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1、2022年高中生物《多聚酶鏈式反應(yīng)擴增DNA片段》教案2 新人教版選修1
★課題目標
(一)知識與技能
1、了解PCR技術(shù)的基本操作
2、理解PCR的原理
3、討論PCR的應(yīng)用
???(二)過程與方法
在多聚酶鏈式反應(yīng)擴增DNA片段的實驗過程中,應(yīng)避免外源DNA污染,嚴格控制溫度等反應(yīng)條件
(三)情感、態(tài)度與價值觀
通過對PCR實驗的操作及結(jié)果分析,培養(yǎng)學(xué)生嚴謹?shù)目茖W(xué)態(tài)度和實事求是的科研精神
★課題重點
PCR的原理和PCR的基本操作
★課題難點
PCR的原理
★教學(xué)方法
啟發(fā)式教學(xué)
★教學(xué)工具
多媒體課件
★教學(xué)過程
(
2、一)引入新課
在現(xiàn)代生物技術(shù)中,DNA技術(shù)可謂是尖端技術(shù)。人類基因組計劃、基因工程、基因診斷、基因檢測、古生物鑒定等都離不開對DNA分子堿基序列的分析。而分析DNA堿基序列,就需要一定量的DNA片段。怎樣迅速獲得足夠量的DNA片段呢?今天我們來研究學(xué)習(xí)DNA分子的擴增技術(shù)――PCR技術(shù)。
(二)進行新課
1.基礎(chǔ)知識
PCR技術(shù)擴增DNA的過程,與細胞內(nèi)DNA復(fù)制過程類似:
1.1細胞內(nèi)DNA復(fù)制條件分析:
條件
組分
作用
模板
DNA的兩條單鏈
提供復(fù)制的模板
原料
四種脫氧核苷酸
合成DNA子鏈的原料
酶
解旋酶
DNA聚合酶
打開DNA雙螺旋
催化
3、合成DNA子鏈
能量
ATP
為解螺旋和合成子鏈供能
引物
RNA
為DNA聚合酶提供合成的3’端起點
1.2細胞內(nèi)DNA復(fù)制過程
(1)DNA的反向平行結(jié)構(gòu):(結(jié)合教材圖5-6)
核苷酸分子的結(jié)構(gòu)與方向性:(分子結(jié)構(gòu)模式圖)
由核苷酸通過3,5-磷酸二酯鍵連接形成核苷酸長鏈:(模式圖,體現(xiàn)方向性)。
DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的反向平行結(jié)構(gòu):
(2)DNA的復(fù)制過程:
解 旋:解旋酶、ATP,DNA兩條鏈打開,,形成兩條DNA單鏈。
引物結(jié)合:在DNA單鏈3’端與DNA反向配對結(jié)合,確保引物3’端與DNA單鏈準確配對。
DNA聚合酶結(jié)合:
子鏈合成:DNA聚合酶從
4、引物3’端開始,將配對的脫氧核苷酸連接起來。
后續(xù)加工:DNA聚合酶I將引物切去,并合成空缺處的DNA單鏈,再由DNA連接酶將不連續(xù)的DNA子鏈連接起來(半不連續(xù)合成。先導(dǎo)鏈,滯后鏈)
子鏈合成特點:不能從頭合成;合成方向為“5’→3’合成”。
感悟生命的神秘:DNA聚合酶不但能夠催化磷酸二酯鍵的形成,還具有校對功能。它在每引入一個核苷酸后都要復(fù)查一次,只有堿基配對無誤后才能繼續(xù)往下聚合,它不能從頭合成。RNA聚合酶沒有校對功能,因此RNA的合成不需要引物,而是從頭合成的,它的錯配可能性較大,在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I刪去,代之以高保真的DNA鏈。
[思考]DNA分子能準
5、確復(fù)制的原因有哪些?
DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)提供模板;堿基互補配對;DNA聚合酶的復(fù)查功能。
[思考]細胞內(nèi)哪些物質(zhì)是從頭合成的?RNA合成、蛋白質(zhì)合成。
1.3DNA分子復(fù)制的人工控制
解開螺旋:在80~100℃時,DNA雙螺旋打開,形成兩條DNA單鏈,稱為變性。
恢復(fù)螺旋:在50℃左右時,兩條DNA單鏈重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu),稱為復(fù)性。
復(fù)制條件:緩沖液,DNA模板,四種脫氧核苷酸,熱穩(wěn)定DNA聚合酶,兩種引物。
反應(yīng)場所:PCR儀(自動溫度周期性調(diào)節(jié))。
[思考]緩沖液相當細胞內(nèi)的什么成分?(核基質(zhì))
4.PCR的反應(yīng)過程
延伸
復(fù)性
變性
變性:在95℃時DNA
6、解旋
復(fù)性:在50℃時引物與DNA單鏈結(jié)合
延伸:在72℃時合成DNA子鏈(兩個引物間的序列)
2.實驗操作
2.1 PCR反應(yīng)體系:緩沖液、DNA模板,四種脫氧核苷酸原料、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、兩種RNA引物,水
2.2 實驗操作步驟
2.3 按照PCR反應(yīng)體系配方配制反應(yīng)液;
(2)將PCR反應(yīng)體系50μL用微量移液器轉(zhuǎn)移到微量離心管(0.5mL)中;
(3)將微量離心管放到PCR儀中;
(4)設(shè)置PCR儀的工作參數(shù)。
(5)DNA在PCR儀中大量擴增。
2.4 水浴法:將微型離心管依次在95℃、55℃、72℃的恒溫水浴鍋中循環(huán)處理相應(yīng)時間。
3.實驗注意事項
7、3.1避免外源DNA污染:所用儀器、緩沖液、蒸餾水等使用前高壓滅菌。
3.2緩沖液和酶分裝成小份,-20℃低溫保存。
3.3每添加一種反應(yīng)成分,更換一個移液器的槍頭。
3.4混勻后離心處理,使反應(yīng)液集中在離心管底部。
4.結(jié)果分析與評價
4.1反應(yīng)液稀釋:取2μLPCR反應(yīng)液,添加98μL蒸餾水;2.分光光度計調(diào)零:將100μL蒸餾水添加到比色杯中,在260nm處將分光光度計調(diào)整讀數(shù)為零。
4.2將100μL反應(yīng)稀釋液倒入比色杯中,測定在260nm處的光吸收值。
4.3計算:DNA含量=50×光吸收值×稀釋倍數(shù)
(三)課堂總結(jié)、點評
多聚酶鏈式反應(yīng)擴增DNA片段
PCR原理
8、
DNA的復(fù)制需要酶、原料、能量、引物
DNA的變性和復(fù)性受溫度影響
PCR過程
變性
復(fù)性
延伸
操作步驟
配制PCR反應(yīng)體系
移入離心管
放入PCR
設(shè)置工作參數(shù)
DNA擴增
測定含量
稀釋
調(diào)零
測定并讀數(shù)
計算
(四)實例探究
例1 在( )的溫度范圍內(nèi),DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)解開
A. 10-20℃ B. 80-100℃ C. 20-30℃ D. 40-60℃
解析:蛋白質(zhì)大多不能忍受60-80℃的高溫,而DNA在80℃以上才會變性。
答案:B
例2 關(guān)于DNA的復(fù)制,下列敘述
9、正確的是( )
A. DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA,只能從5’端延伸DNA鏈
B. DNA復(fù)制不需要引物
C. 引物與DNA母鏈通過堿基互補配對進行結(jié)合
D. DNA的合成方向總是從子鏈的3’端向5’端延伸
解析:由于DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA,只能從引物的3’端即復(fù)制方向由3’端向5’端延伸;由于DNA分子是反向平行的,子鏈是依據(jù)堿基互補配對原則,在DNA聚合酶作用下合成的,其合成方向是從子鏈5’端向3’端延伸。
答案:C
☆綜合應(yīng)用
例3 下列有關(guān)PCR描述,不正確的是( )
A. 是一種酶促反應(yīng)
B. 引物決定了擴增的特異性
C. 擴增產(chǎn)量
10、按y=(1+X)n
D. 擴增對象是氨基酸序列
E. 擴增對象是DNA序列
解析:PCR是一種體外迅速擴增DNA片段的技術(shù),它以極少量的DNA為模板,以四種脫氧核苷酸為原理,在引物的作用下使DNA聚合酶從引物的3’端連接脫氧核苷酸,短時間內(nèi)迅速復(fù)制上百萬份的DNA拷貝,其擴增產(chǎn)量為y=(1+X)n,y代表DNA片段擴增后的拷貝數(shù),x表示平均每次的擴增效率,n代表循環(huán)次數(shù),因此答案選D。
答案:D
(五)鞏固練習(xí)
1.DNA分子復(fù)制時,解旋的兩條鏈中( )
A僅一條作為復(fù)制模板
B兩條鏈作為模板并復(fù)制出兩個不同的DNA分子
C兩條鏈作為模板并復(fù)制出兩個相同的DNA分子
11、
D兩條鏈作為模板,各自合成一條子鏈,然后兩條母鏈重新結(jié)合為原來的雙螺旋分子,兩條新鏈結(jié)合成一個全新的DNA分子
2.下列關(guān)于DNA復(fù)制過程的正確順序是( )
①互補堿基對之間氫鍵斷裂②互補堿基對之間形成氫鍵③DNA分子在解旋酶的作用下解旋④以解旋后的母鏈為模板進行堿基互補配對⑤子鏈與母鏈盤旋成雙螺旋狀結(jié)構(gòu)
A①③④②⑤ B①④②⑤③ C①③⑤④② D③①④②⑤
3.下列各項過程中,遵循“堿基互補配對原則”的有( )
①DNA復(fù)制②RNA復(fù)制③轉(zhuǎn)錄④翻譯⑤逆轉(zhuǎn)錄
A①②③④⑤ B①②③④ C①②③⑤ D①③④⑤
4.實驗室內(nèi)
12、模擬生物體DNA的復(fù)制必需的一組條件是( )
①酶②游離的脫氧核苷酸③ATP④DNA分子⑤mRNA⑥tRNA⑦適宜的溫度⑧適宜的酸堿度
A①②③④⑤⑥ B②③④⑤⑥⑦ C②③④⑤⑦⑧ D①②③④⑦⑧
5.利用PCR技術(shù),把一個雙鏈DNA分子當作第一代,經(jīng)過3次循環(huán),在第四代DNA分子中,有幾條第一代脫氧核苷酸的長鏈?( )
A 2 B 4 C 8 D 16,
6.關(guān)于DNA分子的敘述中,正確的是( )
A .DNA的兩條鏈是極性相同,同向平行 B.DNA的兩條鏈是極性相同,反向平行
C
13、.DNA的兩條鏈中極性不同,反向平行的 D.DNA的兩條鏈是極性不同,同向平行
7.假設(shè)PCR反應(yīng)中,只有一個DNA的片段作為模板,請計算在30次循環(huán)后,反應(yīng)物中大約有多少這樣的DNA片段( )
A 215 B 230 C 260 D 231
8.DNA的合成方向總是( )延伸。
A從DNA分子的左端向右端 B從DNA分子的右端向左端
C從子鏈的5,端向3,端 D從子鏈的3,端向5,端
9.要使PCR反應(yīng)在體外的條件下順利地進行,需要嚴格的控制( )
A 氧氣的濃度 B酸堿度
14、 C溫度 D 大氣的濕度
10.DNA分子經(jīng)PCR反應(yīng)循環(huán)一次后,新合成的那條子鏈的脫氧核苷酸的序列應(yīng)與( )
A模板母鏈相同 B非模板母鏈相同
C兩條模板母鏈相同 D兩條模板母鏈都不相同
答案: CDADA CBCCB
★課余作業(yè)
1、PCR與生物體DNA復(fù)制有何區(qū)別?
2、如果在案件偵破過程中,只收集到一根毛發(fā),但它所含的遺傳信息太少,該怎么辦呢?
★教學(xué)體會
教師在教學(xué)過程中,可以鮮引導(dǎo)學(xué)生回憶必修2的有關(guān)DNA復(fù)制的知識,在此基礎(chǔ)上,學(xué)生可加深對于PCR原理的認識。對于PCR反應(yīng)過程的教學(xué),應(yīng)以讀圖識圖為主。教材中反應(yīng)過程圖解詳細的描繪了參與
15、PCR的各種組成成分;每一輪反應(yīng)的三個基本步驟—變性、復(fù)性、延伸;每一步驟的作用。教師在教學(xué)中可以請學(xué)生在讀圖的同時,結(jié)合教科書中的文字說明來加深理解。當學(xué)生遇到難以理解的地方時,教師要及時給予解答。
★資料袋
免疫-PCR
免疫-PCR(immuno-PCR)是新近建立的一種靈敏、特異的抗原檢測系統(tǒng).它利用抗原-抗體反應(yīng)的特異性和PCR擴增反應(yīng)的極高靈敏性來檢測抗原,尤其適用于極微量抗原的檢測.
免疫-PCR試驗的主要步驟有三個:①抗原-抗體反應(yīng),②與嵌合連接分子結(jié)合,③PCR擴增嵌合連接分子中的DNA(一般為質(zhì)粒DNA).該技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是嵌合連接分子的制備.在免疫-PCR中,嵌合連接分子起著橋梁作用,它有兩個結(jié)合位點,一個與抗原抗體復(fù)合物中的抗體結(jié)合,一個與質(zhì)粒DNA結(jié)合,其基本原理與ELISA和免疫酶染色相似,不同之處在于其中的標記物不是酶而是質(zhì)粒DNA,在操作反應(yīng)中形成抗原抗體-連接分子-DNA復(fù)合物,通過PCR擴增DNA來判斷是否存在特異性抗原.
免疫PCR優(yōu)點為:①特異性較強,因為它建立在抗原抗體特異性反應(yīng)的基礎(chǔ)上.②敏感度高,PCR具有驚人的擴增能力,免疫PCR比ELISA敏感度高105倍以上,可用于單個抗原的檢測.③操作簡便,PCR擴增質(zhì)粒DNA比擴增靶基因容易得多,一般實驗室均能進行.