甘肅省高中生物選修一教案:課題1 DNA的粗提取與鑒定

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1、 課題1 DNA的粗提取與鑒定 教材內(nèi)容解讀 要點1 提取DNA的方法 (1)分離 選用一定的物理或化學方法分離具有不同物理或化學性質(zhì)的生物大分子。 (2)DNA的溶解性 DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同,DNA在NaCl溶液中的溶解度隨NaCl的濃度變化,在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低。選擇適當?shù)柠}溶液就能使DNA充分溶解,而使雜質(zhì)沉淀,在0.14mol/L的NaCl溶液中DNA會析出。 DNA不溶于酒精溶液,但是細胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。利用這一原理,可以將DNA與蛋白質(zhì)進一步分離。 (3)DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性

2、 蛋白酶能水解蛋白質(zhì),但是對DNA沒有影響。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60~80℃的高溫,而DNA在80℃以上才會變性。洗滌劑能夠瓦解細胞膜,但對DNA沒有影響。 (4)DNA的鑒定 在沸水浴的條件下,DNA遇二苯胺會被染成藍色。二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。 要點2 實驗設(shè)計 (1)實驗材料的選取 選用DNA含量相對較高的生物組織,如雞血。 (2)破碎細胞,獲取含DNA的濾液 動物細胞以雞血為例,在雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水,同時用玻璃棒攪拌,過濾后收集濾液即可。 植物細胞需要先用洗滌劑溶解細胞膜。 (3)去除濾液中的雜質(zhì) 方法有三種: ①在濾液中加入NaCl,使NaC

3、l溶液濃度為2mol/L,過濾除去不溶的雜質(zhì),再調(diào)節(jié)NaCl溶液濃度為0.14mol/L,析出DNA過濾去除溶液中的雜質(zhì),再用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。 ②直接在濾液中加入嫩肉粉反應(yīng)10~15分鐘,嫩肉粉中的木瓜蛋白質(zhì)酶能夠分解蛋白質(zhì)。 ③將濾液放在60~75℃的恒溫水浴箱中保溫10~15分鐘。 (4)DNA的析出與鑒定 ①析出較純凈的DNA 將處理后的溶液過濾,加入與溶液體積相等的、冷卻的酒精溶液(體積分數(shù)為95%),靜置2~3分鐘,溶液中會出現(xiàn)白色絲狀物,并用濾紙吸去上面的水分。 ②DNA的鑒定 取兩支20mL的試管,各加入物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液

4、5mL,將絲狀物放入其中一支試管中,用玻璃棒攪拌,使絲狀物溶解。然后,向兩支試管中各加入4mL的二苯胺試劑?;旌暇鶆蚝?,將試管置于沸水中加熱5分鐘,待試管冷卻后,比較兩支試管中溶液顏色的變化。溶解有DNA的溶液變藍。 要點3 實驗案例 案例一以雞血為實驗材料進行DNA的粗提取 課前準備 本實驗用雞血細胞做實驗材料有兩個原因。一是因為雞血細胞核的DNA含量豐富,材料易得;二是雞血細胞極易吸水脹破,而用動物肝臟細胞作實驗材料常常需要勻漿和離心,對設(shè)備要求較高,操作繁瑣,歷時較長。 教師可以到市場售活雞處索取雞血,所帶燒杯中必須提前放入抗凝劑檸檬酸鈉溶液。具體制備方法如下。取質(zhì)量濃度為0.

5、1g/mL的檸檬酸鈉溶液100mL,置于500mL燒杯中,注入新鮮的雞血(約180mL),同時用玻璃棒攪拌,使血液與檸檬酸鈉溶液充分混合,以免血液凝結(jié)。將燒杯中的血液置于冰箱內(nèi),靜置1d,使血細胞自行沉淀。有條件的學校也可以將血液倒入離心管內(nèi)進行離心,用2000r/min或3000r/min的轉(zhuǎn)速,離心2min,使血細胞沉淀于離心管底部,這樣可以使血細胞沉淀更完全。用吸管除去上部的澄清液,就可以得到雞血細胞液。值得注意的是雞血細胞破碎以后釋放出的DNA,容易被玻璃容器吸附,所以在提取過程中為了減少DNA的損失,最好使用塑料的燒杯和試管盛放雞血細胞液。 提取DNA的具體步驟 1.破碎細胞,釋

6、放DNA 雞血細胞中的DNA與核蛋白結(jié)合,位于雞血細胞的細胞核中,正常情況下是不會釋放出來的。為了使DNA從細胞核中釋放出來,需要向雞血細胞液中加入蒸餾水,并且攪拌,從而使血細胞膜和核膜脹破。用玻璃棒攪拌可以加速細胞的破裂。注意應(yīng)沿一個方向快速攪拌,但也不能太快太猛,防止打碎DNA。一般5~10mL的雞血細胞液加入20mL蒸餾水攪拌5min。釋放出來的大量DNA和RNA往往與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起,應(yīng)用3~4層紗布進行過濾,除去一些顆粒較大的雜質(zhì)。 2.溶解細胞核內(nèi)的DNA 在濃度較高的NaCl溶液中核蛋白容易解聚,游離出的DNA溶解在溶液中。在溶液中加入兩倍體積的濃度為2mol/L的NaCl

7、溶液,攪拌1min。注意應(yīng)沿一個方向攪拌,使DNA充分溶解。 3.DNA的析出 將溶液中的DNA與其他雜質(zhì)分離,這一步驟是實驗成敗的關(guān)鍵。教材中列舉了提取DNA的三種方案,本案例選取方案一。加蒸餾水降低NaCl溶液濃度,使DNA析出。實驗中應(yīng)該緩慢貼壁加入蒸餾水,并輕輕地沿一個方向不停地均勻攪拌,以利于DNA分子的附著和纏繞。同時應(yīng)注意控制加水量,使NaCl溶液的終濃度為0.1~0.2mol/L。加水過程一般分三次進行,當總加水量為300mL左右時,DNA已基本析出。加水太多、溶液過稀,會使DNA分子又重新溶解。 用3~4層紗布對DNA稀釋液進行過濾,濾去蛋白質(zhì),收集DNA的黏稠物。如果

8、采用離心法,效果更好。用4000r/min轉(zhuǎn)速的離心機,離心15min,除去上清液(含有蛋白質(zhì)),留下的沉淀物中含有DNA。此時注意觀察DNA黏稠物的顏色。 4.DNA的初步純化 如果提取的DNA量不夠多且其中含有較多雜質(zhì),或者加入溶液和攪拌等操作過程不規(guī)范,都會導(dǎo)致實驗現(xiàn)象不明顯,常常使制取的DNA粗制品不能顯示出DNA的本色──白色。為了增進實驗效果,需要對DNA粗制品進行簡單的提純,下面的方案可供參考。 將DNA黏稠物再溶解,繼續(xù)用2mol/L的NaCl溶液20mL溶解DNA黏稠物,仍舊沿一個方向不停攪拌3min,使DNA充分溶解,以免損失。用3~4層紗布進行過濾(或離心),濾去雜

9、質(zhì),收集含有DNA的濾液。向濾液中貼壁緩慢加入50mL預(yù)冷的體積分數(shù)為95%的乙醇,并用玻璃棒朝一個方向緩慢、均勻地攪拌,溶液中會出現(xiàn)DNA絲狀物。 實驗一般要求采用預(yù)冷的95%的乙醇,但對比結(jié)果顯示,常溫下的乙醇溶液也可產(chǎn)生明顯效果。從理論上分析,預(yù)冷的乙醇溶液具有以下優(yōu)點。一是抑制核酸水解酶活性,防止DNA降解;二是降低分子運動,易于形成沉淀析出;三是低溫有利于增加DNA分子柔韌性,減少斷裂。此時懸浮于溶液中的DNA絲狀物相對含雜質(zhì)較少,如果出現(xiàn)的絲狀物較少,可以將此混合液再放入冰箱中冷卻幾分鐘。濃縮后的DNA絲狀物,可以用緩緩旋轉(zhuǎn)玻璃棒的方法卷起(因為玻璃棒有吸附DNA的作用)。如果D

10、NA絲狀物較少,不易吸附在玻璃棒上,也可以用筷子等表面粗糙的用具來幫助DNA分子纏繞。 DNA的純化還有許多其他方法。例如,添加質(zhì)量分數(shù)為25%的十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液,使蛋白質(zhì)變性后與DNA分開。隨后,加入氯仿—異丙醇混合液(體積比為24∶1),通過離心將蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)除去,取上清液??芍貜?fù)上述操作幾次,直至上清液變成透明的黏稠液體。此外苯酚可以迅速使蛋白質(zhì)變性,抑制核酸酶的活性。利用苯酚處理后,離心分層,DNA溶于上層水相,蛋白質(zhì)變性存在于酚層中,這時可用分液漏斗或吸管等儀器將二者分開。教師可以根據(jù)學校的條件讓學生自己設(shè)計實驗方案,比較實驗結(jié)果。 5.DNA的鑒定 二苯胺法二

11、苯胺試劑的配制及鑒定DNA的方法參見教科書。需要注意的是,二苯胺試劑在冰箱內(nèi)可保存6個月,使用前需搖勻。 紫外燈照射法用蒸餾水配制質(zhì)量分數(shù)為0.05%的溴化乙錠(EB)溶液,將玻璃棒上纏繞的白色絮狀物抹到蠟紙上,再滴1滴EB溶液染色。將蠟紙放在紫外燈(260nm)下照射(暗室中),可呈現(xiàn)橙紅色的螢光(DNA的紫外吸收高峰在260nm處)。 電泳法此方法適合鑒定純度較高的DNA。有條件的學??梢詤⒖急緦n}課題2的實驗案例和參考資料部分。 案例二以菜花為實驗材料進行DNA的粗提取 課前準備將新鮮菜花和體積分數(shù)為95%的乙醇溶液放入冰箱冷凍室24h。 提取DNA的具體步驟 1.取材稱取3

12、0g菜花,去梗取花,切碎。 2.研磨將碎菜花放入研缽中,倒入10mL研磨液,充分研磨10min。 研磨液的配制方法如下。將10.1gTris(三羥甲基氨基甲烷)加入到50mL蒸餾水中,使其溶解,然后,用2moL/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至8.0,再加入8.76gNaCl、37.2gEDTA、20gSDS。待上述藥品全部溶解后,再用蒸餾水定容至1000mL。 教材中建議采用洗發(fā)香波、洗滌劑等一些去污劑,使植物細胞膜破碎,釋放DNA。學生可以設(shè)置對照實驗,比較哪一種方法可以提取到純度更高的DNA。一般實驗室提取高純度的DNA都采用一種陽離子去污劑──十六烷三甲基溴化銨分離緩沖液,使細胞膜破碎,

13、同時將DNA與植物中多糖等雜質(zhì)分開,再用氯仿—異丙醇混合液(體積比為24∶1)抽提去除雜質(zhì)蛋白,得到高純度的DNA。 3.過濾在漏斗中墊上尼龍紗布,將菜花研磨液過濾到燒杯中(有條件的學校可將濾液倒入塑料離心管中進行離心,用1000r/min的轉(zhuǎn)速,離心2~5min,取上清液放入燒杯中)。在4℃冰箱中放置幾分鐘后,再取上清液。 4.沉淀將一倍體積的上清液倒入兩倍體積的體積分數(shù)為95%的預(yù)冷乙醇溶液中,并用玻璃棒緩緩、輕輕地攪拌溶液(玻璃棒不要直插到燒杯底部)。沉淀3~5min后,可見白色的DNA絮狀物出現(xiàn)。用玻璃棒緩緩旋轉(zhuǎn),將絮狀物纏繞在玻璃棒上。 要點4 疑難解答 (1)為什么加入蒸餾

14、水能使雞血細胞破裂? 蒸餾水對于雞血細胞來說是一種低滲液體,水分可以大量進入血細胞內(nèi),使血細胞脹裂,再加上攪拌的機械作用,就加速了雞血細胞的破裂(細胞膜和核膜的破裂),從而釋放出DNA。 (2)在切碎的洋蔥加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么? 洗滌劑是一些離子去污劑,能溶解細胞膜,有利于DNA的釋放;食鹽的主要成分是NaCl,有利于DNA的溶解。 (3)提取洋蔥DNA時如果研磨不充分,會對實驗結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響? 研磨不充分會使細胞核內(nèi)的DNA釋放不完全,提取的DNA量變少,影響實驗結(jié)果,導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍色等。 (4)為什么反復(fù)地溶解與析出DNA,能夠去除雜

15、質(zhì)? 用高鹽濃度的溶液溶解DNA,能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì);用低鹽濃度使DNA析出,能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此,通過反復(fù)溶解與析出DNA,就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。 要點5 參考資料 1.二苯胺鑒定DNA的化學原理 DNA中嘌呤核苷酸上的脫氧核糖遇酸生成ω-羥基-γ酮基戊醛,它再和二苯胺作用而呈現(xiàn)藍色(溶液呈淺藍色)。鑒定時溶液藍色的深淺,與溶液中DNA含量的多少有關(guān)。 2.研磨液中幾種藥品的作用 Tris/HCl:提供緩沖體系,DNA在這一體系中呈穩(wěn)定態(tài)(Tris為三羥甲基氨基甲烷)。 EDTA(乙二胺四乙酸二鈉):是DNA酶的抑制劑,可以防止細胞破碎后DNA酶降解DNA。 SDS(十二烷基磺酸鈉):可以使蛋白質(zhì)變性,與DNA分離。

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