生物實(shí)驗(yàn)： dna連接與轉(zhuǎn)化

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1、 DNA的連接與轉(zhuǎn)化的連接與轉(zhuǎn)化1.分子的體外連接 2的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選一實(shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘耙粚?shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘?當(dāng)我們已經(jīng)獲得目的基因片段，選擇好適當(dāng)?shù)目寺。ɑ虮磉_(dá)，轉(zhuǎn)化）質(zhì)粒載體， 并確定重組方案后，下面要進(jìn)行的就是片段之間的體外連接，從而獲得重組子。 此重組子可轉(zhuǎn)入相應(yīng)的宿主菌中用于對(duì)目的基因的擴(kuò)增以及目的基因表達(dá)（如現(xiàn)代基因工程藥物的生產(chǎn)），還可用于序列分析和轉(zhuǎn)基因等重要生物技術(shù)的研究中。1、分子的體外連接 分子的體外連接就是在一定條件下， 由連接酶催化兩個(gè)雙鏈片段組鄰的端磷酸與端羥基之間形成磷酸酸脂鍵的生物化學(xué)過(guò)程， 分子的連接是在酶切反應(yīng)獲得同種酶互補(bǔ)序列基礎(chǔ)上進(jìn)行的

2、。連接反應(yīng)中值得注意的幾個(gè)問(wèn)題： 1.連接酶 常用的連接酶有兩種： (1)來(lái)自大腸桿菌的連接酶 (2)來(lái)自噬菌體的連接酶。 二者的作用機(jī)理類(lèi)似。連接酶作用機(jī)制 連接酶作用分三步： 連接酶與輔助因子形成酶復(fù)合物。 酶復(fù)合物結(jié)合到具有磷酸基和羥基切口的上，使腺苷化。 產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵，把缺口封起來(lái).2.連接反應(yīng)的溫度 連接酶的最適反應(yīng)溫度為， 但在此溫度下， 粘性末端的氫鍵結(jié)合很不穩(wěn)定，折衷方法是過(guò)夜。3. DNA的平未端和粘性末端 由于內(nèi)切酶產(chǎn)生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而連接反應(yīng)中就有平未端連接和粘性末端連接。 二者連接效率不同。 粘性末端效率高，因而在底物濃度，酶濃度選擇上是有

3、差異的，4.堿性磷酸酶處理質(zhì)粒載體 為了提高連接效率，一般采取提高的濃度，增加重組子比例。這樣就會(huì)出現(xiàn)自生連接問(wèn)題， 為此通常選擇對(duì)質(zhì)粒載體用堿性磷酸酶處理，除去其末端的磷酸基，防止環(huán)化， 通過(guò)接反應(yīng)后形成的缺口可在轉(zhuǎn)化細(xì)胞后得以修復(fù)。見(jiàn)下圖。5.連接反應(yīng)的檢測(cè) 連接反應(yīng)成功與否，最后的檢測(cè)要通過(guò)下一步實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)化宿主菌， 陽(yáng)性克隆的篩選來(lái)確定。 我們下面的實(shí)驗(yàn)從粘性末端為例操作。 二、實(shí)驗(yàn)試劑二、實(shí)驗(yàn)試劑 純化后的酶切質(zhì)粒載體和目的基因。 連接酶buffer 200mM Tris-HCl(pH7.6) 50mM MgCl2 50mM 二硫芐糖醇 500l/ml BSA 連接酶 5mM ATP三

4、實(shí)驗(yàn)方法三實(shí)驗(yàn)方法分子的體外連接在無(wú)菌Eppendorf管中加入以下溶液：a. 0.1g質(zhì)粒載體，倍分子的外源。b. 加無(wú)菌水至7.5l，于加溫分鐘使重新退火的粘端解鏈， 將混合物冷卻到。c. 加入：連接酶buffer 1l連接酶 0.1Weiss5mM ATP 1l蓋上管蓋，充分混勻，臺(tái)式離心扣上離心秒。下過(guò)夜連接反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后于保存。四結(jié)果與分析四結(jié)果與分析 電泳檢查連接結(jié)果 如何判斷連接效果的成功性？問(wèn)題與討論： 簡(jiǎn)述連接酶作用機(jī)理。 簡(jiǎn)述一個(gè)完整外源的克隆過(guò)程。 連接反應(yīng)中應(yīng)注意些什么問(wèn)題及如何提高連接效率。2的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選 一實(shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘耙粚?shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘?/p>

5、 體外通過(guò)基因工程手段所構(gòu)建的含目的基因的重組質(zhì)粒，選用轉(zhuǎn)化和篩選技術(shù)， 可獲得含重組的陽(yáng)性克隆。在此陽(yáng)性克隆中，可在生物體系中大量擴(kuò)增，繁殖， 保存以及表達(dá)目的基因的產(chǎn)物，這是體外擴(kuò)增所不能替代的。配合重組技術(shù)，所獲得的，不同目的需要的陽(yáng)性菌株已廣泛應(yīng)用于科研，醫(yī)藥生產(chǎn)和生物發(fā)酵等領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)由二個(gè)方面組成: 1. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌。 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化不同細(xì)菌有不同的轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化效率的高低與實(shí)驗(yàn)的成敗直接相關(guān)， 通常轉(zhuǎn)化效率可達(dá)轉(zhuǎn)化子/g DNA。 獲得高轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵是感受態(tài)體菌的制備。 所謂感受態(tài)， 就是細(xì)菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理狀態(tài)。 關(guān)于感受態(tài)的本質(zhì)與存在，說(shuō)法很多， 目前主要有兩種假說(shuō)： 局

6、部原生質(zhì)體化假說(shuō)感受態(tài)細(xì)胞的表面形成一種能接受的酶位點(diǎn)， 使分子能進(jìn)入細(xì)胞。制備感受態(tài)細(xì)胞 現(xiàn)在制備感受態(tài)細(xì)胞通常用CaCl2處理，在低溫中與外來(lái)分子相混合. 分子轉(zhuǎn)化分以下幾步: 吸附雙鏈分子吸附于受體菌表面； 轉(zhuǎn)入雙鏈分子解鏈。一條鏈進(jìn)入受體菌，另一條降解； 自穩(wěn)外源質(zhì)粒分子在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制成雙鏈； 表達(dá)一供體基因隨同復(fù)制子同時(shí)復(fù)制，分裂， 轉(zhuǎn)錄翻譯。2.重組子的篩選 這和受體菌：質(zhì)粒的選擇相關(guān)， 原則上要注意： 受體菌必須是限制與修飾系統(tǒng)缺陷的菌株； 根據(jù)質(zhì)?；蛐秃褪荏w菌基因型互補(bǔ)原則而定。 重組子的篩選方法常用的有兩種方法：抗生素篩選法 菌株為某種抗生缺陷型， 而質(zhì)粒上帶有該抗性基因（如

7、氨芐青霉素， 卡拉霉素等）這樣只有轉(zhuǎn)化子才能在含該抗生素的培養(yǎng)基上長(zhǎng)出。本實(shí)驗(yàn)利用抗生篩選轉(zhuǎn)化子?；パa(bǔ)法 現(xiàn)在使用的許多載體（如系列）有含有一個(gè)大腸桿菌的短區(qū)段，其中含有半乳糖苷酸基因（lacZ）的調(diào)控序列和頭個(gè)氨基酸偏碼區(qū)。這個(gè)偏碼區(qū)中插入一個(gè)多克隆位點(diǎn)。 受體菌則含編碼半乳糖苷酶端的序列。當(dāng)外源基因插入時(shí)，二者溶為一體后，有半乳糖苷酶表達(dá)， 在生色底物溴氯吲哚半乳糖苷（x-gal）培養(yǎng)基中形成蘭色菌落。 而當(dāng)有外源基因插入到多克隆原點(diǎn)，從而造成插入失活，而使lacZ基因不表達(dá)而形成白色菌斑。 通過(guò)顏色不同而區(qū)分重組子和非重組子。二、實(shí)驗(yàn)試劑二、實(shí)驗(yàn)試劑 培養(yǎng)基 質(zhì)粒（含Amp抗生基因），受

8、體菌 CaCl2 0.1M Amp 三實(shí)驗(yàn)方法三實(shí)驗(yàn)方法一、感受態(tài)細(xì)胞制備將宿主菌在瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線(xiàn)，培養(yǎng)小時(shí)。挑取單菌落轉(zhuǎn)入 培養(yǎng)基錐瓶中，振蕩過(guò)夜。從中取菌液轉(zhuǎn)入 培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)小時(shí)， 測(cè)達(dá)。培養(yǎng)物于冰上分鐘。轉(zhuǎn)入離心管，于下離心分鐘。棄上清，倒置離心管分鐘，流盡剩余殘液然后加入10ml用冰預(yù)冷的 0. 1mol/L CaCl2，置冰上分鐘。4,000rpm 4離心分鐘，棄上清。加入2ml，0.1M CaCl2懸浮細(xì)胞，于過(guò)夜。二、轉(zhuǎn)化 在1.5ml Eppendorf管中加入l感受態(tài)細(xì)胞和l 40ng DNA溶液， 溫和混勻，于冰上分鐘。 于水浴秒。 冰浴分鐘。 加入l 液體培養(yǎng)基 分鐘。 取l涂布于含Amp(50g/ml)瓊脂糖平皿， 培養(yǎng)小時(shí)，觀察結(jié)果。四結(jié)果與分析討論四結(jié)果與分析討論 計(jì)算轉(zhuǎn)化率。 根據(jù)轉(zhuǎn)化率和陰性對(duì)照分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 問(wèn)題與討論： 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為影響轉(zhuǎn)化率的因素有哪些？ 抗性法篩選和互補(bǔ)篩選原理是什么？