無菌醫(yī)療器械檢化驗(yàn)員培訓(xùn)微生物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)月 頁(yè)P(yáng)PT課件

微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則 1.進(jìn)實(shí)驗(yàn)室必須穿實(shí)驗(yàn)服，與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的物品切勿放在污染的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。 2.實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不準(zhǔn)吸煙、吃東西。 3.實(shí)驗(yàn)室用過的帶有微生物的吸管、玻片等應(yīng)分別放在指定的消毒筒內(nèi)。待消毒或廢棄物品必須放在指定的地點(diǎn)。 4.如有微生物污染桌面、地而、書和衣物等，應(yīng)立即報(bào)告老師，并用0.1新潔而滅溶液處理半小時(shí)，或其他方法處理后洗凈。 5.如有活菌碰到手上應(yīng)將手浸泡在0.1新潔而滅溶液510分鐘，然后用自來水沖洗。 6.實(shí)驗(yàn)過程中要愛護(hù)器材，嚴(yán)格按操作規(guī)程實(shí)驗(yàn)，并遵守?zé)o菌操作。 7.實(shí)驗(yàn)完畢，桌面應(yīng)整理清潔，不可將火柴梗、擦鏡紙投入水槽內(nèi)、用過的物品歸還原處（如接種環(huán)、染色液、擦鏡紙、香柏油、火柴等），實(shí)驗(yàn)室打掃干凈，關(guān)好水、電和窗。 8.實(shí)驗(yàn)材料不得攜帶出實(shí)驗(yàn)室以免造成污染。 9.用消毒液浸泡雙手，再用自來水沖洗干凈，脫去實(shí)驗(yàn)服，方得離開實(shí)驗(yàn)室。第1頁(yè)/共107頁(yè)無菌室要求 無菌室空氣凈化級(jí)別（潔凈環(huán)境內(nèi)單位體積空氣中含大于或等于某一粒徑的懸浮粒子的允許統(tǒng)計(jì)數(shù)）為10000級(jí)，超凈工作臺(tái)的凈化級(jí)別為100級(jí)。 無菌室整體布局應(yīng)合理，使用操作方便，各功能間分區(qū)明確。 應(yīng)安裝獨(dú)立的送排風(fēng)系統(tǒng)以控制無菌室氣流方向和壓力梯度以確保在無菌室時(shí)氣流由清潔區(qū)流向污染區(qū)，同時(shí)確保無菌室空氣只能通過高效過濾后經(jīng)專用排風(fēng)管道排出。 應(yīng)保證整體通風(fēng)換氣次數(shù)不少于每小時(shí)6次。 吊頂和地面等平整、防滑、無縫隙、易清潔、不滲水、耐化學(xué)品和消毒劑的腐蝕，常用的消毒劑有： 75% 酒精、過氧乙酸、新潔而滅等。 核心區(qū)吊頂下方應(yīng)安裝紫外燈殺菌，可采用懸吊式紫外線燈（紫外線燈管功率：30W2、輻射紫外線波長(zhǎng)：253.7nm、輻射度距燈管中心1米處：100W/cm2、消毒時(shí)間范圍：0-120分鐘）對(duì)室內(nèi)空氣進(jìn)行消毒，開關(guān)控制應(yīng)設(shè)在無菌室外走廊處。第2頁(yè)/共107頁(yè)微生物環(huán)境控制相關(guān)標(biāo)準(zhǔn) GB/T 16292:2010，醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))懸浮粒子測(cè)試方法 GB/T 16293:2010，醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))浮游菌測(cè)試方法 GB/T 16294:2010，醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))沉降菌測(cè)試方法 GB50073-2001潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范 ISO 14644-1:1999 潔凈室及相關(guān)受控環(huán)境 第1部分：空氣潔凈度等級(jí)劃分 ISO 14644-4:1999 潔凈室及相關(guān)受控環(huán)境 第4部分：設(shè)計(jì)、施工、運(yùn)行 ISO 14644-7:1999 潔凈室及相關(guān)受控環(huán)境 第7部分：分離的設(shè)備第3頁(yè)/共107頁(yè)微生物實(shí)驗(yàn)控制1：環(huán)境控制第4頁(yè)/共107頁(yè)無菌室環(huán)境控制設(shè)備微粒計(jì)數(shù)儀第5頁(yè)/共107頁(yè)無菌室環(huán)境控制設(shè)備浮游菌采樣儀第6頁(yè)/共107頁(yè)無菌室環(huán)境控制設(shè)備第7頁(yè)/共107頁(yè)無菌室環(huán)境控制設(shè)備第8頁(yè)/共107頁(yè)潔凈室沉降菌測(cè)試方法 1.測(cè)試時(shí)間 1.1對(duì)單向流，如100級(jí)凈化房間及層流工作臺(tái)，測(cè)試應(yīng)在凈化空調(diào)系統(tǒng)正常運(yùn)行不少于10min后開始。 1.2對(duì)非單向流，如10000級(jí)、100000級(jí)以上的凈化房間，測(cè)試應(yīng)在凈化空調(diào)系統(tǒng)正常運(yùn)行不少于30min后開始。 2.采樣方法 將已制備好的培養(yǎng)皿按要求放置，打開培養(yǎng)皿蓋，使培養(yǎng)基表面暴露0.5h，再將培養(yǎng)皿蓋蓋上后倒置。 2.2.培養(yǎng) 全部采樣結(jié)束后，將培養(yǎng)皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在3035培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，時(shí)間不少于48h。每批培養(yǎng)基應(yīng)有對(duì)照試驗(yàn)，檢驗(yàn)培養(yǎng)基本身是否污染?？擅颗x定3只培養(yǎng)皿作對(duì)照培養(yǎng)。第9頁(yè)/共107頁(yè)潔凈室沉降菌測(cè)試方法 3.菌落計(jì)數(shù) 用肉眼直接計(jì)數(shù)，標(biāo)記或在菌落計(jì)數(shù)器上點(diǎn)計(jì)，然后用510倍放大鏡檢查，有否遺漏。 若培養(yǎng)皿上有2個(gè)或2個(gè)以上的菌落重疊，可分辨時(shí)仍以2個(gè)或2個(gè)以上菌落計(jì)數(shù)。 4.注意事項(xiàng) 4.1測(cè)試用具要作滅菌處理，以確保測(cè)試的可靠性、正確性。 4.2采取一切措施防止人為對(duì)樣本的污染。 4.3對(duì)培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及其他參數(shù)作詳細(xì)的記錄。 4.4由于細(xì)菌種類繁多，差別甚大，計(jì)數(shù)時(shí)一般用透射光于培養(yǎng)皿背面或正面仔細(xì)觀察，不要漏計(jì)培養(yǎng)皿邊緣生長(zhǎng)的菌落，并須注意細(xì)菌菌落與培養(yǎng)基沉淀物的區(qū)別，必要時(shí)用顯微鏡鑒別。 4.5采樣前應(yīng)仔細(xì)檢查每個(gè)培養(yǎng)皿的質(zhì)量，如發(fā)現(xiàn)變質(zhì)、破損或污染的應(yīng)剔除。第10頁(yè)/共107頁(yè)潔凈室沉降菌測(cè)試方法 5.測(cè)試規(guī)則 5.1.測(cè)試狀態(tài) 5.1.1沉降菌測(cè)試前，被測(cè)試潔凈室（區(qū)）的溫濕度須達(dá)到規(guī)定的要求，靜壓差、換氣次數(shù)、空氣流速必須控制在規(guī)定值內(nèi)。 5.1.2沉降菌測(cè)試前，被測(cè)試潔凈室（區(qū)）已經(jīng)過消毒。 5.1.3測(cè)試狀態(tài)有靜態(tài)和動(dòng)態(tài)兩種，測(cè)試狀態(tài)的選擇必須符合生產(chǎn)的要求，并在報(bào)告中注明測(cè)試狀態(tài)。 5.2.測(cè)試人員 5.2.1測(cè)試人員必須穿戴符合環(huán)境潔凈度級(jí)別的工作服。 5.2.2靜態(tài)測(cè)試時(shí)，室內(nèi)測(cè)試人員不得多于二人。第11頁(yè)/共107頁(yè)最少采樣點(diǎn)數(shù)目面積10102020404010010020020040040010001000200020001002348164080160400800潔凈度級(jí)別100002224102040100200100000222236133263注：表中的面積，對(duì)于單向流潔凈室.指的是送風(fēng)面積；對(duì)非單向流潔凈室，指的是房間面積第12頁(yè)/共107頁(yè)同時(shí)滿足最少平皿數(shù)潔凈度級(jí)別100級(jí)10000級(jí)100OOO級(jí)所需90mm培養(yǎng)皿數(shù)（以沉降0.5h計(jì)）1422第13頁(yè)/共107頁(yè)采樣點(diǎn)的布置 采樣點(diǎn)的位置可以同懸浮粒子測(cè)試點(diǎn)。 a）工作區(qū)采樣點(diǎn)的位置離地0.8m1.5m左右（略高于工作面）。 b）可在關(guān)鍵設(shè)備或關(guān)鍵工作活動(dòng)范圍處增加采樣點(diǎn)。 采樣點(diǎn)位置的詳細(xì)規(guī)則見附錄B（標(biāo)準(zhǔn)的附錄）。第14頁(yè)/共107頁(yè)采樣點(diǎn)布置第15頁(yè)/共107頁(yè)潔凈度級(jí)別沉降菌浮游菌塵粒的最大允許數(shù)/m3個(gè)/（90mm）0.5h）活微生物數(shù)/m30.5m5m10015 3500100003100 350000 2000環(huán)境檢測(cè)參照標(biāo)準(zhǔn)第16頁(yè)/共107頁(yè)100微生物實(shí)驗(yàn)室管理超凈工作臺(tái)級(jí)第17頁(yè)/共107頁(yè)微生物實(shí)驗(yàn)室管理嚴(yán)格區(qū)分污染區(qū)及清潔區(qū)第18頁(yè)/共107頁(yè)微生物實(shí)驗(yàn)控制2：人員管理第19頁(yè)/共107頁(yè)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn) GB 15979-2002 一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) GB 15980-1995 一次性使用醫(yī)療用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) GB 15981-1995消毒與滅菌效果的評(píng)價(jià)方法和標(biāo)準(zhǔn)第20頁(yè)/共107頁(yè)微生物實(shí)驗(yàn)控制3：滅菌所有器具應(yīng)采用可靠方法滅菌 置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)12130 min或 置電熱干燥箱內(nèi)1802 h。第21頁(yè)/共107頁(yè)濕熱滅菌儀器圓型壓力蒸汽滅菌器全自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器第22頁(yè)/共107頁(yè)干熱滅菌儀器烤箱烤箱電熱鼓風(fēng)干燥箱第23頁(yè)/共107頁(yè)濕熱滅菌控制相關(guān)標(biāo)準(zhǔn) GB 18281.3-2000醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌 生物指示物 第3部分:濕熱滅菌用生物指示物 ISO 11138-3-2006醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌.生物指示物.第3部分:濕熱滅菌用生物指示劑第24頁(yè)/共107頁(yè)微生物實(shí)驗(yàn)控制4：培養(yǎng)基質(zhì)量控制 靈敏度檢查 （中國(guó)藥典2010） 無菌檢查（ISO11737.2:2009或GBT19973.2-2005）第25頁(yè)/共107頁(yè)微生物實(shí)驗(yàn)控制5：無菌操作 定義：是指在執(zhí)行實(shí)驗(yàn)過程中，防止一切微生物侵入機(jī)體和保持無菌物品及無菌區(qū)域不被污染的操作技術(shù)和管理方法。無菌操作技術(shù)是微生物實(shí)驗(yàn)的基本技術(shù)，是保證微生物實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確和順利完成的重要環(huán)節(jié)。 無菌操作技術(shù)主要包括兩方面：創(chuàng)造無菌的培養(yǎng)環(huán)境及在操作和培養(yǎng)過程中防止一切其它微生物的侵入。創(chuàng)造無菌的培養(yǎng)環(huán)境包括提供密閉的培養(yǎng)容器、培養(yǎng)容器的滅菌、培養(yǎng)基的滅菌等；防止一切其它微生物的侵入的措施包括紫外線殺菌、甲醛熏蒸、超凈臺(tái)的消毒與檢測(cè)、操作工具、器皿滅菌、操作方法等。第26頁(yè)/共107頁(yè)微生物實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備微生物實(shí)驗(yàn)控制1：環(huán)境控制微生物實(shí)驗(yàn)控制2：人員管理微生物實(shí)驗(yàn)控制3：滅菌微生物實(shí)驗(yàn)控制4：培養(yǎng)基質(zhì)量控制微生物實(shí)驗(yàn)控制5：無菌操作第27頁(yè)/共107頁(yè)實(shí)驗(yàn)一：微生物基本操作瓊脂平板接種法瓊脂斜面接種法半固體接種法肉湯培養(yǎng)基接種法第28頁(yè)/共107頁(yè)瓊脂平板接種法 細(xì)菌在自然界及人體中分布廣，種類多，為了了解菌譜，須先將各種細(xì)菌分離，獲得純菌培養(yǎng)物后才能進(jìn)一步作細(xì)菌的鑒定。瓊脂平板培養(yǎng)基因面積大，接種后可達(dá)到分離的目的，常稱分離培養(yǎng)法。平板接種方法有多種。以下介紹平行劃線法及分區(qū)劃線法。第29頁(yè)/共107頁(yè)瓊脂平板接種法（分離培養(yǎng)法）平行劃線法分區(qū)劃線法第30頁(yè)/共107頁(yè)瓊脂平板接種法（分離培養(yǎng)法）第31頁(yè)/共107頁(yè)單個(gè)菌落第32頁(yè)/共107頁(yè)單個(gè)菌落第33頁(yè)/共107頁(yè)以平板劃線為例與無菌操作有關(guān)的環(huán)節(jié)1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.點(diǎn)亮酒精燈并與之保持適當(dāng)?shù)木嚯x；如何從無菌包內(nèi)取出無菌平皿；培養(yǎng)基使用前如何確定它是否無菌；如何向平皿內(nèi)傾注無菌培養(yǎng)基；平皿打開時(shí)間的控制；如何灼燒接種環(huán)；如何挑取菌落避免污染；如何在凝固的培養(yǎng)基內(nèi)劃線；如何在整個(gè)操作期間避免跨越無菌區(qū)；培養(yǎng)觀察期間如何避免污染。第34頁(yè)/共107頁(yè)瓊脂斜面接種法 目的：多用于純種細(xì)菌的增菌和保存菌種 方法：用滅菌接種環(huán)取細(xì)菌培養(yǎng)物少許。拔去瓊脂斜面培養(yǎng)基塞，管口經(jīng)火焰上滅菌，將沾有細(xì)菌的接種環(huán)伸入管內(nèi)，自下而上在瓊脂上蜿蜒劃線；接種后，管口在火焰上滅菌，塞回塞，接種環(huán)滅菌：在試管口處做好標(biāo)記，置37培養(yǎng)1824小時(shí)第35頁(yè)/共107頁(yè)大腸桿菌斜面金黃色葡萄球菌斜面第36頁(yè)/共107頁(yè)肉湯接種法 目的：用于增菌。 方法：用滅菌接種環(huán)取細(xì)菌培養(yǎng)物少許；以無菌操作將沾有細(xì)菌的接種環(huán)伸入肉湯中，將環(huán)上細(xì)菌輕輕研磨于接近液面的管壁上，然后將試管稍傾斜，使肉湯碰及細(xì)菌即可；接種后管口滅菌，塞回塞，接種環(huán)滅菌，并做好標(biāo)記，置37培養(yǎng)18-24小時(shí)第37頁(yè)/共107頁(yè)半固體接種法（穿刺接種法） 目的：增菌和保存菌種；觀察細(xì)菌有無動(dòng)力。 方法：用接種針，將取有細(xì)菌的接種針自培養(yǎng)基中央刺入（不要接觸管底），沿原穿刺線撥出，注意在刺入與拔出時(shí)不可晃動(dòng)接種針；接種后做好標(biāo)記。置37培養(yǎng)18-24小時(shí)第38頁(yè)/共107頁(yè)半固體瓊脂培養(yǎng)基（0.5%）第39頁(yè)/共107頁(yè)實(shí)驗(yàn)二：菌懸液制備（使用麥?zhǔn)媳葷峁埽?麥?zhǔn)媳葷峁埽菏荕cFarland發(fā)明的一種用于微生物比濁的不同濁度的標(biāo)準(zhǔn)濁度管。具體的配制方法是根據(jù)硫酸和氯化鋇的比例來定的，有表可查，這樣不同比例生成的硫酸鋇沉淀的濃度不同，且都有定值。第40頁(yè)/共107頁(yè)麥?zhǔn)媳葷峁艿呐浔裙?號(hào)(McFarland)0.5123450.25%BaCl2（ml）1%H2SO4(ml)0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.09.8 9.6 9.2 8.8 8.4 8.0細(xì)菌的近似濃度(108/ml)13691215第41頁(yè)/共107頁(yè)123456786108 6107 6106 6105 6104 6103 6102 6101麥 氏 2 號(hào) 管 稀 釋 梯 度 表（cfu/ml）第42頁(yè)/共107頁(yè)實(shí)驗(yàn)二：菌懸液制備（使用分光光度儀 ）分光光度儀第43頁(yè)/共107頁(yè)菌懸液制備的保存 菌懸液制備：菌懸液制備后應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用，若保存在28的菌懸液可以在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉也可制成穩(wěn)定的孢子懸液保存在28，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)替代對(duì)應(yīng)量的新鮮孢子懸液使用。第44頁(yè)/共107頁(yè)培養(yǎng)基質(zhì)量控制：靈敏度檢查靈敏度檢查所需的六種菌：金黃色葡萄球菌 CMCC (B)26003 ATCC 6538銅綠假單胞菌 CMCC (B)10104 ATCC 9027枯草芽孢桿菌CMCC (B)63501 ATCC 6633生孢梭菌CMCC(B)64941 ATCC 11437白色念珠菌CMCC(F)98001 ATCC 10231黑曲霉CMCC(F)98003 ATCC 16404 根據(jù)培養(yǎng)基的功能選擇靈敏度實(shí)驗(yàn)所需菌種第45頁(yè)/共107頁(yè)明確規(guī)定：培養(yǎng)基靈敏度、微生物限度檢查法檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。培養(yǎng)基質(zhì)量控制：靈敏度檢查 中國(guó)藥典2010年版第46頁(yè)/共107頁(yè) 中國(guó)藥典2010年版在新增的“藥品微生物實(shí)驗(yàn)室規(guī)范指導(dǎo)原則”中對(duì)菌種有了較為明確的規(guī)定： 允許使用標(biāo)準(zhǔn)菌株和商業(yè)派生菌株 標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)按保藏機(jī)構(gòu)提供的說明進(jìn)行復(fù)活 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株應(yīng)進(jìn)行純度和特性確認(rèn) 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株建議采用低溫冷凍干燥、液氮貯存或超低溫冷凍保藏的方法 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株可用于制備每月或每周一次轉(zhuǎn)種的工作菌株 冷凍菌株解凍后不得重新冷凍和再次使用 工作菌株不可替代標(biāo)準(zhǔn)菌株，商業(yè)派生菌株僅可用作工作菌株培養(yǎng)基質(zhì)量控制：靈敏度檢查第47頁(yè)/共107頁(yè)菌株傳代基本概念 標(biāo)準(zhǔn)菌株：由國(guó)內(nèi)或國(guó)際菌種保藏機(jī)構(gòu)保藏的，遺傳學(xué)特性得到確認(rèn)和保證并可追溯的菌株。（0代） 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株：由標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)一次傳代得到的培養(yǎng)物。（1代） 商業(yè)派生菌株：由供應(yīng)商提供的所有特性與標(biāo)準(zhǔn)菌株等效的菌株。（2代） 工作菌株：由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株經(jīng)傳代得到的培養(yǎng)物。（2代） 代：將活的微生物接種到新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并希望獲取新的微生物培養(yǎng)物。這種操作方式，新培養(yǎng)物對(duì)接種培養(yǎng)物而言就稱為一代。第48頁(yè)/共107頁(yè)工作菌種第3代工作菌種第3代工作菌種第4代工作菌液工作菌液第5代 第5代工作菌種第4代工作菌液工作菌液第5代 第5代制備工作菌種進(jìn)行菌種保藏的模式圖采購(gòu)的第2代超低溫冷凍標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌種第49頁(yè)/共107頁(yè)各類菌種保藏條件及時(shí)間菌種細(xì)菌酵母菌絲狀真菌培 養(yǎng) 基一般多用于營(yíng)養(yǎng)瓊脂或根據(jù)菌種規(guī)定選用培養(yǎng)基一般用麥芽汁瓊脂或麥芽汁酵母膏瓊脂一般用PDA瓊脂、蔡氏瓊脂或麥芽汁瓊脂等保存溫度464646傳 種 時(shí) 間芽孢桿菌36個(gè)月，其它細(xì)菌每個(gè)月一般46個(gè)月每4個(gè)月移植一次（每2個(gè)月移植一次）第50頁(yè)/共107頁(yè)菌 種 保 管菌種保管應(yīng)有專人負(fù)責(zé)，保存與加鎖的冰箱中或特制的白鐵箱中加鎖置陰暗處，確保菌種安全。因工作變動(dòng)時(shí)，必須做好交接工作。菌種應(yīng)有詳細(xì)登記本，包括名稱、分離日期、鑒定日期、鑒定者、主要鑒定性能，并注意記錄使用、轉(zhuǎn)移及銷毀情況和原因。各種菌種應(yīng)按規(guī)定時(shí)間定期移種。一般每移種3次后作一次全面鑒定。注意菌種有無污染和變異，如發(fā)現(xiàn)污染和變異時(shí)，應(yīng)及時(shí)更換。購(gòu)置菌種，應(yīng)有介紹信。全部保存菌種應(yīng)具備清單，并定期向部門負(fù)責(zé)人報(bào)告。第51頁(yè)/共107頁(yè)FTM 的 靈 敏 度 檢 查培養(yǎng)天數(shù)1 2 3 4 5培養(yǎng)基FTM(12ml)標(biāo) 準(zhǔn) 菌 種 (10-100cfu/ml)金黃色葡萄球菌緑膿桿菌枯草芽孢桿菌生胞梭菌空白對(duì)照3035培養(yǎng)管1管2管3管4管5管6管7管8管9第52頁(yè)/共107頁(yè)培養(yǎng)基質(zhì)量控制：靈敏度檢查接種金黃色葡萄球菌、緑膿桿菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)1824h；用0.9%無菌氯化鈉溶液制成10-100cfu/ml菌液備用。接種生胞梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)1824h；用0.9%無菌氯化鈉溶液制成10-100cfu/ml菌液備用。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，2328培養(yǎng)2448h；用0.9%無菌氯化鈉溶液制成10-100cfu/ml菌液備用。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，2328培養(yǎng)57d,加35ml0.9%無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫。然后，吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成10-100cfu/ml孢子懸液備用。第53頁(yè)/共107頁(yè)菌種菌株傳代次數(shù)培養(yǎng)基接種結(jié)果判斷培養(yǎng)條件金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉；制備成活菌數(shù)100cfu的菌懸液備用不得超過5代每種菌接種至2管相應(yīng)的培養(yǎng)基，另取一支不接種作空白對(duì)照，按規(guī)定溫度時(shí)間培養(yǎng)?？瞻讓?duì)照管應(yīng)無菌生長(zhǎng)，每種菌接種后的2管培養(yǎng)基管均生長(zhǎng)良好，該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯（或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基）3035培養(yǎng)1824小時(shí)；生孢梭菌接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中3035培養(yǎng)3天；白色念珠菌、黑曲霉接種至改良馬丁培養(yǎng)基中2328培養(yǎng)5天培養(yǎng)基質(zhì)量控制：靈敏度檢查第54頁(yè)/共107頁(yè)培養(yǎng)基質(zhì)量控制：無菌檢查每批滅菌的培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于5支(瓶)，培養(yǎng)14天，應(yīng)無菌生長(zhǎng)。第55頁(yè)/共107頁(yè)實(shí)驗(yàn)三：無菌實(shí)驗(yàn)第56頁(yè)/共107頁(yè)無菌實(shí)驗(yàn)預(yù)防假陽(yáng)性措施 1在一個(gè)專門準(zhǔn)備、環(huán)境控制的房間內(nèi)的層流罩的環(huán)境中進(jìn)行測(cè)試 2在整個(gè)測(cè)試過程中使用無菌技術(shù) 3用避免污染的方法把測(cè)試器皿、培養(yǎng)基和測(cè)試物品引入測(cè)試區(qū) 4測(cè)試產(chǎn)品表面的細(xì)菌污染，在引導(dǎo)測(cè)試物品進(jìn)入測(cè)試區(qū)之前，先對(duì)產(chǎn)品的外包裝進(jìn)行消毒。 5對(duì)測(cè)試中使用的設(shè)備、材料和產(chǎn)品進(jìn)行滅菌 6簡(jiǎn)化進(jìn)行測(cè)試必須的操作 7盡量避免懸浮微粒的產(chǎn)生 8環(huán)境時(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)（沉降菌檢測(cè)）第57頁(yè)/共107頁(yè)無菌實(shí)驗(yàn)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn) GBT19973.2-2005-醫(yī)用器材的滅菌 微生物學(xué)方法 第二部分：確認(rèn)滅菌過程的無菌試驗(yàn) ISO 11737-2 2009-醫(yī)用器材的滅菌 微生物學(xué)方法 第二部分：確認(rèn)滅菌過程的無菌試驗(yàn)第58頁(yè)/共107頁(yè)無菌實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)條件 不論哪種無菌試驗(yàn)方法：FTM32.52.5，不少于14天；SCDB22.52.5，不少于14天； 改良馬丁23-28，不少于14天。 如果14以內(nèi)觀察到陽(yáng)性結(jié)果，不必繼續(xù)培養(yǎng)。第59頁(yè)/共107頁(yè)無菌實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照 應(yīng)根據(jù)供試品特性選擇陽(yáng)性對(duì)照菌：無抑菌作用及抗革蘭陽(yáng)性菌為主的供試品以金黃色葡萄球菌為對(duì)照菌；抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對(duì)照菌；抗厭氧菌的供試品，以生孢梭菌為對(duì)照菌；抗霉菌的供試品，以白色念珠菌為對(duì)照菌。加菌量小于l00cfu，供試品用量同供試品無菌實(shí)驗(yàn)時(shí)每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽(yáng)性對(duì)照管培養(yǎng)4872小時(shí)應(yīng)生長(zhǎng)良好第60頁(yè)/共107頁(yè)陰性對(duì)照 陰性對(duì)照：陰性對(duì)照供試品無菌實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋同法操作作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。第61頁(yè)/共107頁(yè)無菌實(shí)驗(yàn)：結(jié)果判斷 肉湯培養(yǎng)基有菌生長(zhǎng)的常見三種形式： 混濁生長(zhǎng)：液體變混濁。 菌膜：液體澄清，表面有一薄層菌膜。 沉淀生長(zhǎng)：液體澄清，管底有沉淀物第62頁(yè)/共107頁(yè)混濁生長(zhǎng)：液體變混濁第63頁(yè)/共107頁(yè)肉湯培養(yǎng)基有菌生長(zhǎng)的常見形式第64頁(yè)/共107頁(yè)無菌實(shí)驗(yàn)：結(jié)果判斷1.陽(yáng)性對(duì)照管應(yīng)生長(zhǎng)良好，陰性對(duì)照管應(yīng)無菌生長(zhǎng)2.培養(yǎng)期間逐日觀察并記錄是否有菌生長(zhǎng)，如培養(yǎng)14天后，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，但不能確定是否有微生物生長(zhǎng)，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基或劃線接種于斜面培養(yǎng)基上，細(xì)菌培養(yǎng)兩天，霉菌培養(yǎng)三天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁或斜面是否有菌生長(zhǎng)；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。第65頁(yè)/共107頁(yè)實(shí)驗(yàn)四 釋出物檢查Bacteriostasis /Fungistatic Test第66頁(yè)/共107頁(yè)無菌實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：釋出物檢查 目的：對(duì)未知或可疑的供試品，在進(jìn)行無菌試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)，以確認(rèn)供試品在該試驗(yàn)條件下無抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不計(jì)。第67頁(yè)/共107頁(yè)無菌實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：釋出物檢查 取滅菌產(chǎn)品以無菌操作轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中,30-35培養(yǎng)24hrs ；注意：使用與實(shí)際無菌實(shí)驗(yàn)同種等量的培養(yǎng)基 接種每毫升濃度小于100cfu的菌種稀釋液在無菌培養(yǎng)基內(nèi)，一式兩份，其中一份加入無菌試樣，另一份作為陽(yáng)性對(duì)照，并在合適的溫度培養(yǎng)不超過5天。按表1所列菌種重復(fù)以上步驟。第68頁(yè)/共107頁(yè)實(shí)驗(yàn)組100cfu菌種對(duì)照組無菌樣品釋出物檢查無菌樣品在合適的溫度培養(yǎng)不超過5天。選擇合適的微生物，重復(fù)以上步驟。第69頁(yè)/共107頁(yè)釋出物檢查 解釋：通過與陽(yáng)性對(duì)照對(duì)比，如果在培養(yǎng)容器內(nèi)看不到微生物生長(zhǎng)，則說明使用的樣品能抑止細(xì)菌或霉菌的生長(zhǎng)。可以考慮使用無菌中和劑，如吐溫80、卵磷脂、偶氮植物凝血素、-內(nèi)酰胺酶。如果中和劑無效，增加培養(yǎng)基的量。盡量使用能使試驗(yàn)微生物生長(zhǎng)的最小的培養(yǎng)基的量。第70頁(yè)/共107頁(yè)大豆酪蛋白消化物培養(yǎng)基(SCDM)菌種培養(yǎng)溫度培養(yǎng)條件培養(yǎng)時(shí)間枯草芽孢桿菌ATCC 6633白色念珠菌ATCC 1023122.52.5 22.52.5 需氧需氧3天3-5天釋出物檢查常用菌種第71頁(yè)/共107頁(yè)實(shí)驗(yàn)四 初始污染菌Bioburden Test第72頁(yè)/共107頁(yè)定 義 生物負(fù)載 ：一件產(chǎn)品和/ 或包裝上存活的微生物總數(shù)。 生物負(fù)載估計(jì)值 ：通過對(duì)活菌計(jì)數(shù)或滅菌前活菌計(jì)數(shù)加上一個(gè)回收效率補(bǔ)償系數(shù)，得出的組成生物負(fù)載的微生物數(shù)值 。第73頁(yè)/共107頁(yè)初始污染菌相關(guān)標(biāo)準(zhǔn) GBT19973.1-2005-醫(yī)用器材的滅菌 微生物學(xué)方法 第一部分產(chǎn)品上微生物總數(shù)的估計(jì) ISO-11737-1:2006 GBT19973.1-2005-醫(yī)用器材的滅菌 微生物學(xué)方法 第一部分產(chǎn)品上微生物總數(shù)的估計(jì)第74頁(yè)/共107頁(yè)樣品份額取樣原則 1 定義：樣品份額 (SIP) sample item portion，即從某一保健產(chǎn)品單元上取出的用于試驗(yàn)的部分。 2取樣注意事項(xiàng) 2.1若可操作，試驗(yàn)應(yīng)使用整個(gè)產(chǎn)品單元。但這往往被認(rèn)為是不可行的，產(chǎn)品單元上的樣品份額宜在實(shí)驗(yàn)室易于操作的前提下盡可能大。 2.2如果所用的樣品份額( (SIP) 小于一個(gè)完整的產(chǎn)品單元，則應(yīng)選擇代表產(chǎn)品單元的具有微生物的部分。如果已驗(yàn)證微生物在產(chǎn)品單元上是均勻分布的，應(yīng)從產(chǎn)品單元上任一部位選擇樣品份額。在缺少這些驗(yàn)證的情況下，應(yīng)從產(chǎn)品單元上隨機(jī)選擇幾個(gè)部分作為樣品份額。 2.3樣品份額本身應(yīng)對(duì)產(chǎn)品單元內(nèi)的產(chǎn)品有代表性。當(dāng)產(chǎn)品分成不同的部分，可以分裝于兩個(gè)或多個(gè)容器內(nèi)。樣品份額可以根據(jù)供試產(chǎn)品單元的長(zhǎng)度、質(zhì)量、體積或表面積。如果產(chǎn)品單元有標(biāo)簽說明只是液路無菌，宜把液路視為整個(gè)試驗(yàn)單位。(即SIP=1 ) 2.4 SIP選擇舉例，見表1第75頁(yè)/共107頁(yè)表1 SIP 選擇舉例選擇SIP的依據(jù)表面積質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)樣品放植物(非吸收)粉狀、手術(shù)衣/單、植入物(可吸收)長(zhǎng)度管路(直徑不變) 管路(直徑不變)體積液路水、液體靜脈輸注器，液袋第76頁(yè)/共107頁(yè)微生物實(shí)驗(yàn)儀器隔水式電熱恒溫培育箱漩渦振蕩儀第77頁(yè)/共107頁(yè)實(shí)驗(yàn)五 校正因子Correction factor第78頁(yè)/共107頁(yè)校正因子 定義：用于對(duì)活菌計(jì)數(shù)或滅菌前活菌計(jì)數(shù)進(jìn)行修正的數(shù)值，以補(bǔ)償產(chǎn)品上無法完全洗脫的微生物，以便計(jì)算出生物負(fù)載估計(jì)值。第79頁(yè)/共107頁(yè)校正因子反復(fù)洗脫方法實(shí)驗(yàn)步驟 1取樣品1件或sip，投入一定量的無菌洗脫液中(A)。 2樣品的處理采用旋渦混臺(tái)器(2800次min)，振蕩2min。 3注皿：取處理洗脫液A2ml，分別注入兩個(gè)無菌平皿中，每平皿1ml。 4再洗脫:將樣品從洗脫液A中取出瀝干，移入另一定量的無菌洗脫液中(B)。 5再處理:將B洗脫液置旋渦混臺(tái)器(2800次min)振蕩2min。 6再注皿:取B洗脫液2ml，分別注入兩個(gè)無菌平皿內(nèi)，每平皿lml。注：當(dāng)微生物數(shù)少時(shí),從B洗脫液開始，即可用無菌濾膜過濾后直接放培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 7如此反復(fù)洗脫4次即A、B、C和D，直至洗脫累積量(初始污染菌)不再增加，最后瀝干樣品，將其平鋪于無菌平皿中(E)。然后將熔化并冷至4548的NA培養(yǎng)基，分別注入AE各平皿每皿15ml。 8待凝固后，放置在規(guī)定的培養(yǎng)條件下(3035，48h82h)培養(yǎng)，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。第80頁(yè)/共107頁(yè)校正因子=1/0.3825=2.61編號(hào)瓊脂覆蓋總數(shù)回收率洗脫1洗脫2洗脫3洗脫4平皿1平皿2平均平皿1平皿2平均平皿1平皿2平均平皿1平皿2平均123800600700100080060030020020010002008522208 36.231605 37.381702 41.13平均38.25校正因子計(jì)算平皿均數(shù)稀釋倍數(shù)第81頁(yè)/共107頁(yè)校正因子計(jì)算 同批產(chǎn)品，需抽取3-5件，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，確定最小、最大及平均回收率和初始污染菌數(shù)。 根據(jù)校正因子，滅菌前初始污染計(jì)數(shù)乘以校正因子即為產(chǎn)品帶菌總數(shù)。第82頁(yè)/共107頁(yè)初始污染菌方法驗(yàn)證 檢驗(yàn)洗脫液有無抑菌作用 檢驗(yàn)樣品有無抑菌作用第83頁(yè)/共107頁(yè)無菌洗脫液初始污染菌樣品100cfu1.試驗(yàn)組3.樣品對(duì)照組初始污染菌方法驗(yàn)證（藥典）菌種在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中:洗脫液對(duì)照組(4)的菌回收率應(yīng)均不低于70%。（4/2）100試驗(yàn)組(1)的菌回收率應(yīng)均不低于70% （1-3）/21002.菌液組4.洗脫液對(duì)照組100cfu/ml菌種無菌洗脫液初始污染菌樣品無菌洗脫液100cfu菌種第84頁(yè)/共107頁(yè)初始污染菌方法驗(yàn)證（ISO11737） 選用滅菌產(chǎn)品，如果洗脫技術(shù)中用到洗脫液，每一產(chǎn)品都應(yīng)經(jīng)受常規(guī)微生物洗脫技術(shù)，則將一定數(shù)量的易受破壞的微生物放人洗脫液中，回收微生物。 選用滅菌產(chǎn)品，如果產(chǎn)品直接放人培養(yǎng)基中，可以參照無菌實(shí)驗(yàn)的抑菌實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。第85頁(yè)/共107頁(yè)滅菌產(chǎn)品常規(guī)洗脫回收細(xì)菌數(shù)100cfu菌種實(shí)驗(yàn)組回收細(xì)菌數(shù)/對(duì)照組菌數(shù)100702 對(duì)照組100cfu/ml菌種初始污染菌方法驗(yàn)證（ISO11737）1 實(shí)驗(yàn)組第86頁(yè)/共107頁(yè)微生物實(shí)驗(yàn)儀器菌落計(jì)數(shù)儀第87頁(yè)/共107頁(yè)微生物實(shí)驗(yàn)儀器生化培養(yǎng)箱第88頁(yè)/共107頁(yè)微生物實(shí)驗(yàn)儀器厭氧培養(yǎng)箱第89頁(yè)/共107頁(yè)微生物實(shí)驗(yàn)儀器燭 缸第90頁(yè)/共107頁(yè)微生物實(shí)驗(yàn)儀器恒溫振蕩培養(yǎng)箱第91頁(yè)/共107頁(yè)微生物實(shí)驗(yàn)儀器-80低溫冰箱第92頁(yè)/共107頁(yè)微生物實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)后環(huán)境控制人員控制滅菌控制培養(yǎng)基質(zhì)量無菌操作方法驗(yàn)證無菌實(shí)驗(yàn)B/F初始污染菌驗(yàn)證洗脫液驗(yàn)證樣品無抑菌作用靈敏度實(shí)驗(yàn)無菌檢查儀器校正簡(jiǎn)化操作沉降菌檢測(cè)第93頁(yè)/共107頁(yè)實(shí)驗(yàn)七 革蘭氏染色第94頁(yè)/共107頁(yè)革蘭氏染色步驟 涂片：用紗布擦凈玻璃片，以無菌接種環(huán)取一小滴無菌生理鹽水，然后用無菌接種環(huán)挑取少數(shù)菌苔（落）或液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物（不必加鹽水），在玻璃片中央涂成一薄膜。 干燥：涂片后放室溫中自然干燥。 固定：將玻片迅速通過火焰3次（其目的是殺死細(xì)菌），使菌體與玻片粘附牢固，以及改變對(duì)染料的通透性。 初染：滴加結(jié)晶紫染液于已固定的玻片上，染1min，水洗。 媒染：滴加碘液，作用1min，水洗。 脫色：加95酒精于涂片上，輕輕搖動(dòng)78次，使均勻脫色至涂面無紫色或稍成淡紫色，立即水洗。 復(fù)染：用石炭酸復(fù)紅稀釋液染0.5min，水洗，用濾紙吸干。于涂片上滴加少許香柏油，鏡檢。第95頁(yè)/共107頁(yè)革蘭氏染色：鏡檢 鏡檢：用油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，先以低倍鏡對(duì)光，光線宜強(qiáng)，并開大光圈升高集光器。從側(cè)面轉(zhuǎn)動(dòng)選擇油鏡頭，將油鏡頭浸于涂片油內(nèi)，然后由目鏡中觀察物象，觀察時(shí)可先調(diào)粗調(diào)節(jié)器，當(dāng)看到物像時(shí)，再旋轉(zhuǎn)細(xì)調(diào)節(jié)器，直至物像清晰為止。 結(jié)果：菌體呈紫色者為革蘭陽(yáng)性；呈紅色者為革蘭陰性。 （注：顯微鏡是較貴重的儀器設(shè)備，宜輕巧操作，并按說明書規(guī)定的方法使用和保養(yǎng)。油鏡是顯微鏡中最寶貴的部分，用后一定要立即用擦鏡紙拭去油漬。若油干涸，可用二甲苯少許涂于擦鏡紙上，擦去油，并將物鏡轉(zhuǎn)換成八字形，存放于箱內(nèi)。）第96頁(yè)/共107頁(yè)實(shí)驗(yàn)八 物體表面細(xì)菌總數(shù)第97頁(yè)/共107頁(yè)物體表面細(xì)菌總數(shù) 方法：將內(nèi)徑為5cm5cm的滅菌規(guī)格板，放在被檢物件體表面，根據(jù)物體表面積大小，采平行樣l4個(gè)，用浸有滅菌生理鹽水的棉拭子，在規(guī)格板內(nèi)涂抹10次（往返計(jì)為1次），將棉拭子放入l0ml滅菌生理鹽水的采樣管中。第98頁(yè)/共107頁(yè)物體表面細(xì)菌總數(shù) 將每個(gè)采樣管震打80次，混勻，10倍遞減稀釋，每個(gè)稀釋度（取3個(gè)稀釋度）分別取1ml放于滅菌培養(yǎng)皿（每個(gè)稀釋度傾注2塊平板），用普通瓊脂培養(yǎng)基作傾注培養(yǎng)，置37溫箱培養(yǎng)24h,觀察結(jié)果，取菌落數(shù)為30300的培養(yǎng)皿計(jì)算，求出平均菌落數(shù)。菌數(shù)（cfu）/cm2=平均菌數(shù)稀釋倍數(shù)/采樣面積（cm2）第99頁(yè)/共107頁(yè)實(shí)驗(yàn)九 生產(chǎn)人員手細(xì)菌總數(shù)第100頁(yè)/共107頁(yè)生產(chǎn)人員手細(xì)菌總數(shù) 方法：被檢人五指并攏，將浸有滅菌生理鹽水的棉拭子在右手指曲面，從指尖、甲溝至指根處往返涂抹10次后，將棉拭子放入10ml滅菌生理鹽水的試管中。第101頁(yè)/共107頁(yè)生產(chǎn)人員手細(xì)菌總數(shù) 將每個(gè)采樣管震打80次，混勻，10倍遞減稀釋，每個(gè)稀釋度（取3個(gè)稀釋度）分別取1ml放于滅菌培養(yǎng)皿（每個(gè)稀釋度傾注2塊平板），用普通瓊脂培養(yǎng)基作傾注培養(yǎng)，置37溫箱培養(yǎng)24h,觀察結(jié)果，取菌落數(shù)為30300的培養(yǎng)皿計(jì)算，求出平均菌落數(shù)。 菌落數(shù)（cfu）/每只手=平均菌數(shù)稀釋倍數(shù)第102頁(yè)/共107頁(yè)平皿計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)原則 1.先計(jì)算相同稀釋度的平均菌落數(shù)。若其中一個(gè)平板有較大片狀菌苔生長(zhǎng)時(shí)，則不應(yīng)采用，而應(yīng)以無片狀菌苔生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的平均菌落數(shù)。若片狀菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均勻時(shí)，則可將此一半的菌落數(shù)乘2以代表全平板的菌落數(shù)，然后再計(jì)算該稀釋度的平均菌落數(shù)。 2.首先選擇平均菌落數(shù)在30300之間的，當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，則以該平均菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)即為細(xì)菌總數(shù)(見例1)。 3.若有兩個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)均在30300之間，則按兩者菌落總數(shù)之比值來決定。若其比值小于2，應(yīng)采取兩者的平均數(shù)；若大于2，則取其中較小的菌落總數(shù)(見例2及例3)。第103頁(yè)/共107頁(yè)平皿計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)原則 4.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)(見表1，例4)。5.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)(見表1，例5)。6.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30300之間，則以最近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)(見表1，例6)。 7.若所有稀釋度均無菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告(見表1，例7)。第104頁(yè)/共107頁(yè)例次兩個(gè)稀釋度菌落數(shù)之比菌落總數(shù)報(bào)告方式平均菌落數(shù)10-110-210-31234567136527602890無法計(jì)數(shù)27無法計(jì)數(shù)0164295271465011305020466051351201.62.21640037750271005130002703050011016000或1.610438000或3.810427000或2.710451000或5.1105270或2.710231000或3.110410稀釋度選擇及菌落總數(shù)報(bào)告方式不同稀釋度的第105頁(yè)/共107頁(yè)第106頁(yè)/共107頁(yè)感謝您的觀看。第107頁(yè)/共107頁(yè)