2018屆高考生物一輪復(fù)習(xí) 考點(diǎn)加強(qiáng)課6 限制酶的選擇與目的基因的檢測(cè)與鑒定學(xué)案

考點(diǎn)加強(qiáng)課6 限制酶的選擇與目的基因的檢測(cè)與鑒定縱觀近年高考，選修3基因工程幾乎是必考內(nèi)容，是高頻考點(diǎn)，考查內(nèi)容包括基因工程的原理、基因工程的工具、基因工程的基本步驟及基因工程的應(yīng)用等，然而，相關(guān)內(nèi)容考查時(shí)常常涉及限制酶的選擇及目的基因的檢測(cè)與鑒定等，針對(duì)選擇何種限制酶的問(wèn)題，應(yīng)為難點(diǎn)，區(qū)分度高，失分嚴(yán)重，為此，為總結(jié)規(guī)律，歸納方法，特設(shè)置本課?！纠C】 （2016·全國(guó)卷，40）圖（a）中的三個(gè)DNA片段上依次表示出了EcoR、BamH和Sau3A三種限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別序列與切割位點(diǎn)，圖（b）為某種表達(dá)載體的示意圖（載體上的EcoR、Sau3A的切點(diǎn)是唯一的）。根據(jù)基因工程的有關(guān)知識(shí)，回答下列問(wèn)題：（1）經(jīng)BamH酶切后得到的目的基因可以與上述表達(dá)載體被酶切后的產(chǎn)物連接，理由是_。（2）若某人利用圖（b）所示的表達(dá)載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組DNA分子，如圖（c）所示，這三種重組DNA分子中，不能在宿主細(xì)胞中表達(dá)目的基因產(chǎn)物的有，不能表達(dá)的原因是_。圖（c）（3）DNA連接酶是將兩個(gè)DNA片段連接起來(lái)的酶，常見(jiàn)的有 和，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是_?；垩圩R(shí)圖獲取信息（1）三種限制酶切割結(jié)果分析（2）表達(dá)載體與重組DNA分子分析答案（1）Sau3A兩種酶切割后產(chǎn)生的片段具有相同的黏性末端（2）甲、丙甲中目的基因插入在啟動(dòng)子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉(zhuǎn)錄（3）E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶T4DNA連接酶1限制酶的選擇原則（1）根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點(diǎn)確定限制酶的種類(lèi)應(yīng)選擇切點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，以便將目的基因“切出”，如圖甲可選擇Pst。不能選擇切點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶，以防破壞目的基因，如圖甲不能選擇Sma。為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用Pst 和EcoR 兩種限制酶（但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點(diǎn)），而且這種切點(diǎn)不致于完全破壞“標(biāo)記基因”。（2）根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類(lèi)所選限制酶要與切割目的基因的限制酶相一致，以確保具有相同的黏性末端。質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，應(yīng)至少含有一個(gè)完好的標(biāo)記基因，如圖乙中限制酶pst 因其會(huì)破壞標(biāo)記基因而不宜選擇。所選限制酶切點(diǎn)不應(yīng)位于復(fù)制原點(diǎn)處以防破壞復(fù)制原點(diǎn)，如果所選酶的切點(diǎn)不止一個(gè)，則切割重組后可能會(huì)丟失某些片段，若丟失的片段含復(fù)制起點(diǎn)區(qū)，則切割重組后的片段進(jìn)入受體細(xì)胞后不能自主復(fù)制。所選限制酶，其切點(diǎn)應(yīng)位于啟動(dòng)子與終止子之間，如圖乙中Hind會(huì)破壞啟動(dòng)子，EcoR會(huì)破壞終止子，而Nde、Xba及BamH切出的切口可讓目的基因嵌入啟動(dòng)子與終止子之間。（3）參加Ti質(zhì)粒的TDNA片段選擇限制酶若質(zhì)粒上標(biāo)出TDNA片段，則所選限制酶切點(diǎn)應(yīng)位于TDNA片段中，從而有利于將目的基因嵌入到TDNA片段上因?yàn)門(mén)i質(zhì)粒的TDNA片段最易轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并且整合到受體細(xì)胞染色體DNA上，如用兩種限制酶Xba 和Sac （兩種酶切出的黏性末端不同）切割某DNA，獲得含目的基因的片段。若利用該片段構(gòu)建基因表達(dá)載體，則下圖中甲、乙、丁，Ti質(zhì)粒均不宜選擇，而丙Ti質(zhì)粒宜選取。（分析如下）2.目的基因的檢測(cè)與鑒定（1）界定“標(biāo)記基因”與“DNA分子雜交技術(shù)”在目的基因檢測(cè)中的作用：載體上標(biāo)記基因的標(biāo)記原理載體上的標(biāo)記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉(zhuǎn)入的受體細(xì)胞沒(méi)有抵抗相關(guān)抗生素的能力。當(dāng)含有抗生素抗性基因的載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，使受體細(xì)胞能夠抵抗相應(yīng)抗生素，所以在受體細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入該種抗生素就可以只保留轉(zhuǎn)入載體的受體細(xì)胞，倘若在選擇培養(yǎng)基中不能存活，則表明無(wú)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入，當(dāng)然不會(huì)有“目的基因”轉(zhuǎn)入，能存活時(shí)必含該載體，原理如下圖所示：“標(biāo)記基因”篩選后為何還需應(yīng)用“DNA分子雜交技術(shù)”確認(rèn)目的基因是否轉(zhuǎn)入？經(jīng)上述步驟篩選得到的受體細(xì)胞，只是含特定的標(biāo)記基因的質(zhì)粒，然而，該質(zhì)粒上是否成功嵌入了目的基因，還不能確定，故仍需使用“目的基因”作探針，利用DNA分子雜交技術(shù)，檢測(cè)受體細(xì)胞的質(zhì)粒上是否含目的基因。（2）使用“目的基因”作探針，運(yùn)用“分子雜交技術(shù)”檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出特定mRNA。（3）采用“抗原抗體雜交技術(shù)”，從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)（作抗原）與相應(yīng)抗體雜交，依據(jù)是否出現(xiàn)雜交帶確認(rèn)目的基因是否“指導(dǎo)”特定蛋白質(zhì)的合成。（4）采用抗蟲(chóng)、抗病毒等“接種實(shí)驗(yàn)”進(jìn)行目的基因成功表達(dá)的“個(gè)體生物學(xué)”水平的檢測(cè)。1.（2017·北京卷，5）為了增加菊花花色類(lèi)型，研究者從其他植物中克隆出花色基因C（圖1），擬將其與質(zhì)粒（圖2）重組，再借助農(nóng)桿菌導(dǎo)入菊花中。下列操作與實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟环氖牵ǎ〢.用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I和連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒B.用含C基因的農(nóng)桿菌侵染菊花愈傷組織，將C基因?qū)爰?xì)胞C.在培養(yǎng)基中添加卡那霉素，篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細(xì)胞D.用分子雜交方法檢測(cè)C基因是否整合到菊花染色體上解析圖2中質(zhì)粒中的抗性基因?yàn)槌泵顾乜剐曰?，?yīng)該在培養(yǎng)基中添加潮霉素，篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細(xì)胞，C錯(cuò)誤。答案C2.（2017·廣東省惠州市模擬）長(zhǎng)期以來(lái)香蕉生產(chǎn)遭受病害的嚴(yán)重威脅，制約了其發(fā)展。目前，隨著轉(zhuǎn)基因抗病香蕉基因工程技術(shù)的日趨成熟，為培育抗病香蕉品種開(kāi)辟了新途徑。轉(zhuǎn)基因抗病香蕉的培育過(guò)程如圖所示，質(zhì)粒上有Pst、Sma、EcoR、Apa等四種限制酶切割位點(diǎn)。請(qǐng)回答：（1）構(gòu)建含抗病基因的表達(dá)載體A時(shí)，應(yīng)選用限制酶，對(duì)進(jìn)行切割。（2）培養(yǎng)基中的卡那霉素會(huì)抑制香蕉愈傷組織細(xì)胞的生長(zhǎng)，欲利用該培養(yǎng)基篩選已導(dǎo)入抗病基因的香蕉細(xì)胞，應(yīng)使基因表達(dá)載體A中含有，作為標(biāo)記基因。（3）能使抗病基因在香蕉細(xì)胞中特異性表達(dá)的調(diào)控序列是（填字母序號(hào)）。A.啟動(dòng)子 B.終止子C.復(fù)制原點(diǎn) D.標(biāo)記基因（4）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用方法有多種，圖中所示方法為。（5）欲檢測(cè)目的基因是否表達(dá)成功，可采用的技術(shù)是。（6）利用組織培養(yǎng)技術(shù)將導(dǎo)入抗病基因的香蕉組織細(xì)胞培育成轉(zhuǎn)基因植株，香蕉組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基中除了含有一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外還必須含有等植物激素，它們會(huì)在（填圖中標(biāo)號(hào)）階段發(fā)揮作用，同時(shí)（填圖中標(biāo)號(hào)）階段還需要給予一定光照。解析（1）從圖中可看出，只有Pst、EcoR兩種酶能保持抗病基因結(jié)構(gòu)的完整性，所以構(gòu)建含抗病基因的表達(dá)載體A時(shí)，應(yīng)選用限制酶Pst、EcoR兩種酶，對(duì)含抗病基因的DNA和質(zhì)粒進(jìn)行切割。（2）卡那霉素能抑制香蕉愈傷組織細(xì)胞的生長(zhǎng)，欲利用該培養(yǎng)基篩選已導(dǎo)入抗病基因的香蕉細(xì)胞，應(yīng)使基因表達(dá)載體A中含有卡那霉素抗性基因，以此作為標(biāo)記基因。（3）啟動(dòng)子和終止子能啟動(dòng)目的基因的轉(zhuǎn)錄與終止，是使抗病基因在香蕉細(xì)胞中特異性表達(dá)的調(diào)控序列。（4）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法。圖中采用的是最常用的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。（5）檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的DNA上是否插入了目的基因，采用DNA分子雜交技術(shù)；檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，采用分子雜交技術(shù)；檢測(cè)目的基因是否表達(dá)成功產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白質(zhì)，采用抗原抗體雜交技術(shù)。（6）植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基中需要的植物激素是：生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，在脫分化和再分化中發(fā)揮重要作用，在再分化過(guò)程中需要給予一定的光照，利于芽的分化。答案（1）Pst、EcoR含抗病基因的DNA和質(zhì)粒（2）卡那霉素抗性基因（3）AB（4）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（5）抗原抗體雜交（6）生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素和隨堂·真題&預(yù)測(cè)1.（2016·全國(guó)卷，40）某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活（Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因）。有人將此質(zhì)粒載體用BamH酶切后，與用BamH酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉?wèn)題：（1）質(zhì)粒載體作為基因工程的工具，應(yīng)具備的基本條件有_（答出兩點(diǎn)即可），而作為基因表達(dá)載體，除滿(mǎn)足上述基本條件外，還需具有啟動(dòng)子和終止子。（2）如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，在上述四種大腸桿菌細(xì)胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的細(xì)胞是不能區(qū)分的，其原因是_；并且和的細(xì)胞也是不能區(qū)分的，其原因是_。在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌的單菌落，還需使用含有的固體培養(yǎng)基。（3）基因工程中，某些噬菌體經(jīng)改造后可以作為載體，其DNA復(fù)制所需的原料來(lái)自于_。解析（1）作為運(yùn)載體必須具備如下特點(diǎn)：能自主復(fù)制，從而在受體細(xì)胞中穩(wěn)定保存；含標(biāo)記基因，以供重組DNA的鑒定和篩選；具一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)以便外源DNA插入。（2）在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，只有具有Ampr的大腸桿菌才能夠生長(zhǎng)。而Ampr位于質(zhì)粒上，故未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的大腸桿菌細(xì)胞中無(wú)Ampr，不能在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而僅含有質(zhì)粒載體的和含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌均具有Ampr因而能在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。目的基因的插入破壞了質(zhì)粒載體的Tetr，故含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌不能在含有四環(huán)素的平板上生長(zhǎng)，從而與僅含有質(zhì)粒載體的大腸桿菌得以區(qū)分。（3）噬菌體是病毒，無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，無(wú)法自主合成DNA，需借助宿主細(xì)胞完成DNA復(fù)制。答案（1）能自我復(fù)制、具有標(biāo)記基因（2）二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不生長(zhǎng)含有質(zhì)粒載體含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒（或答含有重組質(zhì)粒）二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)四環(huán)素（3）受體細(xì)胞2.（2019·高考預(yù)測(cè)）胰島素A、B鏈分別表達(dá)法是生產(chǎn)胰島素的方法之一。圖1是該方法所用的基因表達(dá)載體，圖2表示利用大腸桿菌作為工程菌生產(chǎn)人胰島素的基本流程（融合蛋白A、B分別表示半乳糖苷酶與胰島素A、B鏈融合的蛋白）。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：（1）圖1基因表達(dá)載體中沒(méi)有標(biāo)注出來(lái)的基本結(jié)構(gòu)是。（2）圖1中啟動(dòng)子是酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能啟動(dòng)目的基因的表達(dá)；氨芐青霉素抗性基因的作用是_。（3）構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)必需的工具酶有。（4）半乳糖苷酶與胰島素A鏈或B鏈融合表達(dá)，可將胰島素肽鏈上蛋白酶的切割位點(diǎn)隱藏在內(nèi)部，其意義在于。（5）溴化氰能切斷肽鏈中甲硫氨酸羧基端的肽鍵，用溴化氰處理相應(yīng)的融合蛋白能獲得完整的A鏈或B鏈，且半乳糖苷酶被切成多個(gè)肽段，這是因?yàn)開(kāi)。（6）根據(jù)圖2中胰島素的結(jié)構(gòu)，請(qǐng)推測(cè)每個(gè)胰島素分子中所含游離氨基的數(shù)量。你的推測(cè)結(jié)果是，理由是_。解析基因表達(dá)載體包含啟動(dòng)子、終止子、目的基因和標(biāo)記基因等。啟動(dòng)子是RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)。氨芐青霉素抗性基因可作為標(biāo)記基因。基因工程使用的工具酶包括限制酶和DNA 連接酶。胰島素肽鏈上蛋白酶的切割位點(diǎn)隱藏起來(lái)，將無(wú)法被蛋白酶所識(shí)別，防止被水解。溴化氰能切斷肽鏈中甲硫氨酸羧基端的肽鍵，若經(jīng)溴化氰處理相應(yīng)融合蛋白能獲得完整的A鏈和B鏈，表明胰島素A鏈、B鏈上并無(wú)溴化氰作用位點(diǎn)，不能將其切斷；同理，半乳糖苷酶能被切成“多個(gè)肽段”，表明其具有多個(gè)切點(diǎn)（即“甲硫氨酸”）。胰島素分子含有兩條鏈，至少有2個(gè)游離氨基分別位于2條肽鏈的一端，并且R 基團(tuán)中可能也含有游離的氨基。答案（1）終止子（2）RNA聚合作為標(biāo)記基因，將含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌篩選出來(lái)（3）限制酶和DNA連接酶（4）防止胰島素的A、B 鏈被菌體內(nèi)蛋白酶降解（5）半乳糖苷酶中含多個(gè)甲硫氨酸，而胰島素A、B 鏈中不含甲硫氨酸（6）至少2個(gè)兩條肽鏈的一端各有一個(gè)游離的氨基，氨基酸R 基團(tuán)中可能還含有游離的氨基教師獨(dú)具1.（2017·云南名校適應(yīng)性考試，40）多聚半乳糖醛酸酶（PG）能降解果膠使細(xì)胞壁破損，成熟的番茄果實(shí)中，PG合成顯著增加，能使果實(shí)變紅變軟，但不利于保鮮。利用基因工程減少PG基因的表達(dá)，可延長(zhǎng)果實(shí)保質(zhì)期?？茖W(xué)家將PG基因反向接到Ti質(zhì)粒上，導(dǎo)入番茄細(xì)胞中，得到轉(zhuǎn)基因番茄，具體操作流程如圖。據(jù)圖回答下列問(wèn)題：（1）提取目的基因若已獲取PG的mRNA，可通過(guò)獲取PG基因。在該基因上游加結(jié)構(gòu)A可確保基因的反向轉(zhuǎn)錄，結(jié)構(gòu)A上應(yīng)具有結(jié)合位點(diǎn)。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中的目的是_。（2）用含目的基因的農(nóng)桿菌感染番茄原生質(zhì)體后，可用含有的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。培養(yǎng)2448 h后取樣，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的蔗糖溶液中，觀察細(xì)胞現(xiàn)象來(lái)鑒別細(xì)胞壁是否再生。（3）由于導(dǎo)入的目的基因能轉(zhuǎn)錄出反義RNA，且能與互補(bǔ)結(jié)合，因此可抑制PG基因的正常表達(dá)。若轉(zhuǎn)基因番茄的保質(zhì)期比非轉(zhuǎn)基因番茄，則可確定轉(zhuǎn)基因番茄培育成功。（4）獲得的轉(zhuǎn)基因番茄產(chǎn)生的種子不一定保留目的基因，科研人員常采用方法使子代保持轉(zhuǎn)基因番茄的優(yōu)良性狀。解析（1）已獲取PG的mRNA，可通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄（反轉(zhuǎn)錄）的方法獲得目的基因。因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物是mRNA，在轉(zhuǎn)錄時(shí)需要RNA聚合酶。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中的目的是大量復(fù)制目的基因。（2）由圖可知，重組質(zhì)粒中含卡那霉素抗性基因而四環(huán)素抗性基因被破壞，故可用含卡那霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。植物細(xì)胞在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的蔗糖溶液中會(huì)發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象，所以可以用來(lái)鑒別細(xì)胞壁是否再生。（3）由以上分析可知，反義RNA與天然PG基因轉(zhuǎn)錄的mRNA互補(bǔ)結(jié)合，從而抑制翻譯過(guò)程。若轉(zhuǎn)基因番茄的保質(zhì)期比非轉(zhuǎn)基因番茄長(zhǎng)，則可肯定轉(zhuǎn)基因番茄培育成功。（4）獲得的轉(zhuǎn)基因番茄產(chǎn)生的種子不一定保留目的基因，植物組織培養(yǎng)屬于無(wú)性繁殖，能保持母本的優(yōu)良性狀，故科研人員常采用植物組織培養(yǎng)方法使子代保持轉(zhuǎn)基因植物的優(yōu)良性狀。答案（1）反轉(zhuǎn)錄RNA聚合酶使目的基因隨質(zhì)粒的復(fù)制而復(fù)制（2）卡那霉素是否發(fā)生質(zhì)壁分離（3）天然PG基因轉(zhuǎn)錄的mRNA長(zhǎng)（4）無(wú)性繁殖（或植物組織培養(yǎng)）2.根據(jù)基因工程的有關(guān)知識(shí)，回答下列問(wèn)題：（1）cDNA文庫(kù)屬于基因文庫(kù)，其構(gòu)建方法是：用某種生物發(fā)育的某個(gè)時(shí)期的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA片段，與連接后儲(chǔ)存在一個(gè)受體菌群中。（2）切割DNA分子的工具是，它能使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的斷開(kāi)，形成黏性末端或平末端。（3）基因工程中所使用的DNA連接酶有兩類(lèi)。既可以“縫合”黏性末端，又可以“縫合”平末端的是DNA連接酶。（4）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞采用最多的方法是；如果受體細(xì)胞是大腸桿菌，需要用處理細(xì)胞，使之成為感受態(tài)細(xì)胞，才能吸收DNA分子。解析（1）基因文庫(kù)包括基因組文庫(kù)和部分基因文庫(kù)如cDNA文庫(kù)。cDNA文庫(kù)構(gòu)建的方法是：用某種生物發(fā)育的某個(gè)時(shí)期的mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA片段，與載體連接后儲(chǔ)存在一個(gè)受體菌群中。（2）切割DNA分子的工具是限制酶，它作用的化學(xué)鍵是磷酸二酯鍵。限制酶切割DNA后形成黏性末端或平末端。（3）基因工程中所使用的DNA連接酶有E·coliDNA連接酶和T4DNA連接酶兩類(lèi)，前者只可“縫合”黏性末端，后者既可以“縫合”黏性末端，又可以“縫合”平末端。（4）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法；如果受體細(xì)胞是大腸桿菌，需要用Ca2處理細(xì)胞，使之成為感受態(tài)細(xì)胞，才能吸收DNA分子。答案（1）部分mRNA載體（2）限制性核酸內(nèi)切酶磷酸二酯鍵（3）T4（4）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法Ca2（時(shí)間：30分鐘滿(mǎn)分：100分）1.（2018·河南省八市測(cè)評(píng)，31）科技人員通過(guò)基因工程、細(xì)胞融合等技術(shù)制作工程細(xì)胞，并利用工程細(xì)胞生產(chǎn)人們所需要的醫(yī)用蛋白，如用于治療糖尿病的胰島素。下面是利用大腸桿菌培育工程菌時(shí)用到的質(zhì)粒、胰島素基因及相關(guān)的限制酶。請(qǐng)回答：表幾種限制酶識(shí)別序列及其切割位點(diǎn) （1）能識(shí)別人胰島素的mRNA并催化合成cDNA的酶是；利用PCR技術(shù)對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增所需要的酶是。在基因工程中，限制酶不能識(shí)別并切割單鏈核酸，其具體功能是_。 （2）上表中可切割形成圖2胰島素基因末端的限制酶為；不宜選用Sau3A 限制酶切割質(zhì)粒的原因是_。酶切后的質(zhì)粒與胰島素基因通過(guò)（填酶）作用后獲得基因表達(dá)載體。 （3）基因表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌前，常用Ca2處理菌體，其目的是_。（4）從大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)獲得了胰島素，但其沒(méi)有降血糖的功能，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是_。解析（2）根據(jù)胰島素基因末端序列可知，切割胰島素基因的限制酶識(shí)別和切割的序列為GGATCC，表中的Sau3A可識(shí)別切割。分析表格信息可知，Sau3A限制酶可識(shí)別并切割Bgl或Bcl限制酶的識(shí)別序列，導(dǎo)致質(zhì)粒中的標(biāo)記基因均被破壞。答案（1）逆轉(zhuǎn)錄酶熱穩(wěn)定DNA聚合酶或Taq酶識(shí)別雙鏈DNA的某種特定核苷酸序列并斷裂特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵（2）Sau3ASau3A限制酶能識(shí)別并切割Bgl和Bcl限制酶的識(shí)別序列，導(dǎo)致質(zhì)粒中的標(biāo)記基因均被破壞（其他合理答案也可）DNA連接酶（3）提高受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率（其他合理答案也可）（4）大腸桿菌為原核生物，細(xì)胞中只有核糖體，沒(méi)有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，不能對(duì)肽鏈進(jìn)行加工，形成有活性的胰島素2.（2018·中原名校第一次質(zhì)量考評(píng)，30）下面是通過(guò)基因工程獲得內(nèi)皮素的主要受體ETA的過(guò)程，圖中SNAP基因是一種熒光蛋白基因，限制酶APa的識(shí)別序列為CCCGGG，限制酶Xho的識(shí)別序列為CTCGAG。請(qǐng)分析回答下列問(wèn)題：（1）圖中cDNA文庫(kù)（填“大于”“等于”或“小于”）基因組文庫(kù)，若要在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的目的基因片段，可采用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的前提是_。（2）過(guò)程中，限制酶Xho切割DNA，形成的目的基因的黏性末端是。用兩種限制酶切割，獲得不同的黏性末端，其主要目的是_。（3）過(guò)程中需要用酶，過(guò)程中，要用預(yù)先處理大腸桿菌，使其處于容易吸收外界DNA的感受態(tài)。利用SNAP基因與ETA基因結(jié)合構(gòu)成融合基因，目的是_。解析（1）基因組文庫(kù)包括了該種生物所有的基因，而部分基因文庫(kù)只包含一種生物的部分基因，因此cDNA文庫(kù)小于基因組文庫(kù)。若要在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的目的基因片段，可采用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列。以便根據(jù)這一序列合成引物。（2）過(guò)程中利用限制酶Xho切割DNA獲得目的基因的過(guò)程，限制酶使得DNA的磷酸二酯鍵斷開(kāi)，形成的黏性末端是。用兩種限制酶切割，獲得不同的黏性末端，其主要目的是使目的基因定向連接到載體上（或防止自身環(huán)化）。（3）過(guò)程中需要用DNA連接酶將目的基因與載體組合到一起；過(guò)程中，要用Ca2預(yù)先處理大腸桿菌，使其處于容易吸收外界DNA的感受態(tài)。利用SNAP基因與ETA基因結(jié)合構(gòu)成融合基因，目的是有利于檢測(cè)內(nèi)皮素受體ETA基因能否表達(dá)及表達(dá)量。答案（1）小于要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物（2）AGCT（或）使目的基因定向連接到載體上（或防止自身環(huán)化）（3）DNA連接Ca2（或氯化鈣溶液）有利于檢測(cè)內(nèi)皮素受體ETA基因能否表達(dá)及表達(dá)量3.（2017·鄭州二測(cè)，38）Bt基因即是蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱(chēng)Bt）基因，因其表達(dá)產(chǎn)物Bt毒蛋白殺蟲(chóng)效果好、安全、高效等優(yōu)點(diǎn)而成為應(yīng)用最為廣泛的轉(zhuǎn)殺蟲(chóng)基因。下圖為培育轉(zhuǎn)Bt基因苗的基本操作過(guò)程。（1）Bt基因可從構(gòu)建的Bt基因組文庫(kù)中獲取，也可以從其cDNA文庫(kù)中獲取，從前者獲取的基因（填“含有”或“不含有”）啟動(dòng)子。若利用PCR技術(shù)從cDNA文庫(kù)中獲取Bt基因（基因序列未知），需根據(jù)Bt蛋白氨基酸序列設(shè)計(jì)引物，引物的序列可以有多種，原因是_。在PCR體系中需加入其中的（填“全部”或“任意1種”或“其中2種”）引物。若Bt基因序列已知，則引物的序列通常為種。 （2）在構(gòu)建基因表達(dá)載體的過(guò)程中，為了方便篩選含有目的基因的細(xì)胞，作為運(yùn)載體的Ti質(zhì)粒應(yīng)含有基因，其中是驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)，而能幫助目的基因整合到宿主細(xì)胞染色體上的序列稱(chēng)為。圖示將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法是_。 （3）步驟中產(chǎn)生的細(xì)胞團(tuán)稱(chēng)為，步驟和V過(guò)程要注意控制培養(yǎng)基中的濃度比例，以便獲得幼苗。答案（1）含有一種氨基酸可能有多種密碼子，對(duì)應(yīng)引物DNA堿基序列就會(huì)有多種全部 2（2）標(biāo)記（抗性）啟動(dòng)子TDNA（可轉(zhuǎn)移DNA）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 （3）愈傷組織生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素4.（2018·河南名校一聯(lián)，38）胰島素是治療糖尿病的重要藥物?，F(xiàn)利用基因工程技術(shù)讓大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素，下圖為大腸桿菌質(zhì)粒，請(qǐng)據(jù)圖作答。補(bǔ)充說(shuō)明：Hind、BamH、EcoR 是限制酶切位點(diǎn)tetR、ampR是抗生素抗性基因（1）獲取目的基因時(shí)，應(yīng)從人的文庫(kù)（基因組/cDNA）中獲取，這樣做的原因?yàn)?。獲取后不能直接對(duì)目的基因酶切，因?yàn)?，因此需要在目的基因兩端添加。（2）天然人胰島素不耐儲(chǔ)存，可使用蛋白質(zhì)工程對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改造。蛋白質(zhì)工程的基本途徑為設(shè)計(jì)預(yù)期蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)找到相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列。答案（1）cDNAcDNA中無(wú)內(nèi)含子序列，能夠在大腸桿菌中表達(dá)正確蛋白質(zhì)cDNA中只有編碼氨基酸的序列，直接酶切會(huì)導(dǎo)致基因結(jié)構(gòu)改變BamH 和EcoR I的識(shí)別位點(diǎn) （2）預(yù)期蛋白質(zhì)功能推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列14