《生物化學(xué)蛋白質(zhì)》PPT課件.ppt

第二章 蛋白質(zhì),一、蛋白質(zhì)的分類 二、蛋白質(zhì)的組成單位-氨基酸 三、肽 四、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 五、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 六、蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離分析技術(shù),本章內(nèi)容,蛋白質(zhì)是有許多-氨基酸按一定序列通過以酰胺鍵(肽鍵)縮合而成的,具有穩(wěn)定的構(gòu)象并具有一定生物功能的生物大分子。 蛋白質(zhì)是一切生物細(xì)胞和組織的主要組成部分，是生命活動(dòng)所依據(jù)的物質(zhì)基礎(chǔ)。,一、蛋白質(zhì)的分類,C H O N S （ 50%55%） （6%8%） （20523%） （15%17%） （03%）,Others: P、Cu、Fe、Zn、Mn、Co、Se、I,磷 銅 鐵 鋅 錳 鈷 硒 碘,蛋白質(zhì)氮元素的含量都相當(dāng)接近，一般在15%17，平均為16。這是凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的計(jì)算基礎(chǔ)。,蛋白質(zhì)的元素組成：,6 .25 16的倒數(shù)，每測(cè)定g 氮相當(dāng)于6 .25g的蛋白質(zhì)。也就是1 g 氮所代表的蛋白質(zhì)量（克數(shù)）,蛋白質(zhì)含量蛋白氮6 .25,1.按分子的形狀或空間構(gòu)象分類 A.纖維狀蛋白 分子很不對(duì)稱，形狀類似纖維。 一般不溶于水。典型的有：膠原蛋白質(zhì)、彈性蛋白質(zhì)、角蛋白質(zhì)、絲蛋白質(zhì)等 B.球狀蛋白質(zhì) 分子的形狀接近球形，空間構(gòu)象比纖維狀蛋白復(fù)雜。 球狀蛋白質(zhì)的溶解性較好，能結(jié)晶，生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)大多數(shù)屬于這一類。 典型的有：胞質(zhì)酶類等 C. 膜蛋白質(zhì) 一般折疊成近球形。生物膜的多數(shù)功能是通過膜蛋白實(shí)現(xiàn)的。,2.按組成成分分類 A .簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)單純蛋白不含有非蛋白質(zhì)部分。這類蛋白質(zhì)水解后的最終產(chǎn)物只有氨基酸。 簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)按其溶解性又可分為: 清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白、精蛋白、組蛋白以及硬蛋白等,參見P18 表2-1,B.結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白是指由單純 蛋白和非蛋白成分結(jié)合而成的蛋白質(zhì)。 按其非氨基酸成分又可分為： 核蛋白、糖蛋白與蛋白聚糖、脂蛋白、色蛋白（血紅素蛋白、黃素蛋白）、磷蛋白、金屬蛋白,3. 按功能分類 酶（催化功能）；調(diào)節(jié)蛋白；貯存蛋白質(zhì)；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)；運(yùn)動(dòng)蛋白；防御蛋白和毒蛋白；受體蛋白；支架蛋白；結(jié)構(gòu)蛋白；異常蛋白。,（一）-氨基酸結(jié)構(gòu)通式,二、蛋白質(zhì)的組成單位-氨基酸,氨基酸是含有氨基及羧基的有機(jī)化合物。 氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位。從細(xì)菌到人類，所有蛋白質(zhì)都由20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸組成,構(gòu)型：根據(jù)甘油醛構(gòu)型確定D型和L型,1.根據(jù)甘油醛原則確定構(gòu)型 2.自然界的氨基酸有兩種構(gòu)型，構(gòu)型和旋光方向沒有必然聯(lián)系。 3.組成蛋白質(zhì)的氨基酸都是L型，除甘氨酸外都有旋光性。LAA,據(jù)R基團(tuán)化學(xué)結(jié)構(gòu)分類,一氨基一羧基（中性AA、含羥基或巰基AA）Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Cys、Met,芳香族A(Phe、Tyr),雜環(huán)(His、Trp);雜環(huán)亞(Pro);,據(jù)R基團(tuán)極性分類,極性R基團(tuán)AA,非極性R基團(tuán)AA（8種） Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Trp,不帶電荷（7種） Gly、Ser、Thr、Asn 、Gln 、 Tyr、Cys,帶電荷：正電荷（種）His、 Lys、Arg 負(fù)電荷（種）Asp、Glu,據(jù)氨基、羧基數(shù)分類,一氨基二羧基(酸性AA及其酰胺）Glu、 Gln、Asp、Asn,二氨基一羧基(堿性AA）Lys、Arg,人的必需氨基酸 Lys Trp Phe Val Met Leu Ile Thr Arg、His（半必需）,(二) 氨基酸的分類,參見表2-2,脂肪族AA,氨基酸的結(jié)構(gòu)、代號(hào),1 氨基酸的兩性解離性質(zhì)及等電點(diǎn),pH = pI 凈電荷=0,pH pI 凈電荷為正,pH pI 凈電荷為負(fù),(pK1),(pK2),當(dāng)氨基酸溶液在某一定pH值時(shí)，使某特定氨基酸分子上所帶正負(fù)電荷相等，成為兩性離子，在電場(chǎng)中既不向陽(yáng)極也不向陰極移動(dòng)，此時(shí)溶液的pH值即為該氨基酸的等電點(diǎn)(isoelectric point，pI)。,（三）氨基酸的重要理化性質(zhì),用標(biāo)準(zhǔn)NaOH和HCI進(jìn)行滴定，用NaOH和HCI的摩爾數(shù)對(duì)pH值作圖,規(guī)律,pHpI aa “” pHpI aa “” pH=pI aa “0”,表觀解離常數(shù) 以丙氨酸為例:,參見P26,對(duì)側(cè)鏈R基不解離的中性氨基酸來說，其等電點(diǎn)是它的pKl和pK2的算術(shù)平均值。,pI=(pK1+pK2)/2,對(duì)多氨基和多羧基氨基酸的解離 解離原則：,先解離COOH，隨后其他COOH； 然后解離NH3+，隨后其他NH3+ 一般pI值等于兩個(gè)相近pK值之和的一半,谷氨酸（A）和賴氨酸（B）滴定曲線和等電點(diǎn)計(jì)算,中性氨基酸：pK1為羧基的解離常數(shù)，pK2為氨基的解離常數(shù)。 pI=(pK1+pK2)/2 酸性氨基酸：pK1為羧基的解離常數(shù)，pK2為側(cè)鏈羧基的解離常數(shù)。 pI=(pK1+pK2)/2 堿性氨基酸： pK2為氨基的解離常數(shù)，pK3為側(cè)鏈氨基的解離常數(shù)。 pI=(pK2+pK3)/2,總結(jié),1.某氨基酸的等電點(diǎn)即為該氨基酸兩性離子兩邊的pK值和的一半。 2.在氨基酸等電點(diǎn)以上任何pH，AA帶凈的負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向陽(yáng)極移動(dòng)；在氨基酸等電點(diǎn)以下任何pH，AA帶凈的正電荷，在電場(chǎng)中向陰極移動(dòng)。 3.在一定pH范圍中，溶液的pH離AA等電點(diǎn)愈遠(yuǎn)，AA帶凈電荷愈多。,小結(jié),(1)與茚三酮反應(yīng) 茚三酮在弱酸性溶液中與-氨基酸共熱，氨基酸被氧化脫氨、脫羧反應(yīng)生成醛、CO2和NH3，最后茚三酮與反應(yīng)產(chǎn)物氨和還原茚三酮發(fā)生作用，生成藍(lán)紫色化合物。 兩個(gè)亞氨基酸脯氨酸和羥脯氨酸 與茚三酮反應(yīng)并不釋放NH3，而直接形成 黃色化合物。,2 氨基酸的化學(xué)性質(zhì),茚三酮,+,氨基酸與茚三酮反應(yīng),水合茚三酮,(2) 與甲醛的反應(yīng),氨基可以與甲醛反應(yīng)，生成羥甲基化合物。 由于氨基酸在溶液中以偶極離子形式存在，所以不能用酸堿滴定測(cè)定含量。與甲醛反應(yīng)后，氨基酸不再是偶極離子，其滴定終點(diǎn)可用一般的酸堿指示劑指示，因而可以滴定，這叫甲醛滴定法，可用于測(cè)定氨基酸。,(3) 與2，4-二硝基氟苯的反應(yīng) (Sanger反應(yīng)） 在弱堿性溶液中，氨基酸的- 氨基很容易與2，4-二硝基氟苯（DNFB）作用，生成穩(wěn)定的黃色2，4-二硝基苯基氨基酸（簡(jiǎn)寫為DNP-氨基酸）。,+,DNFB（dinitrofiuorobenzene）,氨基酸,DNP-AA(黃色),（sanger反應(yīng)）,+ HF,與丹磺酰氯反應(yīng)（DNS） 丹磺酰氯是二甲氨基萘磺酰氯的簡(jiǎn)稱,+,HCI,有熒光,(4) 與異硫氰酸苯酯反應(yīng)（Edman反應(yīng)） 在弱堿性條件下，氨基酸中的-氨基還可以與異硫氰酸苯酯（PITC）反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸）。在無水酸中，PTC-氨基酸即環(huán)化為苯硫乙內(nèi)酰脲（PTH），后者在酸中極穩(wěn)定。 這個(gè)反應(yīng)首先被Edman用于鑒定多肽或蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸。,+,PITC,苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸）,（Edman反應(yīng)）,苯硫乙內(nèi)酰脲(PTH-AA),兩個(gè)相鄰氨基酸的羧基和氨基之間脫水縮和形成的酰胺鍵稱 為肽鍵。 氨基酸形成肽鍵后，稱為氨基酸殘基。 肽鍵連接氨基酸殘基形成二肽、寡肽、多肽鏈和蛋白質(zhì)。,（一）肽與肽鍵的結(jié)構(gòu),三、肽,肽鍵,N=C 0.127nm 鍵長(zhǎng)=0.132nm N-C 0.148nm,肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。 在大多數(shù)情況下，以反式結(jié)構(gòu)存在。,參見p32,肽平面或酰胺平面：,組成肽單位的4個(gè)原子和2個(gè)相鄰的碳原子都處于同一個(gè)平面內(nèi)，此剛性結(jié)構(gòu)的平面稱為肽平面或酰胺平面。,肽單位：實(shí)際就是一個(gè)肽平面,（二）肽單位 肽鍵的四個(gè)原子和與之相連的兩個(gè)-碳原子所組成的基團(tuán)。,參見p32,酰胺平面與-碳原子之間形成的二面角 （ 和 ）,（三）肽鏈中AA的排列順序和命名,通常在多肽鏈的一端含有一個(gè)游離的-氨基，稱為氨基端或N-端；在另一端含有一個(gè)游離的-羧基，稱為羧基端或C-端。 氨基酸的順序是從N-端的氨基酸殘基開始，以C-端氨基酸殘基為終點(diǎn)的排列順序。如下面的五肽可表示為： Ser-Gly-Tyr-Val-Leu,參見p31,多肽鏈結(jié)構(gòu)示意圖,（四）天然存在的活性肽,自然界中有自由存在的活性肽，主要有： 1.谷胱甘肽（GSH）：三肽（GluCysGly），含有自由的巰基，具有很強(qiáng)的還原性，可作為體內(nèi)重要的還原劑，保護(hù)某些蛋白質(zhì)或酶分子中的巰基免遭氧化，使其處于活性狀態(tài)。,分子中具有一個(gè)由谷氨酸的-羧基和半胱氨酸的-氨基脫水縮合的-肽鍵,2.腦啡肽：為五肽，具有鎮(zhèn)痛作用，它們?cè)谥袠猩窠?jīng)系統(tǒng)中形成，是體內(nèi)自己產(chǎn)生的一類鴉片劑。,Met-腦啡肽 H Tyr Gly Gly PheMetOH Leu-腦啡肽 H Tyr Gly Gly phe LeuOH,3.牛催產(chǎn)素與加壓素： 均為九肽，分子中含有一對(duì)二硫鍵，兩者結(jié)構(gòu)類似。前者第八位為L(zhǎng)eu，后者為Arg。前者可刺激子宮的收縮，促進(jìn)分娩。后者可促進(jìn)小動(dòng)脈收縮，使血壓升高，也有抗利尿作用，參與水、鹽代謝的調(diào)節(jié)。 牛催產(chǎn)素 S S CysTyrIleGlnAsnCysProLeuGly-NH2 牛加壓素 S S CysTyrPheGlnAsnCysProArgGly-NH2,四 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)與多肽并無嚴(yán)格的界線，通常是將分子量在6000道爾頓以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。,定義 1969年，國(guó)際純化學(xué)與應(yīng)用化學(xué)委員會(huì)（IUPAC） 規(guī)定： 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)多肽鏈中AA的排列順序，包括二硫鍵的位置。,(一)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu),2.一級(jí)結(jié)構(gòu)的意義,一級(jí)結(jié)構(gòu) 高級(jí)結(jié)構(gòu) 功能,決定,決定,例：牛胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)又稱蛋白質(zhì)的構(gòu)象或高級(jí)結(jié)構(gòu)，是指蛋白質(zhì)分子中所有原子在三維空間的分布和肽鏈的走向。 蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)包括二級(jí)結(jié)構(gòu)、超二級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)等。,(二)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu),1 維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的作用力 維持蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的作用力主要是次級(jí)鍵，即氫鍵和鹽鍵等非共價(jià)鍵，以及疏水作用力和范德華力等。 氫鍵： x H y 離子鍵（鹽鍵）：它是由帶相反電荷的兩個(gè)基團(tuán) 間的靜電吸引所形成的 疏水作用力（疏水鍵）：是指非極性基團(tuán)即疏水基團(tuán)為 了避開水相而群集在一起的集合力 范德華力：在物質(zhì)的聚集狀態(tài)中，分子與分子之 間存在著一種較弱的作用力 二硫鍵 ：是兩個(gè)硫原子之間所形成的共價(jià)鍵,蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈的主鏈本身通過氫鍵沿一定方向盤繞、折疊而形成的構(gòu)象. 它只涉及肽鏈主鏈的構(gòu)象及鏈內(nèi)或鏈間形成的氫鍵。(注:二級(jí)結(jié)構(gòu)不涉及側(cè)鏈的構(gòu)象) 主要有-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲。,2 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu),多肽鏈中的各個(gè)肽平面圍繞同一軸旋轉(zhuǎn)，形成螺旋結(jié)構(gòu)，螺旋一周，沿軸上升的距離即螺距為0.54nm,含3.6個(gè)氨基酸殘基；兩個(gè)氨基酸之間的距離為0.15nm; 每個(gè)aa殘基沿軸旋轉(zhuǎn)100度. 肽鏈內(nèi)形成氫鍵，氫鍵的取向幾乎與軸平行，每個(gè)氨基酸殘基的C=O氧與其后第四個(gè)氨基酸殘基的N-H氫形成氫鍵。 絕大多數(shù)天然蛋白質(zhì)中的-螺旋幾乎都是右手螺旋。 -螺旋都是由L-型氨基酸構(gòu)成的（Gly除外）。,、 -螺旋及結(jié)構(gòu)特點(diǎn),(1)-螺旋結(jié)構(gòu),螺距0.54nm,每殘基的 軸向高度,0.15nm,每殘基繞軸 旋轉(zhuǎn)100 o,、-螺旋結(jié)構(gòu)形成的限制因素:,凡是有Pro存在的地方,不能形成。因Pro形成的肽鍵N原子上沒有H,不可能形成氫鍵。 靜電斥力。若一段肽鏈有多個(gè)Glu或Asp相鄰,則因pH=7.0時(shí)都帶負(fù)電荷,防礙螺旋的形成;同樣多個(gè)堿性氨基酸殘基在一段肽段內(nèi),正電荷相斥,也防礙螺旋的形成。 位阻。如Asn、Leu側(cè)鏈很大，防礙螺旋的形成。,(2) -折疊（-pleated sheet）,-折疊或-折疊片也稱-結(jié)構(gòu)或-構(gòu)象，它是蛋白質(zhì)中第二種最常見的二級(jí)結(jié)構(gòu)。 -折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的多肽鏈平行排列，通過鏈間的氫鍵進(jìn)行交聯(lián)而形成的，或一條肽鏈內(nèi)的不同肽段間靠氫鍵而形成的。肽鏈的主鏈呈鋸齒狀折疊構(gòu)象,-折疊結(jié)構(gòu)幾乎所有肽鍵都參與鏈間氫鍵的形成，氫鍵與鏈的長(zhǎng)軸接近垂直。 -折疊有兩種類型： 一種為平行式，即所有肽鏈的N-端都在同一邊。 另一種為反平行式，即相鄰兩條肽鏈的方向相反,-折疊的特點(diǎn),N,N,N,平行式,N,C,N,反平行式,蠶絲心蛋白,-回折（或發(fā)夾結(jié)構(gòu)） 在-轉(zhuǎn)角部分，由四個(gè)氨基酸殘基組成;彎曲處的第一個(gè)氨基酸殘基的 -C=O 和第四個(gè)殘基的 N-H 之間形成氫鍵，形成一個(gè)不很穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。 這類結(jié)構(gòu)主要存在于球狀蛋白分子中。 其特點(diǎn)是肽鏈回折180度,(3) -轉(zhuǎn)角,目前發(fā)現(xiàn)的-轉(zhuǎn)角多數(shù)都存在蛋白質(zhì)分子表面，它們的含量相當(dāng)豐富，約占全部AA殘基的1/4。,(4) 無規(guī)卷曲,肽段在空間的不規(guī)則排布稱為無規(guī)則卷曲。 在一般球蛋白分子中，往往含有大量的無規(guī)則卷曲，它使蛋白質(zhì)肽鏈從整體上形成球狀構(gòu)象。,無規(guī)則卷曲示意圖,細(xì)胞色素C的三級(jí)結(jié)構(gòu),無規(guī)則卷曲,3 超二級(jí)結(jié)構(gòu),（1）超二級(jí)結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)中相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)單位（-螺旋或-折疊或-轉(zhuǎn)角）組合在一起，形成有規(guī)則的、在空間上能夠辨認(rèn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組合體。 （2）超二級(jí)結(jié)構(gòu)的基本類型： 、 、,超二級(jí)結(jié)構(gòu)類型, , ,-曲折,-螺旋,定義：對(duì)于較大的蛋白質(zhì)分子或亞基，多肽鏈往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相對(duì)獨(dú)立的三維實(shí)體締合而成三級(jí)結(jié)構(gòu)，這種相對(duì)獨(dú)立的三維實(shí)體稱結(jié)構(gòu)域。 現(xiàn)在,結(jié)構(gòu)域的概念有三種不同而又相互聯(lián)系的涵義:即獨(dú)立的結(jié)構(gòu)單位、獨(dú)立的功能單位和獨(dú)立的折疊單位。,4 結(jié)構(gòu)域,類型： -螺旋域； -折疊域； +域； /域；無規(guī)則卷曲+-回折域； 無規(guī)則卷曲+ -螺旋結(jié)構(gòu)域,結(jié)構(gòu)域1,結(jié)構(gòu)域2,-折疊,-轉(zhuǎn)角,二硫鍵,-螺旋,卵溶菌酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)中的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,兩個(gè)鐵原子,蚯蚓血紅蛋白中四個(gè)-螺旋組成的結(jié)構(gòu)域 -螺旋域；,免疫球蛋白VL -折疊結(jié)構(gòu)域 -折疊域；,定義 多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)、超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上，主鏈構(gòu)象和側(cè)鏈構(gòu)象相互作用，沿三維空間多方向卷曲，進(jìn)一步盤曲折疊形成特定的球狀分子結(jié)構(gòu)。 在三級(jí)結(jié)構(gòu)中，具有極性側(cè)鏈基團(tuán)的AA殘基幾乎全部在分子的表面,而非極性殘基則被埋于分子內(nèi)部,不與水接確.而形成疏水的核心。,5 蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu),木瓜蛋白酶,組織蛋白酶B,-螺旋,維持三級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力,氫鍵 范德華力 疏水鍵（疏水相互作用） 離子鍵（鹽鍵） 二硫鍵 疏水鍵，在蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)中起著重要作用，它是使蛋白質(zhì)多肽鏈進(jìn)行折疊的主要驅(qū)動(dòng)力。,三級(jí)結(jié)構(gòu)的特征： 含多種二級(jí)結(jié)構(gòu)單元； 有明顯的折疊層次； 是緊密的球狀或橢球狀實(shí)體； 分子表面有一空穴(活性部位)； 疏水側(cè)鏈埋藏在分子內(nèi)部， 親水側(cè)鏈暴露在分子表面。 實(shí)例：肌紅蛋白,肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能,（1）肌紅蛋白的功能： 哺乳動(dòng)物肌肉中儲(chǔ)存氧并運(yùn)輸氧的蛋白。 （2）肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1963年，Kendrew a .一條多肽鏈，153個(gè)氨基酸殘基，一個(gè)血紅素輔基，分子量17600道爾頓。 b.肌紅蛋白的整個(gè)分子具有外圓中空的不對(duì)稱結(jié)構(gòu)，肽鏈共折疊成8段長(zhǎng)度不等的-螺旋體（A-H），最長(zhǎng)的有23個(gè)氨基酸殘基，最短的有7個(gè)氨基酸殘基。拐彎處多由Pro、Ser、Ile、Thr等組成。 c.具有極性側(cè)鏈的氨基酸殘基分布于分子表面，而帶非極性側(cè)鏈的氨基酸殘基多分布于分子內(nèi)部，使肌紅蛋白成為可溶性蛋白。,肌紅蛋白,血紅素輔基,抹香鯨肌紅蛋白（Myoglobin）的三級(jí)結(jié)構(gòu),6 蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu),四級(jí)結(jié)構(gòu)是指由兩 個(gè)或兩個(gè)以上具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈按一定方式聚合而成的特定構(gòu)象的蛋白質(zhì)分子。其中每條多肽鏈稱為亞基。 通常亞基只有一條多肽鏈，但有的亞基由兩條或多條多肽鏈組成，這些多肽鏈間多以二硫鍵相連,亞基單獨(dú)存在時(shí)無生物學(xué)活性。 一般來說具有四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白屬于寡聚蛋白。,定義,維持蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力,在蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)中，亞基之間的作用力主要包括：氫鍵、離子鍵、范德華力和疏水鍵。即亞基之間主要是通過次級(jí)鍵彼此締合在一起。 疏水鍵是最主要的作用力。,血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能,（1）血紅蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： a.是四個(gè)亞基的寡聚蛋白，574個(gè)AA殘基，分子量65000 b.是由相同的兩條鏈和兩條鏈組成四聚體22，成人的血紅蛋白為22、胎兒的血紅蛋白為22 c. 鏈由141AA殘基組成， 鏈由146AA殘基組成。 四條肽鏈的三級(jí)結(jié)構(gòu)與肌紅蛋白相似，各自內(nèi)部有一個(gè)血紅素輔基。 （2）血紅蛋白的功能：存在于動(dòng)物血液的紅細(xì)胞中，具有運(yùn)輸O2和CO2的功能；血紅蛋白還能和H+結(jié)合，從而可以維持體內(nèi)pH.,血紅蛋白四級(jí)結(jié)構(gòu),血紅素輔基,化學(xué)鍵,共價(jià)鍵,次級(jí)鍵,肽鍵,二硫鍵,氫鍵,疏水鍵,鹽鍵,范德華力,一級(jí)結(jié)構(gòu),二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu),三、四級(jí)結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)分子中的共價(jià)鍵與次級(jí)鍵,(一) 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 1.同功蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異性 細(xì)胞色素C是真核細(xì)胞線粒體內(nèi)膜上一種含F(xiàn)e的蛋白質(zhì)，在生物氧化中起傳遞電子的作用。通過植物、動(dòng)物和微生物等數(shù)百種生物的細(xì)胞色素C一級(jí)結(jié)構(gòu)的研究表明： （1）親緣關(guān)系越近，AA順序的同源性越大。 （2）盡管不同生物間親緣關(guān)系差別很大，但與細(xì)胞色素C功能密切相關(guān)的AA順序卻有共同之處，即保守順序不變,五 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能,不同生物與人的細(xì)胞色素C相比較AA差異數(shù)目 黑猩猩 0 雞、火雞 13 牛豬羊 10 海龜 15 狗驢 11 小麥 35 粗糙鏈孢霉43 酵母菌 44,生物 與人不同的AA數(shù)目 黑猩猩 0 恒河猴 1 兔 9 袋鼠 10 牛、豬、羊 10 狗 11 馬 12 雞、火雞 13 響尾蛇 14 海龜 15 金槍魚 21 角餃 23 小蠅 25 蛾 31 小麥 35 粗早鏈孢霉 43 酵母 44,不同生物與人的Cytc的AA差異數(shù)目,圓圈代表分歧點(diǎn),2.蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的變異與分子病 分子病指蛋白質(zhì)分子中由于AA排列順序與正常蛋白質(zhì)不同而發(fā)生的一種遺傳病(基因突變?cè)斐傻?。 鐮刀形貧血?。?病因：血紅蛋白AA順序的細(xì)微變化,-鏈N端氨基酸排列順序 1 2 3 4 5 6 7 8 Hb-A（正常人） Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys Hb-S（患 者） Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys,鐮刀形貧血病：病人體內(nèi)血紅蛋白的含量乃至紅細(xì)胞的量都較正常人少，且紅細(xì)胞的形狀為新月形，即鐮刀狀。此種細(xì)胞壁薄，而且脆性大，極易漲破而發(fā)生溶血；再者，發(fā)生鐮變的細(xì)胞粘滯加大，易栓塞血管；由于流速較慢，輸氧機(jī)能降低，使臟器官供血出現(xiàn)障礙，從而引起頭昏、胸悶而導(dǎo)致死亡。,谷氨酸在生理pH值下為帶負(fù)電荷R基氨基酸，而纈氨酸卻是一種非極性R基氨基酸，就使得HbS分子表面的荷電性發(fā)生改變，引起等電點(diǎn)改變，溶解度降低，使之不正常地聚集成纖維狀血紅蛋白，致使紅細(xì)胞變形成鐮刀狀,輸氧功能下降,細(xì)胞脆弱易溶血.,3.一級(jí)結(jié)構(gòu)的局部斷裂與蛋白質(zhì)的激活,胰島素原與胰島素（牛胰島素原的激活）,(二) 蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,蛋白質(zhì)的功能通常取決于它的特定構(gòu)象。 某些蛋白質(zhì)表現(xiàn)其生物功能時(shí)，構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變整個(gè)分子的性質(zhì)，這種現(xiàn)象稱為別構(gòu)效應(yīng)。 如血紅蛋白是四個(gè)亞基的寡聚蛋白，其與氧的結(jié)合存在別構(gòu)效應(yīng)。而肌紅蛋白只有一個(gè)亞基，不存在別構(gòu)效應(yīng)。,6.1 蛋白質(zhì)的性質(zhì) （一）蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量（自學(xué)） （二）蛋白質(zhì)的兩性電離性質(zhì)和等電點(diǎn) （三）蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性 （四）蛋白質(zhì)膠體性質(zhì) (五) 蛋白質(zhì)的沉淀 (六）蛋白質(zhì)呈色反應(yīng) （七）蛋白質(zhì)的測(cè)定 6.2 蛋白質(zhì)的分離、分析技術(shù)（自學(xué)）,六 蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù),(二) 蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點(diǎn),蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)：當(dāng)溶液在某一定pH值時(shí)，使某特定蛋白質(zhì)分子上所帶正負(fù)電荷相等，成為兩性離子，在電場(chǎng)中即不向陽(yáng)極移動(dòng)也不向陰極移動(dòng)，此時(shí)溶液的pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場(chǎng)中不移動(dòng)。 在外液pH低于等電點(diǎn)的溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，在電場(chǎng)中向負(fù)極移動(dòng)；在外液pH高于等電點(diǎn)的溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)電泳帶電粒子在電場(chǎng)中移動(dòng)的現(xiàn)象。,參見p50,6.1 蛋白質(zhì)的性質(zhì) （一）蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量（自學(xué)）,參見p51,電泳,蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)pH條件下，不發(fā)生電泳現(xiàn)象。 利用蛋白質(zhì)的電泳現(xiàn)象，可以將不同帶電性質(zhì)和不同大小、形狀的蛋白質(zhì)分子進(jìn)行分離純化。 根據(jù)蛋白質(zhì)凈電荷的差異來分離蛋白質(zhì)的一種方法是電泳法。,(三) 蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性 A、蛋白質(zhì)的變性定義 天然蛋白質(zhì)因受物理、化學(xué)因素的影響，使蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象發(fā)生了異常變化，從而導(dǎo)致生物活性的喪失以及物理、化學(xué)性質(zhì)的異常變化。但一級(jí)結(jié)構(gòu)未遭破壞，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性。,參見p52,B、引起蛋白質(zhì)變性的主要因素：,1.物理因素： 加熱、高壓、紫外線照射、X-射線、超聲波、劇烈振蕩和攪拌等 2.化學(xué)因素： 強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、脲、去污劑（十二烷基硫酸鈉（SDS）、重金屬鹽、三氯醋酸、濃乙醇等。,C、蛋白質(zhì)的變性后的表現(xiàn),生物活性喪失；溶解度降低，對(duì)于球狀蛋白粘度增加；光吸收系數(shù)增大；生物化學(xué)性質(zhì)改變。 組分和分子量不變。,D、蛋白質(zhì)變性的本質(zhì)： 分子中各種次級(jí)鍵斷裂，使其空間構(gòu)象從緊密有序的狀態(tài)變成松散無序的狀態(tài)，一級(jí)結(jié)構(gòu)不破壞。 變性后的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上雖有改變，但組成成分和相對(duì)分子質(zhì)量不變。,E、蛋白質(zhì)的復(fù)性,定義：如果引起變性的因素比較溫和，蛋白質(zhì)構(gòu)象僅僅是有些松散時(shí)，當(dāng)除去變性因素后，可根據(jù)熱力學(xué)原理緩慢地重新自發(fā)折疊恢復(fù)原來的構(gòu)象，這種現(xiàn)象稱作復(fù)性。,核糖核酸酶變性與復(fù)性作用,天然狀態(tài)，有催化活性,非折疊狀態(tài)，無活性,變性,天然狀態(tài) S-S-鍵恢復(fù) 而且是正確配對(duì),如：NH3、COO 、OH、-SH、-CONH-等，它們都具有高度的親水性，當(dāng)與水接確時(shí)，極易吸附水分子，使蛋白質(zhì)顆粒外圍形成一層水化膜，將顆粒彼此隔開，不致因互相碰撞凝聚而沉淀。,(四)蛋白質(zhì)膠體性質(zhì),由于蛋白質(zhì)分子量很大，在水溶液中形成直徑1-100nm之間的顆粒，已達(dá)到膠體顆粒范圍的大小，因而具有膠體溶液的通性。 蛋白質(zhì)的水溶液能形成穩(wěn)定的親水膠體的原因： 、蛋白質(zhì)多肽鏈上含有許多極性基團(tuán)。 2、蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在非等電狀態(tài)時(shí)，相同蛋白質(zhì)顆粒帶有同性電荷，與周圍的反離子構(gòu)成穩(wěn)定的雙電層。使蛋白質(zhì)顆粒之間相互排斥，保持一定距離，不致互相凝聚而沉淀。 蛋白質(zhì)溶液由于具有水化層與雙電層兩方面的穩(wěn)定因素，所以作為膠體系統(tǒng)是相對(duì)穩(wěn)定的。,參見p54,蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)的應(yīng)用,由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。 透析法：以半透膜提純蛋白質(zhì)的方法叫透析法 半透膜：只允許溶劑小分子通過，而溶質(zhì)大分子不能通過，如羊皮紙、火棉膠、玻璃紙等,(五)蛋白質(zhì)的沉淀,蛋白質(zhì)在溶液中的穩(wěn)定性是有條件的、相對(duì)的。如果加入適當(dāng)?shù)脑噭┦沟鞍踪|(zhì)分子處于等電點(diǎn)狀態(tài)或失去水化層（消除相同電荷，除去水膜），蛋白質(zhì)膠體溶液就不再穩(wěn)定并將產(chǎn)生沉淀。 定義：蛋白質(zhì)在溶液中靠水膜和電荷保持其穩(wěn)定性，水膜和電荷一旦除去，蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性就被破壞，蛋白質(zhì)就會(huì)從溶液中沉淀下來，此現(xiàn)象即為蛋白質(zhì)的沉淀作用。,參見p54,1 可逆沉淀,定義：在溫和條件下，通過改變?nèi)芤旱膒H或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。 在沉淀過程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀。 可逆沉淀是分離和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等。,(1)鹽析 在蛋白質(zhì)的水溶液中，加入大量高濃度的強(qiáng)電解質(zhì)鹽如硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等，可破壞蛋質(zhì)分子表面的水化層，中和它們的電荷，因而使蛋白質(zhì)沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析。 而低濃度的鹽溶液加入蛋白質(zhì)溶液中，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度增加，該現(xiàn)象稱為鹽溶。 鹽析的機(jī)理： 破壞蛋白質(zhì)的水化膜，中和表面的凈電荷。 鹽析法是最常用的蛋白質(zhì)沉淀方法，該方法不會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。,各種蛋白質(zhì)的親水性及荷電性均有差別，因此不同蛋白質(zhì)所需中性鹽濃度也有不同，只要調(diào)節(jié)中性鹽濃度，就可使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分散沉淀析出，這種方法稱為分段鹽析。,(2)弱酸或弱堿沉淀法(等電點(diǎn)沉淀） 用弱酸或弱堿調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH處于等電點(diǎn)處，使蛋白質(zhì)沉淀。 弱酸或弱堿沉淀法機(jī)理： 破壞蛋白質(zhì)表面凈電荷。,酸,酸,堿,堿,堿,酸,溶液中蛋白質(zhì)的聚沉,(3) 有機(jī)溶劑沉淀法： 在蛋白質(zhì)溶液中，加入能與水互溶的有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等，蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀。 有機(jī)溶劑沉淀法的機(jī)理： 破壞蛋白質(zhì)的水化膜。 注意：有機(jī)溶液沉淀蛋白質(zhì)通常在低溫條件下進(jìn)行，否則有機(jī)溶劑與水互溶產(chǎn)生的溶解熱會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。,2 不可逆沉淀,定義：在強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。 由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。 如加熱沉淀（次級(jí)鍵）、強(qiáng)酸堿沉淀（影響電荷）、重金屬鹽沉淀（Hg2+、 Pb2+ 、Cu2+、 Ag2+）和生物堿試劑或某些酸類沉淀等都屬于不可逆沉淀。,(1)重金屬鹽沉淀(條件：pH 稍大于pI為宜) 當(dāng)pH 稍大于pI時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷這樣就容易與重金屬離子結(jié)合成不溶性鹽而沉淀。 重金屬沉淀法的機(jī)理： 重金屬鹽加入之后，與帶負(fù)電的羧基結(jié)合。,(2)生物堿試劑沉淀法（條件：pH稍小于pI） 生物堿是植物組織中具有顯著生理作用的一類含氮的堿性物質(zhì)。 能夠沉淀生物堿的試劑稱為生物堿試劑。生物堿試劑一般為弱酸性物質(zhì)，如單寧酸、苦味酸、三氯乙酸等。 生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)的機(jī)理： 在酸性條件下，蛋白質(zhì)帶正電，可以與生物堿試劑的酸根離子結(jié)合而產(chǎn)生沉淀。 例如：“柿石癥”,(3)加熱變性沉淀法 幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固。少量鹽促進(jìn)蛋白質(zhì)加熱凝固。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)，加熱凝固最完全和最迅速. 如：煮雞蛋,(六) 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) (自學(xué)),雙縮脲反應(yīng) 酚試劑反應(yīng) 蛋白質(zhì)定量、定性 茚三酮反應(yīng) 測(cè)定常用方法,另外還有：蛋白黃色反應(yīng)、米倫氏反應(yīng)、乙醛酸反應(yīng)等。,參見p55,雙縮尿在堿性溶液中能與硫酸銅發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生紅紫色絡(luò)合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。,紅紫色絡(luò)合物,180C,雙縮脲反應(yīng),蛋白質(zhì)在遠(yuǎn)紫外光區(qū)（200-230nm）有較大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用這一特性對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性定量鑒定。,測(cè)定范圍：0.10.5mg/ml,(七) 蛋白質(zhì)的含量測(cè)定 (自學(xué)),考馬斯亮藍(lán)染色法、紫外吸收法、凱氏定氮法等,參見p55-56,本章總結(jié),蛋白質(zhì)的分類。蛋白質(zhì)的功能 蛋白質(zhì)的組成（元素組成、化學(xué)組成）及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 20種氨基酸的結(jié)構(gòu)、分類及名稱（三字縮寫符、單字縮寫符） 氨基酸的重要理化性質(zhì)：兩性解離、茚三酮顯色、與2,4-二硝基氟苯（DNFB）反應(yīng)、與異硫氰酸苯酯（PITC）的反應(yīng) 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)：肽、肽鍵、活性多肽及一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定 蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)：二級(jí)結(jié)構(gòu)單元（ -螺旋、-折疊、 -轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲）、三級(jí)與四級(jí)結(jié)構(gòu)（超二級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、亞基）及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 蛋白質(zhì)的性質(zhì)：大分子性質(zhì)、蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定（離心法、凝膠過濾法、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法）、兩性電離（等電點(diǎn)、電泳、離子交換）、膠體性質(zhì)、蛋白質(zhì)沉淀（可逆沉淀、不可逆沉淀）、蛋白質(zhì)變性、紫外吸收及顏色反應(yīng) 8. 蛋白質(zhì)的分離、分析技術(shù),課外作業(yè) P61-62思考題 ：3、4、6、8,