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1、細胞培養(yǎng)技術(shù),藺帥 2013年4月,1,.,主要內(nèi)容,2,.,細胞簡介,細胞是生命活動的基本單位 1665年英國學(xué)者Robert Hooke,用自制的顯微鏡觀察軟木的薄片,第一次發(fā)現(xiàn)植物的細胞結(jié)構(gòu),并首次借用拉丁文Cella(小室)詞.,3,.,細胞簡介,細胞是生命活動的基本單位 1983-39德國植物學(xué)家施萊登和動物學(xué)家施旺確立了“細胞學(xué)說”的基本原則 1、細胞是有機體,動植物都是由細胞發(fā)育來的 2、每個細胞都作為一個相對的獨立單位,有自己的“生命” 3、新的細胞可以通過老的細胞繁殖產(chǎn)生,4,.,細胞培養(yǎng)技術(shù)平臺,5,.,細胞的培養(yǎng)具體方法與步驟,細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)(cell culture)
2、 的含義,簡單地說即是把來自機體的組織經(jīng)分散成為單個細胞,放在類似于體內(nèi)的體外環(huán)境中生存,使其不斷生長、繁殖或傳代,借以觀察細胞的生長、繁殖、衰老等生命現(xiàn)象。細胞培養(yǎng)技術(shù)在遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、病毒學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域已得到廣泛的應(yīng)用 原代培養(yǎng) 傳代培養(yǎng),6,.,細胞的培養(yǎng)具體方法與步驟,原代培養(yǎng) 用直接從機體獲得的細胞進行的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。這種培養(yǎng)過程主要是采用無菌操作的方法,把組織(或器官)從動物體內(nèi)取出,經(jīng)酶消化處理,使分散成單個細胞,然后在人工條件下培養(yǎng),使其不斷地生長和繁殖。原代培養(yǎng)是建立各種細胞系的第一步。,7,.,細胞的培養(yǎng)具體方法與步驟,傳代培養(yǎng) 傳代培養(yǎng)是指細胞從一個培養(yǎng)
3、瓶以1:2或其他比率轉(zhuǎn)移,接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)細胞的傳代通常是采用胰蛋白酶消化,把細胞分散成單細胞再傳代,而懸浮型生長細胞則用直接傳代法或離心法傳代。,8,.,HEK293T和HEK293細胞,HEK293細胞簡介,HEK293細胞在倒置顯微鏡下的形態(tài),9,.,HEK293T和HEK293細胞,HEK293細胞簡介 HEK293細胞株是轉(zhuǎn)染腺病毒E1A基因的人胚腎上皮細胞,由于容易轉(zhuǎn)染且容易培養(yǎng),常被用于轉(zhuǎn)染試驗。,10,.,HEK293T和HEK293細胞,瞬時轉(zhuǎn)染 在瞬時轉(zhuǎn)染中重組DNA導(dǎo)入感染性強的細胞系已獲得目的基因暫時但高水平的表達。轉(zhuǎn)染的DNA不必整合進宿主染色體,當用
4、大量的樣品需要在短時間內(nèi)分析時,尤其是在轉(zhuǎn)然后的1-4天內(nèi)收獲細胞,所得的溶解產(chǎn)物用于檢測目的基因的表達,可以采用瞬時表達的方式。 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 這種細胞系中轉(zhuǎn)染的目的基因整合到宿主染色體DNA中并指導(dǎo)適量的目的蛋白的合成。一般來說轉(zhuǎn)染細胞的效率要比瞬時轉(zhuǎn)染的效率低1-2個數(shù)量級。,11,.,HEK293細胞,HEK293細胞生長條件 完全培養(yǎng)基 10%的胎牛血清 DMEM(4.0mM L-谷氨酰胺 4500mg/ml葡萄糖 ) 1%雙抗(1000units /L penicillin 1000mg/L streptomycin) 37 5%CO2,12,.,無菌技術(shù),制定好實驗計劃和操作程序(準
5、備好實驗過程中的一切用品) 洗手和著裝(75%酒精消毒) 進入超凈臺中的所有物品均需消毒 操作野消毒,13,.,細胞培養(yǎng)耗材,14,.,HEK293細胞的傳代,待細胞的融合率達到90%時進行傳代。 棄去舊細胞液 4遇冷的DPBS(不含Ca2+ 、Mg2+)4ml沖洗后棄液 加入0.05%(37 預(yù)溫 )胰酶消化 加入12ml完全培養(yǎng)基(37 預(yù)溫 )將細胞從細胞瓶底部沖下 1:4傳代即取3ml細胞懸液加入有9ml完全培養(yǎng)基的新細胞瓶中 放入37、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng),15,.,HEK293細胞的傳代,加入0.05%胰酶消化,16,.,HEK293細胞的傳代,17,.,HEK293細胞的凍存,隨著
6、傳代的次數(shù)增加,293細胞會出現(xiàn)生長狀態(tài)下降,出現(xiàn)突變等。所以要在細胞購進時就進行大量凍存,以保證實驗的穩(wěn)定性和持續(xù)性。 在細胞對數(shù)生長期進行凍存,增加細胞復(fù)蘇成活率。 原則:慢凍,18,.,HEK293細胞的凍存,凍存前的準備 DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清):試驗前置室溫下。 0.05%的胰酶消化液:37預(yù)溫。 程序凍存盒(加250ml異丙醇)、二甲基亞砜(DMSO)、2ml細胞凍存管(標記細胞名稱、代數(shù)、日期)、DPBS(不含鈣鎂),19,.,HEK293細胞的凍存,凍存前的準備,20,.,HEK293細胞凍存步驟,配制細胞凍存液 取50ml無菌離心管,于超凈臺內(nèi),加入適量DMEM
7、培養(yǎng)基(含10%胎牛血清),再逐滴加入二甲基亞砜(DMSO)至20%濃度,即制成雙倍的凍存液,置室溫下待用。,21,.,HEK293細胞凍存步驟,取準備凍存的細胞,棄去培養(yǎng)基,以DPBS2-3ml洗細胞一次,加入0.5-1.0ml 0.05%的胰酶消化,加入新鮮培養(yǎng)基10-12ml吹打成細胞懸液,收集細胞懸液至50ml無菌離心管,1000rpm,5min離心.棄上清,加入適量培養(yǎng)基,取與細胞懸液等量的凍存液,緩慢逐滴加入細胞懸液,DMSO最后濃度為10%,22,.,HEK293細胞凍存步驟,細胞濃度為15106cells/ml(細胞計數(shù)),分裝于已標示完全之細胞凍存管中,將細胞凍存管放入程序凍
8、存盒中(已加250ml異丙醇),置-80超低溫冰箱,第二天將細胞放入液氮灌,并記錄,23,.,HEK293細胞凍存步驟,細胞凍存的注意事項 欲冷凍保存之細胞應(yīng)在生長良好且存活率高之狀態(tài) 冷凍保護劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級等級,無菌且無色,以小體積分裝,4避光保存 低溫損傷主要發(fā)生在0-60這一溫度區(qū)內(nèi),這一溫度范圍內(nèi)不宜過久,24,.,HEK293細胞的復(fù)蘇,當細胞傳代次數(shù)過多(超過50代),細胞狀態(tài)變差時或細胞出現(xiàn)污染事故時,需要丟棄并對開始凍存的細胞進行復(fù)蘇 原則:快復(fù),25,.,HEK293細胞的復(fù)蘇,復(fù)蘇前的準備 DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清):試驗前置室溫下 將水浴鍋預(yù)熱至
9、37 取新培養(yǎng)瓶(75cm2),標記細胞編號、時間,加入10ml DMEM培養(yǎng)基(37預(yù)熱),潤濕底面,26,.,HEK293細胞復(fù)蘇步驟,根據(jù)凍存記錄從液氮灌中取出凍存的細胞,迅速投入已經(jīng)預(yù)熱至37 的水浴鍋中,并快速晃動,在1-2 min內(nèi)使完全融化,用酒精擦拭凍存管的外壁,再拿入超凈臺內(nèi),有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶,輕輕混勻,置37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),次日換液,27,.,細胞培養(yǎng)的常見問題與解決方案,一、細胞培養(yǎng)污染問題 二、何時須更換培養(yǎng)基 三、可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基 四、細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時, 是否應(yīng)馬上去除DMSO,28,.,細胞污染問題與解決方案,細胞污染 細胞培養(yǎng)中最大
10、的敵人污染 包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中對細胞生存有害的成份和造成細胞不純的異物(真菌、細菌、病毒和支原體)、化學(xué)物質(zhì)及細胞,29,.,細胞污染問題與解決方案,細胞污染的原因 無菌操作技術(shù)不當 操作室環(huán)境不佳 培養(yǎng)基或者血清的污染,30,.,細胞污染問題與解決方案,細胞的細菌污染 最常見的有革蘭氏陽性菌,如枯草桿菌以。革蘭氏陰性菌,如大腸桿菌、假單胞菌等。其中又以白色葡萄球菌較常見。 細菌污染后,會很快出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁,pH改變。也有少數(shù)培養(yǎng)液肉眼觀察無多少改變,只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染。,31,.,細胞污染問題與解決方案,細胞的細菌污染檢測 16S RNA PCR法,32,.,細胞污染問題與解決
11、方案,常見的細菌污染,白色鏈球菌污染以及革蘭氏染色圖片,33,.,細胞污染問題與解決方案,細胞的真菌污染 梅雨季節(jié)進行細胞培養(yǎng)更易污染。污染培養(yǎng)細胞的多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。 真菌污染后,霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物。,34,.,細胞污染問題與解決方案,細胞的真菌污染檢測 鏡檢有絲狀物,35,.,細胞污染問題與解決方案,常見的真菌污染,真菌污染,霉菌污染,36,.,細胞污染問題與解決方案,細胞的支原體污染 細胞培養(yǎng)過程中,支原體感染發(fā)生率達到63%,因而細胞培養(yǎng)過程中被支原體污染是一個世界性的難題 細胞被支原體污染后,細胞內(nèi)的DNA、RNA及蛋
12、白表達發(fā)生改變,而細胞的生長率一般并未發(fā)生顯著的影響,因而細胞被支原體污染一般難以察覺。,37,.,細胞污染問題與解決方案,細胞的支原體污染檢測 試劑盒檢測法: 目前已有專門做支原體檢測的試劑盒,可以用細胞滴片進行檢測 間接免疫熒光法和免疫印跡:簡便、快速、特異性,38,.,細胞污染問題與解決方案,常見的支原體污染,支原體污染的電鏡下圖片,39,.,細胞污染問題與解決方案,細胞污染的解決方法 控制環(huán)境污染;嚴格實驗操作 原則上棄掉 加抗生素 污染后清除用藥需采用大于常用量510倍的沖洗法,于加藥后作用2448小時,再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效。,40,.,細胞污染問題與解決方案,細胞污染
13、的解決方法 加抗生素,41,.,細胞污染問題與解決方案,何時需更換細胞液 視細胞生長密度而定, 或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間,按時更換培養(yǎng)基即可,42,.,細胞污染問題與解決方案,何時需更換細胞液 視細胞生長密度而定, 或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間,按時更換培養(yǎng)基即可,43,.,細胞污染問題與解決方案,可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基 不能,每一細胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細胞培養(yǎng)基若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基, 細胞大都無法立即適應(yīng), 造成細胞無法存活,44,.,細胞污染問題與解決方案,細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時, 是否應(yīng)馬上去除DMSO 除少數(shù)特別注明對DMSO 敏感之
14、細胞外, 絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞), 在解凍之后, 應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中, 待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可, 如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。,45,.,細胞間的操作注意事項,未經(jīng)許可,任何人不得進入細胞間。 不得在細胞間內(nèi)做任何與試驗無關(guān)之事。 不得攜帶任何與實驗無關(guān)或可能導(dǎo)致污染的物品進入細胞間。 必須隨時保持細胞間的整潔、衛(wèi)生,及時清理雜物、垃圾。 所有設(shè)備、物品,使用后必須及時歸位。 進入細胞間必須更換細胞間專用拖鞋與工作服。不得將細胞間專用拖鞋與工作服傳出細胞間外。 進入細胞間必須養(yǎng)成隨手關(guān)門習慣。操作期間,細胞間外門
15、和中門必須處于關(guān)閉狀態(tài)。,,.,46,細胞間的操作注意事項,操凈工作臺實驗前和試驗后的滅菌,打開紫外燈15-20分鐘。 試驗操作期間,應(yīng)戴手套。并注意隨時用75%酒精消毒雙手。 實驗操作期間,操凈工作臺的風機應(yīng)處于打開狀態(tài)。操作結(jié)束后,關(guān)閉擋板、關(guān)閉風機。 凡是帶入操凈工作臺內(nèi)的酒精、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶等到額瓶子均要用75%酒精擦拭瓶子的外表面。 使用倒置顯微鏡前,用75%酒精擦拭消毒載物臺 使用二氧化碳培養(yǎng)箱時,應(yīng)盡量縮短開門時間,減少開門次數(shù)。 每次倒置顯微鏡觀察細胞后,用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶,適當旋松瓶蓋,再放入放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。,,.,47,細胞間的操作注意事項,每一個人操作結(jié)
16、束后,必須及時清理操凈工作臺內(nèi)的物品,不得在工作臺內(nèi)留置或堆積雜物。 清理操凈工作臺后,用75%酒精擦拭消毒操凈工作臺面。 每一個操作結(jié)束后,必須及使用84消毒液消毒管道,并清理廢液瓶,及時棄去廢液。 操作結(jié)束后,確認倒置顯微鏡電源關(guān)閉。 操作結(jié)束后,確認二氧化碳培養(yǎng)箱的兩道門均處于關(guān)閉狀態(tài)。 離開細胞間前,確認空調(diào)已關(guān)閉(夏季高溫季節(jié)除外)。 每日最后一人離開細胞間前,打開紫外燈消毒。 進入或離開細胞間時,注意觀察二氧化碳鋼瓶上的壓力表壓力是否正常(減壓閥出氣口的壓力應(yīng)在0.06-0.08Mpa之間)。 注意定期檢查液氮罐內(nèi)液氮量,及時添加。 定期打掃細胞間:每周打掃一次,先用自來水拖地、擦桌子、操凈工作臺等,然后用3蘇爾或者新潔爾滅或者5%過氧乙酸擦拭,48,.,Thank You !,49,.,