低磷對(duì)棉花葉片氮代謝的影響生物技術(shù)專(zhuān)業(yè)

《低磷對(duì)棉花葉片氮代謝的影響生物技術(shù)專(zhuān)業(yè)》由會(huì)員分享，可在線(xiàn)閱讀，更多相關(guān)《低磷對(duì)棉花葉片氮代謝的影響生物技術(shù)專(zhuān)業(yè)（23頁(yè)珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、 低磷對(duì)棉花葉片氮代謝的影響 摘 要 棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，在人類(lèi)的生產(chǎn)生活中發(fā)揮了重要的作用。磷是植物的主要營(yíng)養(yǎng)元素之一同時(shí)也是土壤中常因供應(yīng)不足而影響作物產(chǎn)量的三要素之一。本試驗(yàn)采用耐低磷型品種（中棉所79）和低磷敏感型品種（魯棉研28），研究在土壤重度低磷（(3±0.5) mg?kg-1，P0）、輕度低磷（(8±0.5) mg?kg-1，P1）、適宜磷水平（(12±0.5) mg?kg-1，P2）條件下，棉花葉片氮代謝物（葉綠素、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、氨基酸、可溶性蛋白）含量和氮代謝酶（谷氨酰胺合成酶(GS)、蛋白

2、酶、谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)）活性的變化。結(jié)果顯示：與P0處理相比，在P2處理下，中棉所79和魯棉研28葉片的葉綠素含量分別增加了8.5%和19.5%、硝態(tài)氮含量分別減少了16.5%和30.5%、銨態(tài)氮含量分別減少了9.0%和35.6%、GS活性分別減少了21.6%和11.6%、GOT活性分別減少了16.1%和21.0%、GPT活性分別減少了26.5%和25.5%、蛋白酶活性分別減少了20.0%和33.8%。總體來(lái)說(shuō)，在低磷脅迫下，棉花葉片中氮素水平提高，其氮代謝物含量和氮代謝酶活性也都會(huì)出現(xiàn)不同程度的增加，其中低磷敏感型棉花葉片中的氮代謝物含量和氮代謝酶活

3、性增加幅度均顯著高于耐低磷型棉花。實(shí)驗(yàn)表明，低磷敏感型棉花更易受到低磷脅迫的影響。 該論文有圖6幅，表2個(gè)，參考文獻(xiàn)36篇。 關(guān)鍵詞：棉花 葉片 低磷 氮代謝 I Effects of Low Phosphorus on Nitrogen Metabolism in Cotton Leaves Abstract Cotton is an important economic crop in our country, which plays an important role in the production and life of human b

4、eings. Phosphorus is one of the main nutrients in plants and is one of the three factors that influence crop yield in the soil. Therefore, it is of great significance to study the effect of low phosphorus on nitrogen metabolism in cotton leaves. This test uses varieties tolerant to low phosphorus (C

5、CRI 79) and low phosphorus sensitive cultivars (LMY 28) severe soil P ((3±0.5) mg?kg-1, P0), mild low P ((8±0.5) mg?kg-1, P1), the suitable phosphorus levels ((12±0.5) mg?kg-1, P2) conditions, cotton leaf nitrogen metabolites (chlorophyll, nitrate nitrogen, ammonium nitrogen, amino acid, soluble pro

6、tein) and the content changes of cotton leaf nitrogen metabolism enzymes (GS, GOT, GPT, protease) activity. The results showed that compared to the treatment of P0, under P2, the chlorophyll content in the leaves of CCRI 79 and LMY 28 was increased by 8.5% and 19.5%, respectively; the nitrate nitrog

7、en content decreased by 16.5% and 30.5%, respectively; the content of ammonium nitrogen decreased by 9.0% and 35.6%, respectively; the activity of GS decreased by 21.6% and 11.6% , respectively; GOT activity decreased by 16.1% and 21.0%, respectively; The GPT activity decreased by 26.5% and 25.5%, r

8、espectively; protease activity decreased by 20.0% and 33.8%, respectively. In general, under low phosphorus stress, as the phosphorus level in cotton leaves increased, the content of nitrogen metabolites and nitrogen metabolism-enzyme activities also will appear different degrees of increase, the lo

9、w phosphorus sensitive content in cotton leaf nitrogen metabolites and nitrogen metabolism enzyme activity increase was significantly higher than that of low phosphorus tolerant cotton. The results showed that low phosphorus sensitive cotton was more sensible to low phosphorus stress. Key words:

10、cotton leaves low phosphorus nitrogen metabolism II 目 錄 摘 要 I Abstract II 目 錄 III 圖清單 IV 縮略詞注釋表 V 1 緒論 1 2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和測(cè)定方法 2 2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 2 2.2 儀器 3 2.3 測(cè)定方法 3 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 6 3.1土壤磷水平對(duì)棉花主莖功能葉中葉綠素含量的影響 6 3.2土壤磷水平對(duì)棉花主莖功能葉中硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量的影響 7 3.3土壤磷水平對(duì)棉花主莖功能葉中游離氨基酸和可溶性蛋白含量的影響 8 3.4土壤磷水平對(duì)棉花主莖

11、功能葉氮代謝酶活性的影響 10 4 討論 12 5 結(jié)論 14 參考文獻(xiàn) 15 致謝 18 III 圖清單 圖序號(hào) 圖名稱(chēng) 頁(yè)碼 圖1 土壤磷水平對(duì)棉花主莖功能葉中葉綠素含量的影響 7 圖2 土壤磷水平對(duì)棉花主莖功能葉中NO3- (A) 和 NH4+ (B) 含量的影響 8 圖3 土壤磷水平對(duì)棉花主莖功能葉中游離氨基酸(A) 和可溶性蛋白(B) 含量的影響 9 圖4 土壤磷水平對(duì)棉花主莖功能葉中GS活性的影響 10 圖5 土壤磷水平對(duì)棉花主莖功能葉中 GOT(A) 和 GPT(B) 活性的影響 11 圖6

12、土壤磷水平對(duì)棉花主莖功能葉中蛋白酶活性的影響 12 IV 縮略詞注釋表 縮寫(xiě)/簡(jiǎn)稱(chēng) 全稱(chēng) CCRI79 中棉所79 LMY28 魯棉研28 P0 土壤重度低磷（（3±0.5）mg?kg-1 P1 土壤輕度低磷（（8±0.5）mg?kg-1 P2 土壤適宜磷水平（（12±0.5）mg?kg-1 GS 谷氨酰胺合成酶 (glutamine synthetase) GOT 谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶 (glutamic oxaloacetic transaminase) GPT 谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶 (glutamate py

13、ruvic transaminase) V 1 緒論 磷在植物體內(nèi)許多重要有機(jī)化合物的組成成分，是植物核細(xì)胞的組成成分，它是細(xì)胞分裂和分生組織發(fā)育所不可缺少的物質(zhì)。土壤中總磷的含量很高，但能被植物吸收利用的有效磷濃度很低，因此，缺磷已經(jīng)成為植物生長(zhǎng)中重要的限制因子之一[1]。長(zhǎng)期的低磷脅迫促使植物在形態(tài)、生理、分子等方面的機(jī)制不斷進(jìn)化從而適應(yīng)低磷脅迫環(huán)境[2]。因此研究調(diào)控植物對(duì)低磷脅迫適應(yīng)性的分子機(jī)制也成為科學(xué)領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。 棉花是世界上最主要的農(nóng)作物之一，它既是最重要的纖維作物，還是紡織、精細(xì)化工原料和重要的戰(zhàn)略物資。氮代謝是植物的基本

14、生理過(guò)程之一，也是參與地球化學(xué)循環(huán)的重要組成部分[3]。植物氮素同化的主要途徑是經(jīng)過(guò)硝酸鹽還原為銨后直接參與氨基酸的合成與轉(zhuǎn)化，期間谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸脫氫酶（GDH）、谷氨酰胺合酶 (GOGAT)、蛋白酶和肽酶等關(guān)鍵酶參與了催化和調(diào)節(jié)[4-5]。 相關(guān)文獻(xiàn)表明[6]，隨土壤有效磷含量增加，棉株中氨基酸、淀粉、可溶性糖、蔗糖的含量變化趨勢(shì)基本一致。土壤有效磷含量在9.3 mg kg-1時(shí)最利于棉株中碳氮代謝產(chǎn)物的積累。在苗期，高磷顯著促進(jìn)棉株氨基酸、淀粉和可溶性糖的總量累積；在蕾期，高磷則顯著促進(jìn)棉株蔗糖的累積[7]。研究表明，磷處理對(duì)水曲柳的氮素水平的分配和同化有著很大影響。各供

15、磷水平下，葉片中全氮、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量均高于根系[8]。隨供磷的減少，葉片中全氮和硝態(tài)氮含量下降，而根系銨態(tài)氮含量升高，表明低磷脅迫下水曲柳偏向銨態(tài)氮的吸收。由此看出，在低磷脅迫下水曲柳幼苗氮素吸收效率下降，減少了氮素向葉片的分配，導(dǎo)致植株光合速率下降[9]。也有文獻(xiàn)報(bào)道[10-11]，關(guān)于低磷狀態(tài)下葉片中GS的活性變化卻出現(xiàn)分歧，部分學(xué)者認(rèn)為葉片中GS活性變化較大且沒(méi)有規(guī)律，另部分學(xué)者認(rèn)為葉片中GS活性變化較小。關(guān)于這個(gè)矛盾，推測(cè)可能是GS對(duì)于磷元素比較敏感，微量的磷元素變化便能引起GS活性改變，也可能是水曲柳的生長(zhǎng)環(huán)境不同導(dǎo)致GS活性不同。 氮代謝作為植物體內(nèi)最基本的物質(zhì)和能量代謝過(guò)程

16、，不僅影響作物的生長(zhǎng)發(fā)育，還影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)的形成[12]。缺氮脅迫下，水稻根根系中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量呈顯著下降趨勢(shì)。與缺氮脅迫相比，在缺磷脅迫下，植株GDH、GS、GOGAT的活性均沒(méi)有顯著變化，而GDH的活性卻顯著增加。研究發(fā)現(xiàn)，短期缺磷脅迫使作物根系中GOGAT、GDH活性顯著增加，但隨缺磷脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，根部GS和GOGAT活性呈顯著下降趨勢(shì)[13]。這些指標(biāo)的變化呈現(xiàn)出隨著時(shí)間的延長(zhǎng)由上升到下降的趨勢(shì)。上述結(jié)果表明，缺氮脅迫制約著水稻氮代謝；在氮含量充足的環(huán)境下，短期缺磷脅迫可刺激水稻根部氮代謝顯著增強(qiáng)。相關(guān)文獻(xiàn)表明，NR和GS的活性隨水稻葉和莖稈氮轉(zhuǎn)運(yùn)量的增加而提高[14]。通過(guò)以

17、上文獻(xiàn)研究表明，在研究低磷對(duì)棉花葉片氮代謝酶活性的影響時(shí)，需要注意控制好變量，比如低磷脅迫時(shí)間、溫度等，需要注意觀(guān)察棉花氮代謝酶活性的變化趨勢(shì)。 近年來(lái)，有關(guān)水曲柳等植物在不同環(huán)境脅迫下，體內(nèi)的氮代謝物含量和氮代謝酶活性變化的研究報(bào)道較多，對(duì)于水稻等作物在缺氮等環(huán)境脅迫下體內(nèi)的酶活性變化亦有報(bào)道，但對(duì)于低磷脅迫對(duì)棉花尤其是棉花葉片氮代謝物及其關(guān)鍵酶影響的研究報(bào)道較少。因此，本實(shí)驗(yàn)利用磷肥定位試驗(yàn)形成不同梯度“基礎(chǔ)土壤速效磷含量”處理（造成低磷脅迫），基于兩個(gè)耐低磷性差異明顯的棉花品種在低磷脅迫條件下棉花主莖功能葉中主要氮代謝物含量和氮代謝酶活性的動(dòng)態(tài)變化，明確棉花主莖功能葉氮代謝響應(yīng)低磷脅迫

18、的關(guān)鍵物質(zhì)和關(guān)鍵酶，揭示其在不同基因型品種間的差異。 2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和測(cè)定方法 2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 盆栽試驗(yàn)于2015-2016年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所（河南安陽(yáng), 114°13′E，36°04′N(xiāo)，黃河流域黃淮棉區(qū)）進(jìn)行，供試土壤為沙壤土。盆栽試驗(yàn)所用盆缽直徑60 cm，高55 cm，每盆裝土35 kg，土壤自然風(fēng)干、過(guò)篩去雜后裝盆，用水沉實(shí)，每個(gè)處理種植33盆。兩年播種時(shí)間分別為4月17日和4月19日，采用直播。 基于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所老所部農(nóng)場(chǎng)試驗(yàn)田多年磷肥定位試驗(yàn)，以“在棉花生長(zhǎng)除基礎(chǔ)土壤速效磷量不同、其它環(huán)境條件和栽培措施都相同”為要求，選擇3個(gè)基礎(chǔ)土壤速效磷含量分別代

19、表土壤重度低磷（基礎(chǔ)土壤速效磷含量＜(3±0.5) mg/kg，P0）、輕度低磷（(8±0.5) mg/kg，P1）和適宜磷水平（(12±0.5) mg/kg，P2）的梯度作為本實(shí)驗(yàn)的磷處理，其它管理按高產(chǎn)栽培要求進(jìn)行。供試品種為中棉所79（CCRI 79，耐低磷性品種）和魯棉研28（LMY 28，低磷敏感性品種）。在棉花各主要生育時(shí)期（苗期、蕾期、初花期、花鈴期和吐絮期）選取生長(zhǎng)發(fā)育一致的棉株3棵，摘取其主莖功能葉。將棉花主莖功能葉洗凈擦干后，用干凈的剪刀去除葉片樣品的主脈和邊緣，一半用液氮速凍后放置-80℃冰箱保存供測(cè)定酶活性；另一半105℃殺青30分鐘，60℃烘干至恒重后，稱(chēng)重后保存供測(cè)

20、定物質(zhì)含量用。 2.2 儀器 離心機(jī)、震蕩機(jī)、分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀 2.3 測(cè)定方法 2.3.1 葉綠素含量測(cè)定 1. 樣品提取 分別稱(chēng)取葉片鮮樣0.1 g各3份于試管中。 2. 試劑 無(wú)水乙醇、丙酮 3. 方法（丙酮乙醇混合液法）[15] 將葉片鮮樣剪碎于試管中，各試管加入葉綠素提取液（無(wú)水乙醇：丙酮為1:1）24 ml。放置于黑暗處8 h（不超過(guò)12 h）?；靹蚝?，分別在470、663、645 nm處比色。 2.3.2 硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量的測(cè)定 1. 樣品提取 稱(chēng)取0.1g葉片干樣，加入10ml蒸餾水，100℃煮沸1h，冷卻后過(guò)濾，取上清液備用。 2. 試劑

21、 ①硝態(tài)氮NO3-測(cè)定：5%的水楊酸-硫酸溶液、8%NaOH溶液 ②銨態(tài)氮NH4+測(cè)定：NaOH、次氯酸、亞硝基鐵氰化鈉、苯酚 3. 方法 ①硝態(tài)氮NO3-測(cè)定（硝基水楊酸比色法[16]） 吸取0.1 ml提取液于試管，加入0.2 ml 5%的水楊酸-硫酸溶液，混勻后置室溫20 min，慢慢加入8% NaOH溶液4.75 ml，冷至室溫，410 nm比色。 ②銨態(tài)氮NH4+測(cè)定（靛酚藍(lán)比色法[16]） 吸取0.2 ml提取液于試管，加入1ml反應(yīng)液（氫氧化鈉2.625 g，1.5 ml次氯酸定容至50 ml），以及1 ml顯色液（亞硝基鐵氰化鈉12.5mg，苯酚3 g定容至50

22、ml），放置于37℃水浴顯色30 min，在625 nm下測(cè)定吸光值。 2.3.3 氨基酸和可溶性蛋白的測(cè)定 a. 氨基酸 1. 樣品提取 稱(chēng)取葉片干樣0.1 g放入10ml離心管中 ①加入5 ml 80%酒精后80℃水浴30 min，離心(4000×g) 5 min；得到上清液a倒入25 ml容量瓶中； ②將第①步中沉淀繼續(xù)加5 ml 80%酒精，80℃水浴15 min，離心5 min；得到上清液b； ③將第②步中沉淀繼續(xù)加5 ml 80%酒精，80℃水浴15min，離心5 min；得到上清液c； ④上清液a+b+c定容至25ml，測(cè)氨基酸 2. 試劑 醋酸緩沖液、乙

23、醇溶液、茚三酮顯色液 3. 方法（茚三酮顯色法[17]） 取上清液1 ml，加入醋酸緩沖液和茚三酮顯色液各1 ml混勻后于100℃沸水中加熱15 min。冷卻后，加入3 ml乙醇溶液稀釋?zhuān)靹蚝笤?70 nm下測(cè)定吸光度。 b.可溶性蛋白 1. 樣品提取 稱(chēng)取葉片0.6 g于研缽中，加7 ml提取緩沖液，冰浴研磨，轉(zhuǎn)移到離心管，4℃下15000 g離心20 min，上清液即為粗酶液。 2. 試劑 考馬斯亮藍(lán)G-250 (Coomassie brilliant blue G250)、牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液 3. 方法（考馬斯亮藍(lán)法[18]） 吸取0.1 ml酶液于試管中，加入0.9

24、 ml水，再加入5 ml考馬斯亮藍(lán)溶液，搖勻，靜置2 min，595 nm下比色。 2.3.4 谷氨酰胺合成酶GS活性測(cè)定 1. 樣品提取 稱(chēng)取葉片0.6 g于研缽中，加7 ml提取緩沖液，冰浴研磨，轉(zhuǎn)移到離心管，4℃下15000 g離心20 min，上清液即為粗酶液。 2. 試劑 Tris-HCl提取緩沖液、MgCl2?6H2O (80 mM)、谷氨酸鈉 (20 mM) 、半胱氨酸(20 mM) 、EDTA?Na2 (2 mM) 、鹽酸羥胺 (80 mM) 、TCA（三氯乙酸）、FeCl3?6H2O、HCl、ATP 3. 方法（顯色反應(yīng)[19]） 吸取1.6 ml反應(yīng)混合液（T

25、ris-HCl提取緩沖液、MgCl2?6H2O、谷氨酸鈉、半胱氨酸、EDTA?Na2、鹽酸羥胺），加入0.5 ml粗酶液和0.7 mlATP溶液，混勻，于37℃下保溫半小時(shí)，加入1 ml顯色劑（TCA、FeCl3?6H2O、HCl），搖勻放置片刻后，4000×g離心15 min，540 nm處測(cè)定吸光值。 2.3.5 GOT、GPT提取及活性測(cè)定 1. 樣品提取 將新鮮葉片剪碎，取鮮重0.3 g左右放入研缽，加Tris-HCL緩沖液（pH 7.2）4.0 ml，在冰浴中研磨，得到的勻漿用高速離心機(jī)20000×g離心20 min，上清液供測(cè)酶活度用。 2. 試劑 Tris-HCL緩沖

26、液（pH 7.2）、磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）、2,4二硝基苯肼溶液、NaOH溶液、丙酮酸鈉、α-酮戊二酸、DL-門(mén)冬氨酸、DL-丙氨酸 3. 方法 ①GOT活度測(cè)定[20] 吸取酶液0.1 ml于試管中，加入GOT底物液（DL-門(mén)冬氨酸、α-酮戊二酸）0.5 ml，然后置于37℃水浴1 h。加入2,4二硝基苯肼溶液0.5 ml終止反應(yīng)，再置于37℃水浴20 min。取出后加入5 ml的NaOH溶液，混勻，10 min后于500 nm處比色。 ②GPT活度測(cè)定[20] 吸取酶液0.2ml于試管中，加入GPT底物液（DL-丙氨酸、α-酮戊二酸）0.5ml，然后置于37℃水浴30min

27、。加入2,4二硝基苯肼溶液0.5ml終止反應(yīng)，再置于37℃水浴20min。取出后加入5ml的NaOH溶液，混勻，10min后于500nm處比色。 2.3.6 蛋白酶活性測(cè)定 1. 提取 稱(chēng)取鮮葉片0.3g于研缽中，加如Tris-HCl緩沖液，冰浴研磨，轉(zhuǎn)移到離心管，4轉(zhuǎn)下15000g離心20min，棄沉淀，將上清液定容至4ml。 2. 試劑 酪蛋白、乙酸鈉緩沖液（pH5.5） 3. 方法[21] 吸取酶提取液0.2 ml于試管中，加入0.4 ml的10 mg/ml酪蛋白，0.4 ml pH 5.5的200 mmol/L乙酸鈉緩沖液。將上述混合物于35℃中水浴1h，加1ml高氯酸

28、終止反應(yīng)。反應(yīng)后的混合物于8000×g離心15min，棄沉淀，上清液在400nm比色。 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 3.1土壤磷水平對(duì)棉花主莖功能葉中葉綠素含量的影響 由圖1可知，兩個(gè)品種棉花葉片中葉綠素含量由苗期到蕾期呈小幅度下降趨勢(shì)，由蕾期到初花期呈上升趨勢(shì)并達(dá)到最大值，由初花期到吐絮期呈下降趨勢(shì)。在不同磷處理下，兩個(gè)品種棉花葉片的葉綠素含量隨著磷水平的提高而提高。與P0處理相比，2015年中棉所79葉片中葉綠素含量在P1、P2處理下分別增加了10.7%和8.4%，魯棉研28葉片的葉綠素含量在P1、P2處理下分別增加了21.5%和19.1%；2016年中棉所79葉片中葉綠素含量在P1、P2處

29、理下分別增加了8.2%和9.0%，魯棉研28的葉綠素含量在P1、P2處理下分別增加了22.8 %和20.0%。相同磷水平下，年份間比較，2015年的中棉所79葉片中初花期的葉綠素含量較2016年增加了14.4%；而2015年間的魯棉研28葉片中初花期的葉綠素含量較2016年減少了18.2%。 圖1 土壤磷水平對(duì)棉花主莖功能葉中葉綠素含量的影響 Fig.1 Effect of soil P levels on total chlorophyll content in the functional leaf of cotton for CCRI 79 and LMY 28 in 2015

30、 and 2016 注：SS：苗期 Seedling stage; BS:蕾期；FS：初花期；FBS：花鈴期；BOS：吐絮期Boll-opening stage; CCRI 79：中棉所79； LYM 28：魯棉研28. 3.2土壤磷水平對(duì)棉花主莖功能葉中硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量的影響 由圖2 A可知，兩個(gè)品種棉花葉片中NO3-含量隨棉花生育期推進(jìn)呈大幅度下降趨勢(shì)。在不同磷處理下，兩個(gè)品種棉花葉片中NO3-含量隨著磷水平的降低而提高。與P0處理相比，2015年中棉所79葉片中NO3-含量在P1、P2處理下分別減少了15.1%和16.0%，魯棉研28的NO3-含量在P1、P2處理下分別減少了25

31、.4%和27.6%；2016年中棉所79葉片中NO3-含量在P1、P2處理下分別減少了16.7%和17.0%，魯棉研28的NO3-含量在P1、P2處理下分別減少了24.1%和33.0%。相同磷水平下，年份間差異不顯著。 由圖2 B可知，兩個(gè)品種棉花葉片中的NH4+含量由苗期到蕾期呈大幅度上升趨勢(shì)并達(dá)到最大值，由蕾期到吐絮期間的NH4+含量呈平緩減少趨勢(shì)。在不同的磷處理下，兩個(gè)品種棉花葉片中的NH4+含量隨著磷水平的降低而提高。與P0處理相比，2015年中棉所79葉片中NH4+含量在P1、P2處理下分別減少了6.7%和10.9%，魯棉研28葉片中的NH4+含量在P1、P2處理下分別減少了11.

32、0%和29.6%；2016年中棉所79葉片中NH4+含量在P1、P2處理下分別減少了6.9%和7.2%，魯棉研28葉片中的NH4+含量在P1、P2處理下分別減少了32.5%和41.7%。相同磷水平下，年份間差異不顯著。 圖2 土壤磷水平對(duì)棉花主莖功能葉中 NO3- (A) 和 NH4+ (B) 含量的影響 Fig. 2 Changes of NO3- (A) and NH4+ (B) content in the functional leaf of cotton for three soil P levels for CCRI 79 and LMY 28 in 2015 and 20

33、16. Data were the mean of three replicates ± SD. 注：SS：苗期 Seedling stage; BS:蕾期；FS：初花期；FBS：花鈴期；BOS：吐絮期Boll-opening stage; CCRI 79：中棉所79； LYM 28：魯棉研28. 3.3土壤磷水平對(duì)棉花主莖功能葉中游離氨基酸和可溶性蛋白含量的影響 由圖3A可知，兩個(gè)品種棉花葉片中游離氨基酸含量總體上隨棉花生育期推進(jìn)呈下降趨勢(shì)，值得注意的是，2016年的中棉所79葉片中的游離氨基酸含量由苗期到蕾期先呈大幅度增加，再隨生育期推進(jìn)呈下降趨勢(shì)。在不同磷處理下，除了2016年的中

34、棉所79以外，兩個(gè)品種棉花葉片的游離氨基酸含量均隨著磷水平的降低而提高，2016年的中棉所79葉片的游離氨基酸含量隨著磷水平的降低而先降低而后提高。與P0處理相比，2015年中棉所79葉片中游離氨基酸含量在P1、P2處理下分別減少了7.2%和8.7%，魯棉研28葉片的游離氨基酸含量在P1、P2處理下分別減少了19.5%和20.6%；2016年魯棉研28葉片中游離氨基酸含量在P1、P2處理下分別減少了20.0%和25.3%；而中棉所79的游離氨基酸含量則在P1處理下減少了0.7%，在P2處理下增加了6.9%。相同磷水平下，中棉所79葉片的游離氨基酸含量2015年比2016年減少了49.3%，魯棉

35、研28年份間差異不顯著。 圖3 土壤磷水平對(duì)棉花主莖功能葉中游離氨基酸（A）和可溶性蛋白（B）含量的影響 Fig.3 Changes of free amino acid (A)and soluble protein (B) content in the functional leaf of cotton for three soil P levels for CCRI 79 and LMY 28 in 2015 and 2016. Data were the mean of three replicates ± SD. 注：SS：苗期 Seedling stage; BS:蕾期；F

36、S：初花期；FBS：花鈴期；BOS：吐絮期Boll-opening stage; CCRI 79：中棉所79； LYM 28：魯棉研28. 由圖3 B可知，兩個(gè)品種棉花葉片中可溶性蛋白含量隨棉花生育期推進(jìn)變化不顯著，其中2015、2016年的中棉所79葉片中可溶性蛋白的含量由苗期到初花期呈上升趨勢(shì)，在初花期達(dá)到最大值，再由初花期到吐絮期持續(xù)下降；2015、2016年的魯棉研28葉片中可溶性蛋白的含量由苗期到蕾期先呈小幅度下降趨勢(shì)，再由蕾期到花鈴期持續(xù)上升并于花鈴期達(dá)到最大值，最后由花鈴期到吐絮期呈小幅度下降趨勢(shì)。在不同磷處理下，中棉所79葉片中可溶性蛋白含量對(duì)磷脅迫響應(yīng)不敏感，魯棉研28葉片

37、中可溶性蛋白含量隨磷處理水平的提高而顯著降低。與P1處理相比，2015年的中棉所79葉片中可溶性蛋白含量在P0、P2處理下分別減少了2.1%和5.7%，2016年的中棉所79葉片中可溶性蛋白含量在P0、P2處理下分別減少了0.3%和4.9%；與P0處理相比，2015年的魯棉研28葉片中可溶性蛋白含量在P1、P2處理下分別增加了12.0%和17.4%，2016年的魯棉研28葉片中可溶性蛋白含量在P1、P2處理下分別增加了6.4%和11.7%。相同磷水平下，年份間差異不顯著。 3.4土壤磷水平對(duì)棉花主莖功能葉氮代謝酶活性的影響 3.4.1 GS活性 圖4 土壤磷水平對(duì)棉花主莖功能葉中GS

38、活性的影響 Fig.4 Changes of GS activity in the functional leaf of cotton for three soil P levels for CCRI79 and LMY28 in 2015 and 2016. Data were the mean of three replicates ± SD. 注：SS：苗期 Seedling stage; BS:蕾期；FS：初花期；FBS：花鈴期；BOS：吐絮期Boll-opening stage; CCRI 79：中棉所79； LYM 28：魯棉研28. 由圖4可知，兩個(gè)品種棉花葉片中GS活性總

39、體上呈由苗期到蕾期下降，再由蕾期到吐絮期大幅度上升的趨勢(shì)，其中，中棉所79葉片中的GS活性由蕾期到花鈴期大幅度提高并達(dá)到最大值，再由花鈴期到吐絮期小幅度下降。在不同磷處理下，兩個(gè)品種棉花葉片的GS活性隨著磷水平的降低而提高。與P0處理相比，2015年中棉所79葉片中GS活性在P1、P2處理下分別減少了15.6%和16.5%，魯棉研28葉片的GS活性在P1、P2處理下分別減少了0.5%和7.7%；2016年中棉所79葉片中GS活性在P1、P2處理下分別減少了19.9%和26.6%，魯棉研28的GS活性在P1、P2處理下分別減少了14.9%和15.5%。相同磷水平下，2016年兩個(gè)品種葉片中的GS

40、活性高于2015年的。 3.4.2 GOT和GPT活性 由圖5 A可知，兩個(gè)品種棉花葉片中GOT活性總體上呈由苗期到蕾期小幅度下降，由蕾期到初花期小幅度上升，由初花期到花鈴期小幅度下降，由花鈴期到吐絮期小幅度上升的趨勢(shì)。在不同磷處理下，兩個(gè)品種棉花葉片的GOT活性隨著磷水平的降低而提高。與P0處理相比，2015年中棉所79葉片中GOT活性在P1、P2處理下分別減少了6.0%和16.0%，魯棉研28的GOT活性在P1、P2處理下分別減少了9.6%和23.1%；2016年中棉所79葉片中GOT活性在P1、P2處理下分別減少了7.0%和16.3%，魯棉研28的GOT活性在P1、P2處理下分別減少

41、了6.5%和18.8%。相同磷水平下，2016年兩個(gè)品種葉片中的GOT活性高于2015年的。 圖5 土壤磷水平對(duì)棉花主莖功能葉中 GOT (A) 和 GPT (B) 活性的影響 Fig.5 Changes of GOT (A) and GPT (B) activity in the functional leaf of cotton for three soil P levels for CCRI 79 and LMY 28 in 2015 and 2016. Data were the mean of three replicates ± SD. 注：SS：苗期 Seedling

42、stage; BS:蕾期；FS：初花期；FBS：花鈴期；BOS：吐絮期Boll-opening stage; CCRI 79：中棉所79； LYM 28：魯棉研28. 由圖5B可知，兩個(gè)品種棉花葉片中GPT活性總體上呈由苗期到蕾期小幅度下降，由蕾期到初花期小幅度上升，由初花期到花鈴期小幅度下降，由花鈴期到吐絮期小幅度上升的趨勢(shì)。在不同磷處理下，兩個(gè)品種棉花葉片的GPT活性隨著磷水平的降低而提高。與P0處理相比，2015年中棉所79葉片中GPT活性在P1、P2處理下分別減少了14.8%和29.9%，魯棉研28的GPT活性在P1、P2處理下分別減少了13.6%和26.9%；2016年中棉所79葉

43、片中GPT活性在P1、P2處理下分別減少了10.1%和23.3%，魯棉研28的GPT活性在P1、P2處理下分別減少了9.8%和24.0%。相同磷水平下，2016年兩個(gè)品種葉片中的GPT活性高于2015年的。 3.4.3蛋白酶活性 圖6 土壤磷水平對(duì)棉花主莖功能葉中蛋白酶活性的影響 Fig.6 Changes of protease activity in the functional leaf of cotton for three soil P levels for CCRI 79 and LMY 28 in 2015 and 2016. Data were the mean

44、of three replicates ± SD. 注：SS：苗期 Seedling stage; BS:蕾期；FS：初花期；FBS：花鈴期；BOS：吐絮期Boll-opening stage; CCRI 79：中棉所79； LYM 28：魯棉研28. 由圖6可知，兩個(gè)品種棉花葉片中蛋白酶活性總體上呈由苗期到蕾期下降，蕾期到花鈴期升高，由花鈴期到吐絮期小幅下降的趨勢(shì)。在不同磷處理下，兩個(gè)品種棉花葉片的蛋白酶活性隨著磷水平的降低而提高。與P0處理相比，2015年中棉所79葉片中蛋白酶活性在P1、P2處理下分別減少了10.2%和22.0%，魯棉研28的蛋白酶活性在P1、P2處理下分別減少了13

45、.5%和36.7%；2016年中棉所79葉片中蛋白酶活性在P1、P2處理下分別減少了15.4%和18.1%，魯棉研28的蛋白酶活性在P1、P2處理下分別減少了17.0%和31.0%。相同磷水平下，年份間差異不顯著。 4 討論 棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，在我國(guó)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占重要的地位[4]。磷元素在土壤中移動(dòng)性弱，易被固定。絕大多數(shù)的磷元素以非有效態(tài)累積于土壤中，即為土壤中的累積態(tài)磷，累積態(tài)磷大多被土壤膠體固定成作物難以利用的形態(tài)，只有約10%左右的累積態(tài)磷能轉(zhuǎn)化為有效磷[22]。氮代謝是植物的基本生理過(guò)程之一，在植物面對(duì)低磷脅迫中其相關(guān)酶起著重要的作用[7]。因此，研究低磷對(duì)棉花葉片氮代謝

46、的影響具有重要的意義。 在低磷脅迫環(huán)境下，植物葉片和根系的形態(tài)構(gòu)型和生理生化特征均會(huì)隨著植物的生長(zhǎng)適應(yīng)性而發(fā)生變化[23-28]。在本研究中，兩個(gè)品種的棉花葉片內(nèi)的氮代謝物含量和氮代謝酶活性總體上隨磷處理水平的降低而提高，且魯棉研28葉片的氮代謝物含量和氮代謝酶活性普遍比中棉所79高，這可能與品種本身的遺傳特性有關(guān)[29]。根據(jù)郭再華等人[29]的研究認(rèn)為，缺磷時(shí)，耐低磷型和低磷敏感型都能吸收一定量的來(lái)自難溶性磷源的磷，但是不同基因型之間存在差異。本試驗(yàn)研究認(rèn)為，魯棉研28對(duì)低磷脅迫反應(yīng)比較敏感，使得其氮素水平顯著提高；而中棉所79對(duì)低磷脅迫反應(yīng)不敏感，其氮素水平與魯棉研28相比較低，受到低

47、磷脅迫的影響較小。 葉綠素是植物葉綠體內(nèi)參與光合作用的重要色素，其功能是捕獲光能并驅(qū)動(dòng)電子轉(zhuǎn)移到反應(yīng)中心[30]。本試驗(yàn)中，P0處理下，魯棉研28葉片中葉綠素含量大幅度減少，表明低磷脅迫使葉綠素的含量降低。推測(cè)可能是由于魯棉研28中含有在低磷脅迫下誘導(dǎo)合成葉綠素含量的相關(guān)基因表達(dá)量降低[31]。農(nóng)業(yè)中氮的3個(gè)主要來(lái)源是尿素、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮。本試驗(yàn)中，P0處理下，兩個(gè)品種的硝態(tài)氮和銨態(tài)氮大幅度增加，推測(cè)是由于硝態(tài)氮和銨態(tài)氮能夠加快棉花中糖代謝進(jìn)程，有利于可溶性糖和還原性糖的累積，從而緩解低磷脅迫所造成的代謝失調(diào)[32]。游離氨基酸在細(xì)胞中以游離態(tài)形式存在，再需要時(shí)可被用于合成蛋白質(zhì)。在本試驗(yàn)中

48、，P0處理下，魯棉研28葉片中游離氨基酸含量大幅提高，中棉所79葉片中也出現(xiàn)了小幅度的提高，推測(cè)低磷脅迫下葉片中游離氨基酸提高的原因可能是低磷脅迫下，葉片中氮素水平提高，使得游離氨基酸含量增加[9, 33]。GS是植物氨同化所必需的酶，它控制著氮代謝。在本試驗(yàn)中，P0處理下，中棉所79和魯棉研28葉片中的GS活性都有所提高。于瑤[34]等人研究發(fā)現(xiàn)，GS活性變化受氮素影響較為明顯，由于低磷脅迫使得棉花葉片氮素水平提高，故而葉片中GS活性隨磷水平的下降呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)。GOT和GPT是植物體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)氨酶，GOT是天冬氨酸合成的關(guān)鍵酶，GPT在碳氮代謝協(xié)調(diào)方面起著重要的作用。葉片中GOT、GPT的

49、活性變化，反映了氨在葉片中的貯存狀態(tài)[35]。本試驗(yàn)中，P0處理下，兩個(gè)品種的棉花葉片中GOT和GPT的活性都出現(xiàn)不同程度的提高，這有可能是棉花葉片中氮素水平在低磷脅迫下提高了造成的?？扇苄缘鞍缀偷鞍酌笍V泛存在于植物莖葉中，在本試驗(yàn)中，P0處理下，兩個(gè)品種的蛋白酶活性均隨磷素水平的下降而提高；而可溶性蛋白的含量卻減少了。這可能是由于低磷脅迫使蛋白酶的活性增加，進(jìn)而使RNA轉(zhuǎn)錄和翻譯受到抑制，從而造成可溶性蛋白含量的減少[36]。 5 結(jié)論 磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，而多數(shù)土壤中有效磷含量都較低。在低磷脅迫環(huán)境下，植物葉片和根系的形態(tài)構(gòu)型和生理生化特征均會(huì)隨著植物的生長(zhǎng)適應(yīng)性而

50、發(fā)生變化。本試驗(yàn)研究表明，面對(duì)低磷脅迫時(shí)，不同品種的棉花由于其遺傳特性、對(duì)于磷元素的吸收效率不同等因素，常常表現(xiàn)出不同的耐低磷特性。與棉花對(duì)磷的利用效率相比，其對(duì)磷的吸收更為重要?？傮w上來(lái)說(shuō)，在低磷脅迫下，棉花葉片的氮素水平會(huì)出現(xiàn)不同程度的升高，導(dǎo)致其氮代謝物含量和氮代謝酶活性上升，這是棉花應(yīng)對(duì)低磷脅迫的一種保護(hù)性機(jī)制。植物在面對(duì)低磷脅迫時(shí)做出的反應(yīng)是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，本研究?jī)H闡明棉花對(duì)應(yīng)對(duì)低磷脅迫時(shí)其氮代謝的變化，關(guān)于更深入的討論，還需進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)。 參考文獻(xiàn) [1]唐偉, 玉永雄. 豆科植物低磷脅迫的適應(yīng)機(jī)制[J]. 草業(yè)科學(xué),2014,(08):1538-1548. [2]

51、丁廣大,陳水森,石磊, 等. 植物耐低磷脅迫的遺傳調(diào)控機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào),2013,(03):733-744. [3]宋世佳,孫紅春,張永江,等. 水培磷脅迫下不同基因型棉花苗期根系形態(tài)及葉片光合特性的差異[J]. 棉花學(xué)報(bào),2015,(03):223-231. [4]王剛. 土壤有效磷含量對(duì)棉花生長(zhǎng)發(fā)育的影響及其作用機(jī)理[D].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2016. [5]王剛,鄭蒼松,李鵬程, 等. 土壤有效磷含量對(duì)棉花幼苗干物質(zhì)積累和碳氮代謝的影響[J]. 棉花學(xué)報(bào),2016,(06):609-618. [6]宋為超. 初花后土壤堿解氮濃度對(duì)棉花生物量和氮素累積及纖維產(chǎn)

52、量品質(zhì)的影響[D].南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2013. [7]曹讓,梁宗鎖,吳潔云, 等. 干旱脅迫及復(fù)水對(duì)棉花幼苗根系氮代謝的影響[J]. 水土保持學(xué)報(bào),2012,(06):274-280. [8]孫海龍. 氮磷營(yíng)養(yǎng)對(duì)水曲柳苗木光合作用和氮同化的影響[D].東北林業(yè)大學(xué),2005. [9]楊博文,孫海龍,吳楚. 低磷脅迫對(duì)水曲柳幼苗光合速率與氮素同化的影響[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,(08):18-23 [10]Hui Yuan, Dong Liu. Signaling components involved in plant responses to phosphate starv

53、ation [J]. Journal of Integrative Plant Biology, 2008, 50(07):849-859 [11] Graciano C, Tambussi EA, Castán E, et al. Dry mass partitioning and nitrogen uptake by Eucalyptus grandis plants in response to localized or mixed application of phosphorus [J]. Plant and Soil, 2009, 319(1):175-184 [12]張國(guó)英.

54、 不同氮素水平處理對(duì)水稻碳氮代謝關(guān)鍵酶GS和GDH活性及表達(dá)的影響[D].福建農(nóng)林大學(xué), 2012. [13]羅鳳. 氮磷脅迫對(duì)水稻營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期氮代謝的影響分析[D].華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2011. [14]葉利庭,呂華軍,宋文靜, 等. 不同氮效率水稻生育后期氮代謝酶活性的變化特征[J]. 土壤學(xué)報(bào),2011,(01):132-140. [15]張憲政. 植物葉綠素含量測(cè)定——丙酮乙醇混合液法[J]. 遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué),1986,(03):26-28. [16]呂偉仙,葛瀅,吳建之, 等. 植物中硝態(tài)氮、氨態(tài)氮、總氮測(cè)定方法的比較研究[J]. 光譜學(xué)與光譜分析,2004,(02):204-206

55、. [17]陳忠云. α-氨基酸和茚三酮顯色反應(yīng)機(jī)理[J]. 教材通訊,1991,(02):36-37. [18]鄧麗莉,潘曉倩,生吉萍, 等. 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蘋(píng)果組織微量可溶性蛋白含量的條件優(yōu)化[J]. 食品科學(xué),2012,(24):185-189. [19]張銀山. 谷氨酰胺-tRNA合成酶的表達(dá)純化和活性測(cè)定[D].蘇州大學(xué),2015. [20]梁成剛. 水稻灌漿期高溫對(duì)籽粒氮代謝酶活性及蛋白質(zhì)含量的影響[D].四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2010. [21]萬(wàn)婧. 番木瓜中木瓜蛋白酶的提取工藝研究[D].海南大學(xué),2010. [22]羅佳,候銀瑩,程軍回, 等. 低磷脅迫下不同磷效

56、率基因型棉花的根系形態(tài)特征[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,(12):2280-2289. [23]葉思誠(chéng),譚曉風(fēng),袁軍. 植物低磷適應(yīng)機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究,2012,(02):128-133. [24]Mohammad Nuruzzaman, Hans Lambers, Michael D.A., et al. Distribution of carboxylates and acid phosphatase and depletion of different phosphorus fractions in the rhizosphere of a cereal and t

57、hree grain legumes [J]. Plant and Soil. 2006, 281(1):109-120 [25]Simone Radersma, Pauline F. Grierson. Phosphorus mobilization in agroforestry: Organic anions, phosphatase activity and phosphorus fractions in the rhizosphere [J]. Plant and Soil. 2004, 259(1):209-219 [26] Shane M.W., Vos M.D., Roo

58、ck S.D., et al. Effects of external phosphorus supply on internal phosphorus concentration and the initiation, growth and exudation of cluster roots in Hakea prostrata R.Br. [J]. Plant and Soil. 2003, 248(1):209-219 [27] Bates T.R., Lynch J.P.. Root hairs confer a competitive advantage under low p

59、hosphorus availability [J]. Plant and Soil. 2001, 236(2):243-250 [28] Jones D.L., Darrah P.R.. Role of root derived organic acids in the mobilization of nutrients from the rhizosphere [J]. Plant and Soil. 1994, 166(2):247-257 [29]郭再華,賀立源,徐才國(guó). 不同耐低磷水稻基因型秧苗對(duì)難溶性磷的吸收利用[J]. 作物學(xué)報(bào),2005,(10):1322-1327.

60、[30]王平榮,張帆濤,高家旭, 等. 高等植物葉綠素生物合成的研究進(jìn)展[J]. 西北植物學(xué)報(bào),2009,(03):629-636. [31]鄭金鳳,李成璞,董少鳴, 等. 低磷脅迫對(duì)小麥代換系葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量的影響及染色體效應(yīng)[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào),2010,(05):161-165. [32]邢素芝,張平,周毅, 等. 低磷脅迫下氮素形態(tài)對(duì)玉米苗期生物學(xué)性狀、花青苷含量及糖含量的影響[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào),2013,(02):254-258 [33]柴家榮. 不同施氮水平白肋煙游離氨基酸含量變化規(guī)律[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2008, (04): 250-254. [34]于瑤

61、,張漢堯,杜建偉. 高等植物谷氨酰胺合成酶基因的研究進(jìn)展[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, (04): 15-19. [35]陳曉飛,寧書(shū)菊,魏道智, 等. 氮素營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)水稻幼苗氮代謝的影響[J]. 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2008,(03):571-575. [36]鄭金鳳,白志英,李存東, 等. 低磷脅迫對(duì)小麥代換系可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響及染色體效應(yīng)[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào),2013,(01):27-31.  致謝 感謝江蘇師范大學(xué)四年來(lái)對(duì)我的辛苦培育，讓我在大學(xué)這四年學(xué)到很多東西，特別感謝生命科學(xué)學(xué)院為我提供了良好的學(xué)習(xí)環(huán)境。感謝領(lǐng)導(dǎo)、老師們四年來(lái)對(duì)我無(wú)微不至的關(guān)懷和指導(dǎo)，讓我在這四年中學(xué)到很多有用的知識(shí)。在此，我還要感謝在班里的同學(xué)和朋友，感謝你們?cè)谖矣龅嚼щy的時(shí)候幫助我，給我支持和鼓勵(lì)，感謝你們。 在這里要特別感謝我的論文指導(dǎo)老師劉敬然老師，在畢業(yè)設(shè)計(jì)中給予我悉心指導(dǎo)。從實(shí)驗(yàn)開(kāi)始到論文結(jié)束的過(guò)程中，老師總是不厭其煩的幫助我、鼓勵(lì)我，給我專(zhuān)業(yè)知識(shí)上的指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)技能上的幫助。在此謹(jǐn)向劉敬然老師致以誠(chéng)摯的謝意和崇高的敬意。謝謝老師！ 18