第十四節(jié) DNA的粗提取與鑒定

《第十四節(jié) DNA的粗提取與鑒定》由會員分享，可在線閱讀，更多相關《第十四節(jié) DNA的粗提取與鑒定（13頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

1、　　 DNA的粗提取與鑒定 主講：黃岡中學優(yōu)秀生物教師　王小敏 課題目標： 1、通過嘗試對植物或動物組織中的DNA進行粗提取，了解DNA的物理、化學性質； 2、理解DNA粗提取與鑒定的原理。 課題重難點： DNA的粗提取和鑒定方法。 一、基礎知識 （一）提取DNA的方法 1、提取生物大分子的基本思路 　　選用一定的物理或化學方法分離具有不同物理或化學性質的生物大分子。 2、提取DNA的基本思路 　　利用DNA與RNA．蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面的差異，提取DNA，去除其他成分。 3、DNA粗提取的原理 　　（1）DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解

2、度不同。 　　DNA和蛋白質等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同。 　　DNA在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最?。辉?mol/L的NaCl溶液中溶解度最大。 　?。?）DNA不溶于酒精 　　DNA不溶于酒精溶液，但細胞中某些蛋白質則溶于酒精。 　?。?）DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性 　?、俚鞍酌浮獾鞍踪|，對DNA沒有影響。 　?、诟邷亍蠖鄶?shù)蛋白質不能忍受60～80℃，而DNA在80℃以上才會變性。 　?、巯礈靹芙饧毎?，去除脂質和蛋白質，但對DNA沒有影響。 （二）DNA的鑒定 　　沸水浴條件下，DNA遇二苯胺被染成藍色。

3、 　　原理總結：通過利用不同濃度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以從細胞中提取和提純DNA；再利用酒精進一步將DNA與蛋白質分離開來，達到提純的目的；最后利用二苯胺試劑鑒定提取的物質是否是DNA。 二、實驗設計 （一）實驗材料的選取 1、材料： 　　魚卵、豬肝、菜花、香蕉、雞血、哺乳動物的紅細胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌。（從中選取2～3種實驗材料） 2、原則：凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但選用DNA含量相對較高的生物組織，成功的可能性更大。 （二）破碎細胞，獲取含DNA的濾液 1、動物細胞——容易破碎 　　10mL雞血＋20mL蒸餾水→同

4、方向攪拌→3層尼龍布過濾→濾液 　　討論1：為什么加入蒸餾水能使雞血細胞破裂？ 　　答：蒸餾水對于雞血細胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進入血細胞內，使血細胞脹裂，再加上攪拌的機械作用，就加速了雞血細胞的破裂（細胞膜和核膜的破裂），從而釋放出DNA。 2、植物細胞 　　①植物細胞需要先用一定的洗滌劑和食鹽溶解細胞膜。 　?、趯嵗禾崛⊙笫[DNA時，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽，進行充分的攪拌和研磨，過濾后收集研磨液。 　　討論2：如果研磨不充分，會對實驗結果產生怎樣的影響？ 　　答：研磨不充分會使細胞核內的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實驗結果，導致看不

5、到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍色等。 （三）去除濾液中的雜質 　　最初獲得的DNA濾液含有蛋白質、脂質等雜質，需要進一步提純DNA。 　　閱讀教材提供的三種方法，分析其中的原理。 　　方案一：利用DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度的不同，通過控制NaCl溶液的濃度去除雜質。具體做法是：在濾液中加入NaCl，使NaCl溶液濃度為2mol/L，過濾除去不溶的雜質，再調節(jié)NaCl溶液濃度為0.14mol/L，析出DNA，過濾去除溶液中的雜質，再用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。 　　原理：DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同。 　　思考：為什么反復地溶解與析出DNA，能

6、夠去除雜質？ 　　答：用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質；用低鹽溶液使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質。 　　方案二：直接在濾液中加入嫩肉粉，反應10～15min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能夠分解蛋白質。 　　方案三：將濾液放在60～75℃的恒溫水浴箱中保溫10～15 min，注意嚴格控制溫度范圍。 　　討論3：方案二與方案三的原理有什么不同？ 　　答：方案二是利用蛋白酶分解雜質蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質分開；方案三利用的是DNA和蛋白質對高溫耐受性的不同，從而使蛋白質變性，與DNA分離。 （四）DNA的析出與鑒定 1、DNA的析出 用冷卻的

7、酒精析出DNA 　　DNA的析出用的是與濾液體積相等的冷卻的酒精溶液（體積分數(shù)為95%），靜置2－3min，溶液中會出現(xiàn)白色絲狀物，這就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水。 2、DNA的鑒定 　　具體做法：試管2支，編號甲、乙→各加等量5mLNaCl溶液→甲中放入少量白色絲狀物，使之溶解→各加4mL二苯胺，混合均勻→沸水浴5min→觀察顏色變化。 三、實驗操作 四、操作提示 　　在雞血中加入檸檬酸鈉防止凝固；雞血靜置或離心以提高細胞懸液濃度；使用塑料燒杯；使用尼龍布過濾；玻棒沿同一方向攪拌；玻棒攪拌要緩慢（細胞破裂快速攪拌）；玻棒不要

8、碰到燒杯壁；二苯胺試劑要現(xiàn)用現(xiàn)配等。為了提高DNA純度，在科學實驗中通常使用的洗滌劑有十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、十二烷基硫酸鈉（SDS）。 課堂小結： - 返回 - 　　 同步測試 一、選擇題 1、在研究DNA的基因樣本前，采集來的血樣需要蛋白水解酶處理，然后用有機溶劑除去蛋白質。用蛋白水解酶處理血樣的目的是（　） A．除去血漿中的蛋白質 B．除去染色體上的蛋白質 C．除去血細胞表面的蛋白質 D．除去血細胞中的所有的蛋白質，使DNA釋放，便于進一步提純 2、與析出DNA粘稠物有關的敘述，不正確的是（　） A．操作時緩緩滴加蒸餾水，降低DNA的溶

9、解度 B．在操作A時，用玻璃棒輕緩攪拌，以保證DNA分子完整 C．加蒸餾水可同時降低DNA和蛋白質的溶解度，兩者均可析出 D．當絲狀粘稠物不再增加時，此時NaCl的濃度相當于0.14mol/L 3、洗滌劑能夠瓦解（?。?，但對DNA沒有影響。 A．細胞壁　　　　　　　　　　B．細胞膜 C．細胞核　　　　　　　　　　D．細胞質 4、在沸水浴的條件下，DNA遇（?。蝗境伤{色。 A．斐林試劑　　　　　　　　　B．蘇丹Ⅲ染液 C．雙縮脲試劑　　　　　　　　D．二苯胺 5、在DNA提取過程中，最好使用塑料試管和燒杯，目的是（?。? A．不易破碎　　　　　　　　　B．減少提取過程中D

10、NA的損失 C．增加DNA的含量　　　　　　 D．容易洗刷 6、下列操作中，對DNA的提取量影響最小的是（?。? A．使雞血細胞在蒸餾水中充分破裂，放出DNA等核物質 B．攪拌時，要使用玻璃棒沿一個方向輕緩攪拌 C．在“析出DNA粘稠物”時，要緩緩加蒸餾水，直至溶液中粘稠物不再增加 D．在用酒精沉淀DNA時，要使用冷酒精，甚至再將混合液放入冰箱中冷卻 E．在DNA的溶解和再溶解時，要充分攪拌 7、DNA的粗提取中，將與濾液體積相等的、冷卻的（?。o置2-3min，溶液中會出現(xiàn)白色絲狀物。 A．0.9%的NaCl B．0.14mol/L的NaCl溶液 C．質量分數(shù)15%的H

11、Cl D．體積分數(shù)為95%的酒精溶液 8、以血液為實驗材料時，需要向血液中加入（　），防止血液凝固。 A．醋酸鈉　　　　　　　　　　B．龍膽紫 C．檸檬酸鈉　　　　　　　　　D．醋酸洋紅 9、在向溶解DNA的NaCl溶液中，不斷加入蒸餾水的目的是（　） A．加快溶解DNA的速度 B．加快溶解雜質的速度 C．減少DNA的溶解度，加快DNA析出 D．減小雜質的溶解度，加快雜質的析出 10、去除濾液中的雜質時，直接在濾液中加入嫩肉粉，利用嫩肉粉中的（　）分解蛋白質。 A．胃蛋白酶　　　　　　　　B．胰蛋白酶 C．木瓜蛋白酶　　　　　　　D．腸肽酶 DCBDB BDCCC

12、 二、非選擇題 11、提取雞血中DNA時，要除去血液中的上清液，這是因為什么？ 顯示答案 　　11、因為上清液是血漿，不含有血細胞，DNA存在于沉郁試管底部的雞血細胞的細胞核中，所以提取雞血中的DNA時，要除去血液中的上清液。 12、填寫本實驗完成下列實驗操作時所用試劑。 （1）提取雞血細胞中核物質____________________。 （2）溶解核內DNA：____________________。 （3）析出2mol/LNaCl溶液中的DNA____________________。 （4）DNA粘稠物的再溶解____________________。 （5）提

13、取雜質較少的DNA白色乳狀絲狀物____________________。 （6）DNA的鑒定____________________。 顯示答案 12、（1）蒸餾水 （2）2mol/L NaCl溶液 （3）蒸餾水 （4）2mol/L NaCl溶液 （5）冷卻的95%的酒精 （6）二苯胺 13、關于DNA粗提取的實驗材料的選擇，也經(jīng)過了多次實驗效果的比較，最終選擇雞血做實驗材料的原因是什么？請回答下列問題： 　　（1）雞血細胞中紅細胞__________，家雞屬于鳥類，新陳代謝旺盛，因而血液中__________細胞樹木較多，可以提供豐富的__________。 　　

14、（2）實驗前由老師制備血細胞液供同學們做實驗材料，而不用雞全血，主要原因是____________________。 　?。?）生活在牧區(qū)的人們，采集牛、羊和馬血比較方便，若他們按實驗要求完成實驗步驟后，結果是__________，這是因為這些動物和人一樣，成熟的紅細胞中__________，但若改用動物肝臟做實驗材料，實驗能順利進行。這是因為____________________。 　?。?）若選用動物肝臟做實驗材料，在提取之前，最好增加__________程序，使組織細胞更易分離。 顯示答案 13、（1）含細胞核；紅；DNA （2）雞血細胞液中DNA相對含量 （3）很難提

15、取到DNA；無細胞核；肝細胞有細胞核 （4）研磨 -END- 　　 課外拓展 以菜花為實驗材料進行DNA的粗提取 　　課前準備將新鮮菜花和體積分數(shù)為95%的乙醇溶液放入冰箱冷凍室24h。 　　提取DNA的具體步驟 　　1、取材稱取30g菜花，去梗取花，切碎。 　　2、研磨將碎菜花放入研缽中，倒入10mL研磨液，充分研磨10min。 　　研磨液的配制方法如下。將10.1g Tris加入到50mL蒸餾水中，使其溶解，然后，用2mol/L的HCl溶液調節(jié)pH至8.0，再加入8.76g NaCl、37.2g EDTA、20g SDS。待上述藥品全部溶解后，再用蒸餾水定

16、容至1000mL。 　　教材中建議采用洗發(fā)香波、洗滌劑等一些去污劑，使植物細胞膜破碎，釋放DNA。學生可以設置對照實驗，比較哪一種方法可以提取到純度更高的DNA。一般實驗室提取高純度的DNA都采用一種陽離子去污劑——十六烷三甲基溴化銨分離緩沖液，使細胞膜破碎，同時將DNA與植物中多糖等雜質分開，再用氯仿—異丙醇混合液（體積比為24∶1）抽提去除雜質蛋白，得到高純度的DNA。 　　3、過濾在漏斗中墊上尼龍紗布，將菜花研磨液過濾到燒杯中（有條件的學?？蓪V液倒入塑料離心管中進行離心，用1000r/min的轉速，離心2～5min，取上清液放入燒杯中）。在4 ℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。

17、　　4、沉淀將一倍體積的上清液倒入兩倍體積的體積分數(shù)為95%的預冷乙醇溶液中，并用玻璃棒緩緩、輕輕地攪拌溶液（玻璃棒不要直插到燒杯底部）。沉淀3～5min后，可見白色的DNA絮狀物出現(xiàn)。用玻璃棒緩緩旋轉，將絮狀物纏繞在玻璃棒上。 ? -END- 　　 高考解析 例1、有人將豬血取出后，經(jīng)過濾獲得豬血細胞液，經(jīng)過一系列實驗步驟后，發(fā)現(xiàn)實驗效果與下列哪類動物相同（?。? A．兩棲類　　　　　　B．魚類　　　　　　C．爬行類　　　　　　D．鳥類　　　　　　E．沒有相同的 答案：E 解析： 　　豬紅細胞無細胞核，上述四類動物的紅細胞中均有細胞核。 例2、在DNA的粗提取

18、實驗過程中，兩次向燒杯中加入蒸餾水的作用是（?。? A．稀釋血液、沖洗樣品 B．使血細胞破裂、降低NaCl濃度使DNA析出 C．使血細胞破裂、增大DNA溶解量　　 D．使血細胞破裂、提取含雜質較少的DNA 答案： B 解析： 　　第一次加入蒸餾水的作用是使血細胞過度吸水而破裂，以便核內物質釋放。第二次加入適量蒸餾水，是為了降低NaCl濃度，使DNA因溶解度達到最小而析出。 例3、檢測DNA物質的試劑是（?。? A．斐林試劑　　　　　　　　　B．95%的酒精 C．甲基綠溶液　　　　　　　　D．二苯胺試劑 答案： C、D 解析： 　　甲基綠溶液和二苯胺試劑均可鑒定 DNA。DNA遇甲基綠溶液呈綠色，DNA遇二苯胺試劑呈藍色。 例4、下列操作中，對DNA的提取量影響較小的是（?。? A．使雞血細胞在蒸餾水中充分破裂，放出DNA等核物質 B．攪拌時，要用玻璃棒沿一個方向輕緩攪動 C．在析出DNA黏稠物時，要緩緩加蒸餾水，直至溶液中黏稠物不再增多 D．在用酒精沉淀DNA時，要使用冷酒精，甚至再將混合液放入冰箱中冷卻 E．在DNA的溶解和再溶解時，要充分攪拌 答案：B 解析： 　　在B所述的操作中，可以保證DNA分子的完整性，但不影響提取量。除了A、C、D、E影響DNA的提取量外，使用塑料器皿也可以減少DNA在操作中的損失。 -END-