢測方法的現(xiàn)狀 13 2.2 氯霉素 13 2.2.1 氯霉素分類 13 2.2.2氯霉素檢測方法 14 2.3 本課題的研究意義及目的 14 2.4 實驗材料 15 2.4.1 實驗試劑 15 2.4.2 溶液配制 15 2.4.3 實驗儀器和設備 16 2.5 實驗部分 17 2.5.1操作條件 17 2.5.2 抗體的獲取與純化 18 2.5.3 抗體蛋白含量的測定 19 2.5.4抗體純度測定 20 2.5.5 氯霉素免疫親和柱的制備 20 2.5.6 氯霉素免疫親和柱的表征 21 2.7
3、 結果與討論 23 2.7.1 氯霉素抗體濃度的測定 23 2.7.2 氯霉素抗體純度的測定 24 2.7.3 IAC交聯(lián)程度測定 24 2.7.4 氯霉素免疫親和柱特性表征 25 2.7.5 對比SPE柱凈化結果討論 26 總結 27 參考文獻 28 致謝 30 摘要 食品安全引人重視,國計民生時刻關注。食品安全無疑是小民生里滲透著的大科學。如何使民眾的身體健康與生命安全的得到有效保障?嚴峻的形勢亟待我們建立一種有效的針對食品中存在的有毒有害物質進行提取,
4、純化并與檢測儀器結合使用的高效分析檢測方法。這種預處理方法還應該具備簡單、便捷、高效和可靠的特點。氯霉素作為一種對人體健康有害的,常被濫用于農水產品的抗生素,有必要施行對它的便捷的預處理,以便后續(xù)檢測。本實驗旨在建立一種單組分的氯霉素的免疫親和色譜法,用于萃取分離富集蝦肉樣品的氯霉素殘留。將樣品用免疫親和層析柱預處理,再用高效液相色譜-質譜聯(lián)用檢測,在準確可靠的前提條件下,使得樣品預處理的操作簡單高效化,從而縮短分析時間,達到了簡單便捷,高效可靠的目標。 本研究采用的免疫親和柱,是把Protein G 樹脂膠純化的氯霉素的單克隆抗體,和溴化氰活化Sepharose 4B瓊脂糖凝珠共價結合交聯(lián)
5、,再將此種復合物分裝進EP管中制備而成的多個微型小“柱”。經過實驗的驗證,實際樣品蝦肉能夠用采用這種方法制備的免疫親和色譜柱分析:它能將氯霉素從蝦肉樣品中提取分離,每50μL柱膠的最大柱容量為200ng每50μL柱膠。在探究上樣、淋洗和洗脫的條件后,建立梯度濃度氯霉素標液的S型曲線測定,找到了線性關系、檢測限,線性范圍內標液的回收率為78.9%-129.9%。之后的實際樣品的加標測定結果為:蝦肉和奶粉加標量分別為 2ng g?1時,回收率在80%左右,奶粉達到了90%。為保證實驗嚴謹,還進行了空白樣品過柱實驗作為陰性對照,并用HPLC-MS/MS進行測定無信號證明蝦肉基質本身呈陰性。 關
6、鍵詞:樣品預處理 免疫親和層析柱 蝦肉檢測 氯霉素 高效液相色譜-質譜聯(lián)用 食品安全 Abstract Food safety and people's livelihood attracts attention a lot. Food safety is undoubtedly a kind of great science that permeates the small people's livelihood. How to ensure people's food security, health and life quality? This is
7、 a grim situation that calls for us to establish an effective detection method for harmful toxic substances contained in food. This method should be simple, convenient, efficient and reliable as well. Chloramphenicol as a kind of antibiotic that harmful to human health, is often abused in agricultur
8、al water products ,so it’s naturally to carry out a kind of convenient detection of it. The aim of this experiment was to establish a single component of chloramphenicol immunoaffinity chromatography for the extraction of chloramphenicol residues in the samples. The sample pretreatment with immune a
9、ffinity chromatography column, then detect with HPLC-MS/MS detection, at the same time ensuring the premise that accurate and reliable, make sample pretreatment operation simple and efficient, so as to shorten the analysis time, to achieve a simple and convenient, reliable and efficient target. The
10、 immune affinity column used in this research adopts chloramphenicol monoclonal antibody that has been purified and dialysis with the Protein G resin, covalently combine with CNBr activated Sepharose 4B gel beads, then repackage this compound into EP tube into multiple tiny little "column". As the e
11、xperimental verification shows, the actual samples of the preparation of shrimp can use this immune affinity chromatography column way to analysis: it can do extraction and separation of chloramphenicol from the shrimp samples, every 50μL column glue has the maximum column capacity of 200ng. On inqu
12、iry, leaching and elution conditions, establish the gradient concentration determination of chloramphenicol to draw a standard curve that give us the linearity, detection limit and the recovery rate of the fluid inside the limits of 78.9%-129.9%.The result of the addition of the actual sample was: 2
13、ng g-1,recovery of shrimp on average is 80% and for milk it’s 90%.In order to conduct an accurate enough experiment, the blank sample was carried out as the negative control, with detection using HPLC-MS/MS.The outcome shows relative standard deviation of the real sample is blank. Keywords: speci
14、men pretreatment, immune affinity chromatography column ,shrimp flesh detection, chloramphenicol, HPLC-MS/MS, food safety. 第一章 緒論 1.1 引言 對樣品進行分析測試的整個流程大致為:目標樣品的收集,樣品的分解,樣品凈化,樣品進樣前的處理和樣品上機測定一共五個流程,并且除了樣品的測定外,剩余步驟粗泛而言都屬于樣品預處理。對于從事分析化學的科研人員來說,我們主要關注樣品分解和凈化兩
15、個環(huán)節(jié),這是狹義分析預處理環(huán)節(jié)[1]。我們的目的就是將待檢測的樣品處理成滿足儀器分析要求的性態(tài),而且在絕大多數(shù)情況下要處理成溶液的樣品狀態(tài)。樣品預處理是檢測與分析工作中的關鍵環(huán)節(jié)。從時長來講,分析過程約60%以上的時間都在樣品預處理這一步耗費;從實驗本身來講,樣品預處理環(huán)節(jié)是的分析誤差的主要來源。因此,樣品的前處理技術是否科學簡便,決定著著分析化學技術發(fā)展的順暢與否。 1.2 新型樣品前處理技術的評價及發(fā)展 1.2.1 樣品前處理方法的評價 樣品預處理,概括來說是獲得樣品后將其中的目標組分提取、凈化、濃縮、復溶到需要狀態(tài)的全過程。首要目標是維護儀器安全,避免基質對實驗結果造成干擾,
16、提高所用檢測方法的選擇性、準確度、靈敏度,降低檢測限[2]。因此,這些標準也就自然而然的成為對樣品前處理方法評價的標準。首先,方法的選擇要有針對性,依據(jù)樣品中殘留物質的不同特點而靈活參考。 因此,怎樣因材施法,將最適合的方法應用于所分析樣品是關鍵問題。所以我們應該考慮多種因素作為評價預處理方法的標準:是否濃縮了樣本,使得方法的靈敏度對應提高、回收率高低、基質干擾,人力物力的耗費、所要求檢測條件苛刻與否、是否可以重復實驗結果等[3]。所有因素要綜合考慮,不能把優(yōu)勢以偏概全,也不能看到缺點就因噎廢食。 1.2.2 樣品預處理方式及適用條件 數(shù)量眾多的樣品預處理方式各有其原理與適用范圍[4]
17、,如表1.1所示。 表1.1樣品預處理方式的原理及應用范圍 1.2.3 常用預處理方法:固相萃取技術 我們常用SPE代表固相萃取技術,它是現(xiàn)今許多實驗室和單位常用的樣品處理方法。常常用于純化生物產品,用于臨床醫(yī)學,生物化學,法醫(yī)學和藥物研究等領域的進一步分析[5]。SPE的普及部分歸因于它實現(xiàn)較高的選擇性和回收率,易于使用以及對危險萃取溶劑的消耗較少等實用性[6]。它作為一種凈化技術常與液相色譜聯(lián)用,目前這種應用非常普遍[7]。比如環(huán)境樣品分析、食品樣品分析以及藥物檢測,生物樣品分析等[8]。 目前商業(yè)上應用比較廣泛的預處理耗材就是SPE柱,柱床是一個長約十厘米的塑料小柱,填
18、料根據(jù)目標物特性各有不同。使用時先活化洗滌,再將樣品溶液稀釋一定比例后從柱上口加入,樣品溶液通過SPE柱下端流入貯液器中。樣品溶液過柱后洗滌吹干,可在柱下端出口處減壓抽氣,或于柱上口加壓。最后用適當溶液洗脫,洗脫液用離心管或試管收集即完成凈化[9]。 1.2.4 樣品預處理技術的發(fā)展 隨著科學技術的進步和科研工作者的開發(fā)研究,樣品前處理技術有了新的發(fā)展。[10]但尋求利大于弊,適用性更佳的樣品預處理新方法研工作者孜孜以求的目標,是目前分析化學這門學科面臨的一個亟待解決的問題。在傳統(tǒng)預處理仍被應用的同時,科學家根據(jù)凈化原理進一步改進,對待測樣本“量體裁衣”,結合新的微波、超臨界流體等技術,
19、創(chuàng)造拓展了新的樣品預處理領域。 超臨界流體萃取法、固相微萃取法、液膜萃取法、微波輔助萃取法等,都是最近幾年興起并發(fā)展迅速的預處理方法,這些方法被越來越多人推崇的很大原因歸結于它們減少或避免了有害溶劑的使用。未來,樣品前處理將更多地向綠色化學(無溶劑)、樣品微量化、裝置小型化發(fā)展。較為突出的,如固相微萃取(SPME)技術已日益成熟并成為多個領域應用中的標準方法,應用越來越廣泛。液相微萃取(LPME)克服了傳統(tǒng)液-液萃取技術繁瑣、浪費、污染等缺點,具有消耗溶劑少(僅需μL級),富集倍數(shù)大,萃取效率高,操作更簡便,便于實現(xiàn)分析的自動化等突出優(yōu)點,被廣泛研究和應用,有著很大發(fā)展?jié)摿?。此外,新型的吸?/p>
20、介質如石墨烯等各種納米材料、磁性介質等也被大量用于樣品前處理,未來實現(xiàn)工業(yè)化生產后,將可能大大提高樣品前處理的效率[11]。 1.3 免疫分析 免疫分析:一種生物化學分析方法,原理是抗原抗體特異性結合,種類包含酶聯(lián)免疫分析,免疫親和層析柱等,給予免疫原理的分析方法往往靈敏度高且特異性強[12]。 1.3.1 抗原 抗原(Antigen,Ag)能夠刺激機體的免疫系統(tǒng),然后誘導動物機體發(fā)生免疫應答。[12]抗原最基本的兩個特性是:異物性,它在結構上和自身機體不一樣,異種物質或者同種異體物質都包含在內;大分子性,一般擁有一萬以上的分子質量,并且分子質量越大,抗原的特異性就越強[13
21、];免疫原性,一種誘發(fā)免疫應答的能力;二:抗原性,與免疫應答產物相反應的能力。根據(jù)抗原特質,可把它分為兩類: 如表1.2中所示。 表1.2 抗原分類 不同抗原如何區(qū)分定義?不同抗原的獨特性來自不同抗原決定簇。這種獨特性表現(xiàn)在兩個方面:一種抗原僅能引發(fā)一種免疫應答;只有由抗原誘導產生的抗體或致敏淋巴細胞才能與抗原結合。[14]還有一種普遍的情況:同一類的化合物,某種抗原決定簇也會出現(xiàn)在其他化合物上,這兩種化合物擁有重合的部分稱為共同抗原表位,也叫交叉抗原(Cross antigen),能夠與類似物刺激產的抗體發(fā)生交叉反應(Cross reaction)[15]。例如:氯霉素,氟苯尼考,甲砜霉
22、素等化合物都是一類結構性質相近的小分子化合物,均屬于半抗原。半抗原修飾的方法可以將其轉變?yōu)橥耆乖?,用載體連接的小分子才能有免疫原性,進而刺激機體,產生抗體。 1.3.2 抗體 圖1.1 抗體結構圖 抗體結構如圖1.1所示,它本質上是與特定抗原進行結合得的糖蛋白類免疫球蛋白(Ig)。在體內,抗體是由外源分子的侵襲,免疫系統(tǒng)受刺激而產生的??贵w由 4 條多肽鏈組成Y形狀分子, 其中兩條較長、分子量較大的相同的重鏈;兩條較短,分子質量較小的相同的輕鏈。鏈間由二硫鍵和非共價鍵聯(lián)結成一個整體分子。輕鏈有k和λ兩種,重鏈有μ、δ、γ、ε和α五種。給定的物種,不同的抗體分子具有幾乎相同的頂端鏈上
23、氨基酸序列和種類,叫做C區(qū),恒定區(qū)。[16]而位于Y形狀末端的一小段相對不穩(wěn)定的部分叫可變區(qū)。任何一個抗體位于Y形狀末端的部位是抗原結合片段,F(xiàn)ab,柄部是結晶片段,F(xiàn)c端。 1.3.3 抗原抗體反應 抗原抗體擁有“鎖和鑰匙”結構,這種結合可以發(fā)生在體內外。這一重要原理是免 疫 分 析 之 基 礎。它們之間的結合異常迅速,只需幾秒。先以氫鍵結合脫水,然后緊密結合為成分子間的非共價鍵。[17] 值得注意的是,抗原和抗體的反應有:特異性、可逆性和比例性。特異性在前文介紹抗原時已經指出,結合的抗原抗體只能一一對應??赡嫘灾傅氖钱斂乖c抗體結合后,還可以重新解離成為游離抗原和抗體的性質,當然這
24、種解離需要與結合時要求不同的特定的條件。而比例性,就是抗原抗體要符合一定比例,合適的比例會使得它們相互之間結合最牢固。抗原抗體兩者中任何一個濃度不合適對反應都會有影響??乖贵w之間的反應受非常復雜的條件影響,有些條件促進結合,有些條件促進解離。精確掌握抗原抗體反映的特性條件,就可以利用免疫親和的方法來分離并且純化抗原。[18] 1.4 免疫親和層析柱(IAC) 1.4.1 簡述及現(xiàn)狀 隨著科研進程中實驗的進行與經驗的積累,涌現(xiàn)針對各式各樣樣品適用的預處理方法,在具有針對性強的優(yōu)勢的同時還存在一些不足。而IAC可以克服許多預處理中遇到的問題,從而使實驗順利進行。它利用的是抗原抗體“鎖和
25、鑰匙”結合而又可逆的原理,因此制備的IAC柱就具有獨特的選擇性、專一性和良好的吸附凈化性,日益成為了一種實用性強度的藥品毒素殘留檢測的凈化技術。IAC在食品安全檢測中的應用非常廣泛,涵蓋糧油中的真菌霉素,農產品水產品中獸藥的檢測,以及一些毒性物質的凈化檢測。[19] 1.4.2 IAC 的原理 免疫親和柱技術原理是:柱床內裝有柱膠,這種柱膠是由特定的單克隆抗體與瓊脂糖凝膠交聯(lián)而成的懸浮物,[20]這樣的抗體交聯(lián)物,對某種特定抗原有特異性吸 附的功能。 由于生物大分子(抗原)和配基(抗體)的結合是專一可逆的,此通 過選擇適當配基與生物大分子專一性地結合,然后調整洗脫液的組成,將目標
26、物洗脫 圖1.2 免疫親和層析原理 使其流出親和柱,最后能夠同時達到萃取、純化、分離,目標物質的成效,方便的進行下一步上機檢測。 1.4.3 IAC的優(yōu)勢 (1) 簡化許多繁瑣的樣品預處理的步驟; (2) 樣品純化回收率高的同時耗時短,達到高效的結果 (3) 經過IAC預處理的樣品純度可以達到很多方法和精密儀器檢測的要求。 (4) 即使樣品復雜也能保證很高的靈敏度 (5) 由于抗原抗體的特異性,IAC具有定性的作用 (6) 根據(jù)抗體交叉反應的性質,可以用于單組分或多組分分析。[21]
27、 第二章 氯霉素單組分免疫親和色譜法的建立 2.1 氯霉素檢測方法的現(xiàn)狀 目前有關動物源性食品中氯霉素及其代謝物的測定方法主要為理化檢測法,如用化學分析法測定蝦肉中的氯霉素殘留量,測定魚肉中的氯霉素殘留量。但這些方法儀器設備昂貴,操作復雜,靈敏度低,且不適用于大批量樣品的檢測[22] 。 2.2 氯霉素 圖2.1氯霉素分子結構 2.2.1 氯霉素分類 氯霉素還有其衍生物甲砜霉素,氟苯尼考都是抗生素。從免疫分析學科上來講,三者具有相似的抗原表位。甲砜霉素的抗菌效果比氯霉素的效果差些,常常用于家禽和羊呼吸道疾病消化系統(tǒng)疾病的預防和治療。氟苯尼考,是氯霉素的又一種替代
28、品抗菌效果更佳。[23] 2.2.2氯霉素檢測方法 表2.1抗生素氯霉素檢測方式[24] 2.3 本課題的研究意義及目的 經濟水平日益提升,民眾對生活、對“食”有了進一步質的需求。本實驗從氯霉素作半抗原制備的幾株單克隆雜交瘤細胞株中遴選出一株細胞—2D2,其誘生的單抗腹水樣本具有高靈敏度、強特異性。[24]對所產腹水做了間接競爭的ELISA試驗,結果表明該腹水中抗體對氯霉素有極高的檢測靈敏度(IC50為0.45ppb)和效價(效價為1:140000),從交叉反應實驗也證明了氯霉素單克隆抗體的特異性強(對氯霉素的交叉反應率為100%,對其他免疫交叉率均≦0.01%)。 基于以上所
29、述氯霉素單克隆抗體的有益效果,本實驗提供了所述氯霉素免疫親和層析色譜膠;前處理對象為氯霉素標準品摻入的標準緩沖液以及摻入氯霉素的標準空白蝦肉作為模式基質的試樣。 本實驗選用針對氯霉素具有高靈敏度和強特異性識別與結合的單抗,將其作為核心試劑應用于免疫親和層析膠研制中,其產品對目標物同樣具有高選擇性、高親和力等特性;以此作為新型機測樣本前處理模式能有效去除待測樣本的基質干擾,獲得高回收率、高純度目標物LC-MS/MS作確證和精確定量分析;[25][26]與傳統(tǒng)固相萃取前處理模式比較發(fā)現(xiàn),這種新型前處理模式在操作便捷性、樣本凈化通量、目標物回收率、機測峰型[27]等指標優(yōu)于傳統(tǒng)理化前處理, [28
30、]拓展了HPLC-FLD/LC-MS/MS檢測氯霉素殘留樣本的應用領域。 2.4 實驗材料 2.4.1 實驗試劑 2.4.2 溶液配制 2.4.3 實驗儀器和設備 2.5 實驗部分 2.5.1操作條件 2.5.1.1高效液相色譜條件 色譜柱:MGC18,100mm×2.0mm(i.d.),粒徑5μm;(CAPCELL PAK) 柱溫:40℃ 進樣量:7.5μL 濾膜:0.22μm水系濾膜 流動相:流動相A:MeOH 流動相B: 水 流動相梯度洗脫條件: 時間 A% B% 流速(mL/min)
31、0.00 20 80 0.3 1.00 20 80 0.3 3.00 90 10 0.3 4.00 90 10 0.3 5.00 20 80 0.3 表2.2高效液相色譜梯度洗脫條件 2.5.1.2 質譜條件 離子源:ESI 掃描方式:負離子掃描 檢測方式:多反應監(jiān)測 電離電壓:4.0kV 霧化溫度:350攝氏度 霧化氣流速:30L/h 碰撞氣:氬氣 CAP定性離子對:320.9>257.0或320.9>152.0 CAP定量離子對:320.9>152.0 去簇電壓:114V 碰撞能量:16或24eV 2.5.2 抗體的
32、獲取與純化 2D2雜交瘤細胞株細胞懸液注射的小鼠的腹腔,一星期后采集腹水,1000 r/min離心10min去細胞去佐劑(浮在上層的免疫致敏劑),取含有抗體的上清后12000r/min 離心30min以去除腹水中細胞碎片,-20℃凍存?zhèn)溆谩? 純化前取腹水解凍備用。備塑料柱床,用純水和PBS (pH=8.0)多次清洗柱床。Protein G對小鼠IgG親和力強,加4ml 50% Protein G resin膠懸濁液,用PBS (pH=8.0)沉降。PBS (pH=8.0)淘洗50個柱膠體積后柱膠基本壓實,取腹水,5000rpm離心去除固態(tài)雜質后取上清,用冷PBS (pH=8.0) 三倍稀釋
33、,取出20μL做SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳純度對照。放液,柱膠將干未干時第一次加腹水,少量多次以防止滴穿,冰浴過5次柱防止抗體失活。最后冷PBS (pH=8.0)再次洗滌50個柱膠體積,最后3次洗滌要求將干未干,防止后續(xù)收集時造成死腔。 用預冷的Glycine(pH=2.5)將抗體洗脫,接收在預裝有100μLTris-HCl 8.5緩沖液的EP管中,共接12管。60mL冷Glycine (pH=2.5)洗滌柱,用PBS (pH=8.0)洗50柱膠體積。重復第四步將第二批腹水純化,結束后用 PBS(pH=8.0)洗滌存放柱膠,并取奇數(shù)管20μL純化后抗體做BCA,篩選信號強的管合并置于7500-
34、14000MW透析袋中用PBS (pH=7.4)透析冰箱中進行透析。取20μL透析液做SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳與原腹水對照,換交聯(lián)緩沖液(CBS 8.3)繼續(xù)透析。純化單抗蛋白,于500mL 0.1M NaHCO3/0.5M NaCl (pH8.3)緩沖溶液中4℃透析過夜,每4-6h換液一次。 圖2.2抗體純化 2.5.3 抗體蛋白含量的測定 Bicinchoninic acid,聚氰基丙烯酸正丁酯,而BCA試劑盒A液CuSO4與B液NaOH混合,配制一系列標準蛋白梯度孔,加混液200μL。蛋白質將AB混和溶液中的Cu2+經雙縮脲反應還原為Cu+,BCA 與生成的Cu+高度特異性結合
35、,產生紫色的復合物,蛋白質的濃度越大BCA呈現(xiàn)的紫色越深。在562nm出測定吸光值繪制標準曲線并將樣本吸光度帶入。由于實驗室酶標儀沒有562nm光,故采用相近的490nm測定。定量方法還可采用公式:1.51×OD280-0.73×OD260。 2.5.4抗體純度測定 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) ,根據(jù)蛋白質分子量與電荷量的不同通過電泳形成不同運動速度的區(qū)帶,加以標準質量蛋白質作為參照,可以得知待測蛋白質鏈的分子量。取樣品20μL,加等體積的溴酚藍染料染色,沸水煮10min后,12000r/min離心10min,在聚丙烯酰胺網(wǎng)狀凝膠中進行電泳,首先加壓200V,30
36、min后用80V繼續(xù)電泳3h,蛋白質分子的電荷及其分子量差異使其遷移率不同形成不同區(qū)帶。 2.5.5 氯霉素免疫親和柱的制備 根據(jù)文獻以及經驗值,樹脂微球和抗體交聯(lián)的比例關系:1mL膠=0.3g Sepharose 4B 凍干粉=5-8mg單抗。但為保證抗體不浪費,一般多取一些凍干粉。 1.將CNBr-activated Sepharose 4B進行溶脹、淘洗,具體操作為:稱取CNBr-activated Sepharose 4B凍干粉0.92g,加入溶脹微球的稀HCl 40mL,離心棄上清,加入稀HCl離心洗滌以去除CNBr-activated SepharoseTM 4B膠中其他小分
37、子化學試劑后,再用NaHCO3/NaCl緩沖溶液40mL離心洗滌一次,備用。 2.預處理的純化單抗蛋白中加入至含步驟1所述處理膠的50ml離心管中,蓋好并用parafilm膜封口,置于擺床中室溫擺動孵育1h,2000r/min離心10min棄上清。稍高的溫度可以使樹脂微球與抗體結合效率增大。離心管中加入30ml的0.1M NaHCO3/0.5M NaCl緩沖溶液,置于擺床中室溫擺動10min,再用與之前相同的條件反復離心洗滌5-6次,由此盡量完全去除未交聯(lián)的蛋白和一些雜質,即獲得抗體-蛋白交聯(lián)膠。取上清液再做一次BCA蛋白測定,若無紫色則確保交聯(lián)成功。 取步驟2抗體-蛋白交聯(lián)膠,離心管加入
38、40ml 0.1M Tris-HCl置于擺床中室溫擺動孵育2h以充分封閉抗體蛋白交聯(lián)膠中未與蛋白交聯(lián)的活化基團,用2000r/min轉速離心10min后棄去上清液,裝有交聯(lián)膠的離心管分別用40ml 0.1M HAC-NaAC/0.5M NaCl和40ml 0.1M Tris-HCl/0.5M NaCl兩種緩沖液交替進行洗滌離心三個循環(huán),這一步的目的是除去非共價形式的交聯(lián),比如弱離子鍵交聯(lián)。將交聯(lián)膠重懸于十倍膠體積0.1M Tris-HCl/0.5M NaCl緩沖液并,如長期不用,要補加防腐抗菌劑0.02% NaN3,于0℃保存?zhèn)溆茫传@得所述免疫親和層析色譜膠。[25] 2.5.6 氯霉
39、素免疫親和柱的表征 2.5.6.1氯霉素免疫親和柱指標測定 氯霉素結合性能指標測定的方法,包括: 取純水配制的1mg/m氯霉素儲存液,用純水將每種藥物分別稀釋成:0、0.1、0.3、1、5、10、20、30、50、200、400ng/ml十一個濃度點和空白對照點于5ml EP 管中(4ml/管)(經抗體與氯霉素質量比率計算柱容量理論值遠小于500ng)。 另取11支1.5ml EP管,每管均加入500μl免疫親和層析膠懸液(層析膠實際壓積為50μl),用0.01M PBS(pH 7.4)離心洗滌二次盡量吸干PBS后,分別將每種藥物各濃度點的稀釋管液一一對應移入含免疫層析膠EP 管中。將
40、各濃度點結合膠輕輕懸浮后,于擺床室溫擺動孵育1h,1000r/min 離心10min棄上清,用0.01M PBS(pH 7.4)離心洗滌3-5次,再用純水離心洗滌2次,盡量吸干膠中殘液。低的pH可以使交聯(lián)膠結合能力下降,而有機溶劑促進氯霉素洗脫溶解,洗脫液具有揮發(fā)性物質可以減少HPLC進樣緩沖的步驟,因此選用1ml 0.1% 甲酸 (pH2.2)重懸結合膠,并于擺床室溫擺動15min,1000r/min 離心10min。為維護HPLC-MS/MS儀器,將樣品均稀釋在最終濃度10ng/ml以下,最后分別用1ml一次性注射器抽取每個處理上清800μL一一對應用0.22μm水系濾膜過濾至進樣管,進L
41、C-MS/MS作確證和精確定量測定。進樣機測后,判讀各濃度點的機測信號:以信號峰:基線峰比值≥3的對應濃度為檢出限;以二者比值≥10的對應濃度為定量限;以添加標準品各濃度的值作橫坐標,以機測信號峰面積作為縱坐標計算每一個濃度樣品所對應的回收率;以機測信號換算濃度不再上升對應最小濃度點為最大吸附量。 2.5.6.2 樣品處理方法 為保證樣品中不含有氯霉素殘留,基質蝦肉為市場采購太湖野生蝦。首先要將蝦肉進行初步處理:將蝦肉樣品充分剪碎再加入適量水勻漿,稱取每份 2 g 的蝦肉泥于 50 m L 離心管中,作為陰性對照的空白樣品不加氯霉素,其余分別加入梯度濃度10、20、30、40、
42、50ng/g的標準工作液的氯霉素標準溶液,渦旋混勻。加入3g無水硫酸鈉除水,12mL乙酸乙酯萃取CAP,渦旋震蕩使得CAP充分被乙酸乙酯萃取出來。6000r/min離心4min除雜,吸取上清液9mL(EA添加量的3/4)于15mL離心管中,50℃水浴用氮吹儀吹干,加入3mL水復溶,渦旋混勻。加入3mL正己烷除脂,5000r/min離心4min,然后靜置 15 min。將正己烷吸出,余下液體取1mL用于上樣IAC和SPE柱。這一步進行完后原加標的濃度相當于兩倍稀釋了。備用過柱。 對于奶粉和飼料樣品,進行同樣的加標處理方法,但不需要除脂除水。 2.5.6.3 樣品的測定 每管均加入500μl
43、免疫親和層析膠懸液(層析膠實際壓積為50μl),用0.01M PBS(pH 7.4)離心洗滌二次盡量吸干PBS后,分別將加標處理復溶好的樣品加入含免疫層析膠EP 管中。將各濃度結合膠輕輕懸浮后,于擺床室溫擺動孵育1h,1000r/min 離心10min棄上清,用0.01M PBS(pH 7.4)離心洗滌3-5次,再用純水離心洗滌2次,盡量吸干膠中殘液。選用1ml 0.1% 甲酸 (pH2.2)重懸結合膠,并于擺床室溫擺動15min,1000r/min 離心10min。為維護HPLC-MS/MS儀器,將樣品均稀釋在最終濃度10ng/ml以下,最后分別用1ml一次性注射器抽取每個處理上清800μL
44、一一對應用0.22μm水系濾膜過濾至進樣管,進LC-MS/MS作確證和精確定量測定,最后計算加標回收率。 2.5.6.4與國標傳統(tǒng)SPE柱凈化方法對比 根據(jù)GB/T18932.19-2003提到的方法:[26] 樣品提取同2.5.6.2中所述。凈化具體操作為:將Waters HLB小柱用甲醇活化后再用共10mL水清洗3次,此時提前將流速控制在3mL/min。上樣過柱,緩慢添加防止CAP大量吸附在柱壁上。待溶液完全流出后,用3mL乙腈+水(10mL乙腈與70mL水混合)洗滌柱。[27]乙腈水盡量流干,為促進可用洗耳球吹,靜置一段時間。最后用3mL乙酸乙酯洗脫,收集洗脫液與10mL具塞試管中
45、,與50℃水浴中用氮氣吹干儀吹干,用1-5mL水復溶稀釋,渦旋混勻后用加濾膜的注射器分別收集在進樣瓶中待上機測定。每管均加入500μl免疫親和層析膠懸液(層析膠實際壓積為50μl),用0.01M PBS(pH 7.4)離心洗滌二次盡量吸干PBS后,分別將每種藥物各濃度點的稀釋管液一一對應移入含免疫層析膠EP 管中。將各濃度點結合膠輕輕懸浮后,于擺床室溫擺動孵育1h,1000r/min 離心10min棄上清,用0.01M PBS(pH 7.4)離心洗滌3-5次,再用純水離心洗滌2次,盡量吸干膠中殘液。低的pH可以使交聯(lián)膠結合能力下降,而有機溶劑促進氯霉素洗脫溶解,洗脫液具有揮發(fā)性物質可以減少HP
46、LC進樣緩沖的步驟,因此選用1ml 0.1% 甲酸 (pH2.2)重懸結合膠,并于擺床室溫擺動15min,1000r/min 離心10min。為維護HPLC-MS/MS儀器,將樣品均稀釋在最終濃度10ng/ml以下,最后分別用1ml一次性注射器抽取每個處理上清800μL一一對應用0.22μm水系濾膜過濾至進樣管,進LC-MS/MS作確證和精確定量測定。 2.7 結果與討論 2.7.1 氯霉素抗體濃度的測定 圖2.3 BCA標準曲線 此為BCA標準蛋白的濃度-吸光度繪制標準曲線,將待測樣本兩個平行樣的吸光 度取均值帶入曲線,得到抗體的量:3月15日第一批純化蛋白濃度1.33m
47、g/mL,共10mL,13.3mg;4月1日第二批純化蛋白濃度1.05mg/mL,共15mL,15.8mg。 2.7.2 氯霉素抗體純度的測定 腹水樣本通過protein G resin 一步法來純化單抗蛋白,SDS-PAGE 電泳鑒定結果顯示:腹水純化物僅有含50Kd(抗體重鏈)和25Kd(抗體輕鏈)二條明顯蛋白條帶,無其他雜蛋白帶,表明通過該雜交瘤細胞株誘生腹水原料經處理可獲得高濃度、高純度單抗蛋白,可以滿足制備免疫親和層析膠中檢測抗體的量和純度需求。 圖2.4抗體純化結果 2.7.3 IAC交聯(lián)程度測定 取交聯(lián)結束后的膠500rpm離心,取上清液再做一次BCA蛋
48、白測定,BCA結果呈現(xiàn)綠色(BCA試劑本身顏色),殘余溶液中不存在蛋白質,證明交聯(lián)成功,吸光度測定顯示交聯(lián)程度大于95%。 2.7.4 氯霉素免疫親和柱特性表征 試驗濃度 (ng/ml) 檢出限 (ng/ml) 定量限 (ng/ml) 結合容量 (ng/μL) 回收率(%) 0 —— —— —— —— 0.1 ≦0.1 —— —— 10.8 0.3 —— ≧0.3 —— 78.9 1 —— —— —— 129.9 5 —— —— —— 92.3 10 —— —— —— 79.5 20 —— ——
49、—— 73.1 30 —— —— —— 95.1 50 —— —— —— 98.7 100 —— —— —— 106.1 200 —— ≦200 ≦200 67.5 400 —— —— —— 12.3 表2.3氯霉素IAC表征指標 由上表可以看出,IAC凈化氯霉素用LC-MS/MS檢測的靈敏度在0.1ng/mL以下,從0.3 ng/mL到100ng/mL呈現(xiàn)出較好的線性關系,一直到100ng/mL回收率仍維持在較高的范圍內。濃度大于200ng/mL時回收率開始有了大幅度下降。故本方法的定量限≧0.3,有效檢測范圍0.3-100ng/m
50、L。我們還可以得知結合容量(最大柱容量)落在回收率仍未大幅度下降的范圍內,每50μL柱膠抗體可以結合≤200ng氯霉素。 回歸方程:y = 118.86 x + -59.84 (r = 0.9938) 圖2.5 氯霉素標準品IAC標準曲線 2.7.5 對比SPE柱凈化結果討論 表2.4免疫親和層析法與固相萃取法對氯霉素摻入蝦肉凈化后的LC-MS/MS定量對比分析 摻入蝦肉中濃度 (ng/ml) 免疫親和層析法凈化 固相萃取凈化(國標) 回收率(%) 回收率(%) 0 —— —— 10 83.2 62.5 20 69.2 55.5 30 80
51、.7 60.8 40 77.6 36.1 50 79.6 51.2 摻入奶粉中濃度 (ng/ml) 免疫親和層析法凈化 固相萃取凈化(國標) 回收率(%) 回收率(%) 0 —— —— 1 106.9 86.9 10 90.5 77.1 50 91.8 73.8 經LC-MS/MS測定結果顯示: 針對系列濃度氯霉素摻入空白蝦肉模式待測樣本,試樣經LC-MS/MS精確定量分析:與固相萃取凈化組相比,免疫親和層析凈化組在有效檢測濃度域內,免疫親和層析凈化組的回收率顯著高于固相萃取凈化組的回收率,上述定量指標表明免疫親和層析作為新型處理模式其
52、處理效果優(yōu)于傳統(tǒng)前處理模式。 總結 昔年本科生涯匆匆而過,氯霉素單組分免疫親和色譜法的研究不僅是我的畢業(yè)設計,同時它也是我真正科研生活的開端。本課題的確定是基于目前國內對食品安全的日益關注以及實驗室的研究背景。該課題具有很大的實際應用價值,研究方法可靠。實驗氯霉素單組分免疫親和色譜法的研究。實驗主要是基于實驗室成功合成的氯霉素單克隆抗體而制備的免疫親和柱。預處理方法主要包括免疫親和柱部分:抗體的純化、免疫親和柱的制備、免疫親和柱的檢測限,靈敏度、柱容量等性質測定、與傳統(tǒng)SPE柱凈化效果的對比、真實樣品蝦肉的測定。實驗的過程并非一帆風順,純化好的抗體交聯(lián)時曾加錯了溶液導致前功盡棄,上機測定時
53、標準曲線因為濃度設計的不好結果不好,好在一切磕磕絆絆都得以解決,因為科研人每一步不缺從頭再來的勇氣。 結果是成功制備了能夠在基質中有效提取氯霉素的的免疫親和柱,進而用 HPLC-MS/MS 進行定性定量檢測的分析方法,首先測定了免疫親和柱自身柱特性,用此種方法處理過的樣品檢出限在0.1ng/mL以下,定量限是0.3ng/mL,有效檢測范圍是0.3-100ng/mL,結合容量為每50μL膠可以吸附200ng樣品。將此種方法應用于實際樣品(蝦肉)的處理中,回收率為平均值超過了80%,且傳統(tǒng)SPE柱回收率平均值在60%以下,數(shù)據(jù)證明了我們建立的氯霉素免疫親和預處理方法可靠而準確,對于實際樣
54、品的分析實驗具有廣闊的前景和價值。 參考文獻 [1]Ireneusz Sowa,Magdalena Wójciak-Kosior,Kamila Rokicka,Ryszard Kocjan,Gra?yna Szymczak. Application of solid phase extraction with the use of silica modified with polyaniline film for pretreatment of samples from plant material before HPLC determination of triterpenic ac
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