高中生物 專題1第二節(jié) 基因工程的基本操作程序課件2 新人教版選修3

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1、1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 廣東省高中生物聯(lián)賽選拔考試廣東省高中生物聯(lián)賽選拔考試 時間：本周五（時間：本周五（2 2月月2121日）晚上日）晚上7:007:00 地點：生化樓地點：生化樓502,403502,403 名額分配：高二級名額分配：高二級5555人，高一級人，高一級2525人人 有意向參加比賽的同學到科代處報名，并按指定時間參加有意向參加比賽的同學到科代處報名，并按指定時間參加選拔考試選拔考試四四個基本步驟：個基本步驟：1 1、目的、目的基因的獲取基因的獲取2 2、基因表達、基因表達載體的構建載體的構建3 3、將、將目的基因導入受體細胞目的基因導入受

2、體細胞4 4、目的、目的基因的檢測與鑒定基因的檢測與鑒定步驟一：步驟一：目的基因的獲取目的基因的獲取蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因，還有植物的抗?。固K云金芽孢桿菌的抗蟲基因，還有植物的抗病（抗病毒、抗細菌）基因、種子貯藏蛋白的基因，以及病毒、抗細菌）基因、種子貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。人的胰島素基因、干擾素基因等。目的基因指的是什么基因？目的基因指的是什么基因？1 1、控制控制所需所需性狀性狀的基因的基因2 2、編碼蛋白質編碼蛋白質的結構基因的結構基因補：原核細胞的基因結構補：原核細胞的基因結構非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼

3、區(qū)下游 與與RNARNA聚合酶結合位點聚合酶結合位點啟動子啟動子終止子終止子 RNA RNA聚合酶能夠識別調控序列中的結合位點，聚合酶能夠識別調控序列中的結合位點，并與其結合。并與其結合。 轉錄開始后，轉錄開始后，RNARNA聚合酶沿聚合酶沿DNADNA分子移動，并分子移動，并以以DNADNA分子的一條鏈為模板合成分子的一條鏈為模板合成RNARNA。 轉錄完畢后，轉錄完畢后，RNARNA鏈釋放出來，緊接著鏈釋放出來，緊接著RNARNA聚聚合酶也從合酶也從DNADNA模板鏈上脫落下來。模板鏈上脫落下來。補：真核細胞的基因結構補：真核細胞的基因結構編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與與R

4、NARNA聚合酶聚合酶結合位點結合位點內含子內含子 外顯子外顯子 能夠編碼蛋白質的序列叫做外顯子能夠編碼蛋白質的序列叫做外顯子 不能夠編碼蛋白質的序列叫做內不能夠編碼蛋白質的序列叫做內含子含子啟動子啟動子終止子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 內含子：內含子： 外顯子：外顯子： 目的基因的獲取方法：目的基因的獲取方法： 1 1、從基因文庫中獲取目的基因、從基因文庫中獲取目的基因 2 2、通過、通過PCRPCR擴增目的基因擴增目的基因 3 3、人工合成法、人工合成法步驟一：步驟一：目的基因的獲取目的基因的獲取1 1、從基因文庫中獲取目的基因、從基因文庫中獲取目的基因 基因文庫：將

5、含有某種生物不同基因的許多基因文庫：將含有某種生物不同基因的許多DNADNA片斷，導片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。同基因，稱為基因文庫。限制酶限制酶基因組基因組DNADNA許多許多DNADNA片段片段1)1)基因組文庫基因組文庫 是指將某種生物體的是指將某種生物體的全部基因組全部基因組DNADNA用限制用限制酶切割成一定長度范酶切割成一定長度范圍的圍的DNADNA片段，再與合片段，再與合適的載體在體外重組適的載體在體外重組后，導入受體菌的群后，導入受體菌的群體中儲存，這個群體體中儲存，這個群體就

6、稱為該生物基因組就稱為該生物基因組文庫。文庫。與運載體連接與運載體連接 導入導入受菌體群體受菌體群體其目的其目的是分離有用的目的基因和保存某種生是分離有用的目的基因和保存某種生物的全部基因。物的全部基因。2)cDNA2)cDNA文庫文庫 cDNAcDNA( (互補互補DNA)DNA)：是用某種生物發(fā)育的是用某種生物發(fā)育的某個時期的某個時期的mRNAmRNA經體經體外反轉錄后形成的互外反轉錄后形成的互補補DNADNA片段，與載體片段，與載體連接后儲存在一個受連接后儲存在一個受體菌群中，這個受體體菌群中，這個受體菌群就叫做這種生物菌群就叫做這種生物的的cDNAcDNA文庫文庫 某種生物某個時期的某

7、種生物某個時期的mRNAmRNA反轉錄反轉錄與運載體連接與運載體連接 導入導入受菌體群體受菌體群體單鏈單鏈DNADNADNADNA聚合酶聚合酶雙鏈雙鏈DNADNA如何從基因文庫中獲取目的基因？如何從基因文庫中獲取目的基因？P9P9 * *已知目的基因的已知目的基因的部分核苷酸序列部分核苷酸序列 將部分核苷酸序列擴增，用同位素標記將部分核苷酸序列擴增，用同位素標記 將基因文庫所有的菌落轉移至硝酸纖維膜上將基因文庫所有的菌落轉移至硝酸纖維膜上 處理消化細菌的蛋白質，使處理消化細菌的蛋白質，使DNADNA固定在膜上固定在膜上 進行雜交進行雜交 找出呈現(xiàn)陽性信號的菌落找出呈現(xiàn)陽性信號的菌落 從菌落中提

8、取目的基因從菌落中提取目的基因鳥槍法鳥槍法供體細胞中的供體細胞中的DNADNA許多許多DNADNA片段片段運載體運載體限制酶限制酶與載體連接與載體連接載入載入受體細胞受體細胞產生特定性狀產生特定性狀導入導入外源外源DNADNA擴增擴增目的基因目的基因分離分離( (直接分離法直接分離法) )直接直接分離基因分離基因1 1）反轉錄法：）反轉錄法： 以目的基因轉錄成以目的基因轉錄成的信使的信使RNARNA為模板，反轉錄為模板，反轉錄成互補的單鏈成互補的單鏈DNADNA，然后在，然后在酶的作用下合成雙鏈酶的作用下合成雙鏈DNADNA，從而獲得所需的基因。從而獲得所需的基因。目的基因的目的基因的mRNA

9、mRNA單鏈單鏈DNA(cDNA)DNA(cDNA)雙鏈雙鏈DNADNA( (即目的基因即目的基因) )反轉錄反轉錄合成合成間接合成基因間接合成基因2 2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 ： 根據(jù)根據(jù)已知蛋白質的已知蛋白質的氨基酸序列，推測出相氨基酸序列，推測出相應的信使應的信使RNARNA序列，然后序列，然后按照堿基互補配對原則，按照堿基互補配對原則，推測出它的結構基因的推測出它的結構基因的核苷酸序列，再通過化核苷酸序列，再通過化學方法，以單核苷酸為學方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。原料合成目的基因。蛋白質的氨基酸序列蛋白質的氨基酸序列mRNAmRNA

10、的核苷酸序列的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列推測推測推測推測目的基因目的基因化學合成化學合成上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點？上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點？操作簡便操作簡便廣泛使用廣泛使用工作量大，工作量大，盲目盲目，分離出來的有時并分離出來的有時并非一個基因非一個基因專一性強專一性強操作過程麻煩，操作過程麻煩，mRNAmRNA很不穩(wěn)定很不穩(wěn)定，要，要求的技術條件較高求的技術條件較高專一性強專一性強僅限于合成核苷酸僅限于合成核苷酸對較少的對較少的簡單基因簡單基因2 2、利用、利用PCRPCR技術擴增目的基因技術擴增目的基因DNADNA復制的條件復制的條件 必修二

11、必修二 P54P54DNADNA母鏈：母鏈：提供復制的模板提供復制的模板解旋酶：解旋酶：打開打開DNADNA雙鏈雙鏈4 4種脫氧核苷酸：種脫氧核苷酸：合成子鏈的原料合成子鏈的原料DNADNA聚合酶：聚合酶：催化合成催化合成DNADNA子鏈子鏈ATPATP：為復制過程提供能量為復制過程提供能量引物：引物：使使DNADNA聚合酶從引物的聚合酶從引物的3 3端開始連接端開始連接脫氧核苷酸脫氧核苷酸PCRPCR（多聚酶鏈式反應）（多聚酶鏈式反應） 原理：原理：DNADNA復制復制 條件：條件：DNADNA復制復制PCRPCRDNADNA母鏈母鏈解旋酶解旋酶4 4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸DNADNA聚合

12、酶聚合酶ATPATP引物引物DNADNA母鏈母鏈80-10080-1004 4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸熱穩(wěn)定的熱穩(wěn)定的DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）酶）ATPATP引物引物PCR PCR 循環(huán)第一步循環(huán)第一步 ：加熱變性加熱變性: :雙鏈雙鏈DNADNA解聚成為單鏈解聚成為單鏈PCR PCR 循環(huán)第二步循環(huán)第二步 ：引物與靶序列：引物與靶序列復性（退火）復性（退火）: :引物與模板引物與模板DNADNA單鏈單鏈的互補序列配對的互補序列配對結合結合靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物引物引物553 3555533553333TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶PCR PCR 循環(huán)第

13、三步循環(huán)第三步 ：引物延伸引物延伸: :合成新的合成新的DNADNA鏈鏈第第1 1個個 PCR PCR 循環(huán)完成后循環(huán)完成后 ：得到兩個拷貝的靶序列：得到兩個拷貝的靶序列循環(huán)循環(huán)次數(shù)次數(shù)DNADNA數(shù)量數(shù)量1 12 22 24 43 38 820201,048,5761,048,57630301,073,741,8241,073,741,8243030次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量小結：小結：PCRPCR多聚酶鏈式反應多聚酶鏈式反應體外快速擴增體外快速擴增DNADNA的技術的技術原理：原理：DNADNA復制復制條件：模板（待擴增基因的核苷酸序列）條件：模板（待擴增基因的核苷酸

14、序列） 酶：酶：TaqTaq酶（熱穩(wěn)定的酶（熱穩(wěn)定的DNADNA聚合酶）聚合酶） 原料：原料：4 4種游離的脫氧核苷酸種游離的脫氧核苷酸 引物、能量引物、能量過程：變性過程：變性- -退火退火- -延伸延伸結果：以結果：以2 2n n指數(shù)方式擴增指數(shù)方式擴增步驟二：基因表達載體的構建步驟二：基因表達載體的構建基因工程的基因工程的核心核心1 1、目的：、目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。用。它們各自的它們各自的作用是什么作用是什么? ?2 2、基因表達載

15、體的組成：、基因表達載體的組成：復制原點復制原點+ +啟動子啟動子+ +目的基因目的基因+ +終止子終止子+ +標記基因標記基因啟動子：啟動子：位于基因的首端的一段特殊的位于基因的首端的一段特殊的DNADNA片斷，片斷，它是它是RNARNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出驅動基因轉錄出mRNAmRNA，最終獲得蛋白質，最終獲得蛋白質終止子：終止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片斷，片斷，能終止能終止mRNAmRNA的轉錄的轉錄標記基因標記基因的作用是的作用是為了為了鑒別鑒別受體細胞中是否含有受體細胞中是否含有

16、目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來運載體運載體與與表達載體表達載體的區(qū)別：二者都有標記基的區(qū)別：二者都有標記基因和復制原點兩部分因和復制原點兩部分DNADNA片段。表達載體在載片段。表達載體在載體基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子三體基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結構部分結構用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又既用到限制酶切割載體，又用到用到DNADNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵啟動子、終止子啟動子、終止子對于目的基因表達必不

17、可少對于目的基因表達必不可少目的基因不能單獨進入受體細胞，目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表必需以表達載體的方式攜帶進去。達載體的方式攜帶進去。注意注意3 3、基因表達載體的構建過程、基因表達載體的構建過程質粒質粒DNADNA分子分子限制酶處理限制酶處理兩個切口兩個切口獲得目的基因獲得目的基因DNADNA連接酶連接酶重組重組DNADNA分子（重組質粒）分子（重組質粒）同一種同一種一個切口一個切口兩個黏性末端兩個黏性末端步驟三：將目的基因導入受體細胞步驟三：將目的基因導入受體細胞轉化轉化2.2.常用的受體細胞：常用的受體細胞： 有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農桿菌、酵母菌有大腸桿菌、枯草桿菌、土

18、壤農桿菌、酵母菌和動植物細胞等。和動植物細胞等。3.3.將目的基因導入受體細胞的原理將目的基因導入受體細胞的原理借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。1.1.轉化：轉化： 目的基因進入目的基因進入受體細胞受體細胞內，并且在受體細胞內，并且在受體細胞內維持內維持穩(wěn)定穩(wěn)定和和表達表達的過程的過程( (一）將目的基因導入植物細胞一）將目的基因導入植物細胞1. 1.方法：方法： 農桿菌轉化法農桿菌轉化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法2.2.原理：原理：TiTi質粒上的質粒上的T-DNAT-DNA可以轉移到受體細胞，并可以轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的整合到受體

19、細胞染色體的DNADNA上。上。（二）將目的基因導入動物細胞（二）將目的基因導入動物細胞方法：方法：顯微注射法顯微注射法目的基因表達載體提純目的基因表達載體提純 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 顯微注射顯微注射 受精卵受精卵 新性狀動物新性狀動物過程：過程：（三）將目的基因導入微生物細胞（三）將目的基因導入微生物細胞原核生物特點：繁殖快、單細胞、遺傳物質少原核生物特點：繁殖快、單細胞、遺傳物質少方法：方法： 用用CaCa2+2+處理細胞處理細胞 感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞 表表達載體與感受態(tài)細胞混合達載體與感受態(tài)細胞混合 感受態(tài)感受態(tài)細胞吸收細胞吸收DNADNA分子分子步驟四：目的基因的檢測與鑒定步驟

20、四：目的基因的檢測與鑒定檢查是否成功檢查是否成功1 1、檢測轉基因生物染色體的、檢測轉基因生物染色體的DNADNA上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因（1 1）方法方法: :DNADNA分子雜交分子雜交（2 2）過程）過程: :首先取出轉基因生物的基因組首先取出轉基因生物的基因組DNADNA用含目的基因的用含目的基因的DNADNA片段用放射性同位素等作標記片段用放射性同位素等作標記, ,以此做探針以此做探針使探針和轉基因生物的基因組雜交使探針和轉基因生物的基因組雜交, ,若顯示出雜交帶若顯示出雜交帶, ,表明染色體已插入染色體表明染色體已插入染色體DNADNA中中（一）檢測（一）檢測DNA

21、DNA分子雜交示意圖分子雜交示意圖 采用一定的技術手段，將兩種生物的采用一定的技術手段，將兩種生物的DNADNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補堿基合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。 （二）鑒定（個體生物學水平）（二）鑒定（個體生物學水平）2 2、檢測目的基因是否轉錄出了、檢測目的基因是否轉錄出了mRNAmRNA3 3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法方法: :方法方法: :抗原抗原- -抗體雜交抗體雜交用上述探針和轉基因生物的用上述探針和轉基因生物的mRNAmRNA雜交雜交, ,若出現(xiàn)雜若出現(xiàn)雜交帶交帶, ,表明目的基因轉錄出了表明目的基因轉錄出了mRNAmRNADNADNA分子雜交分子雜交過程過程: :