影視資源在高中歷史教學(xué)中的運用探究——以《從中日甲午戰(zhàn)爭到八國聯(lián)軍侵華》為例

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1、 青島大學(xué) 研究生學(xué)位論文 應(yīng)用SELDI--TOF--MS技術(shù)篩選初期胃癌血清生物標(biāo)志物研究 姓名：李春偉 申請學(xué)位級別：研究生 專業(yè)：一般外科 指引教師：張佃良 0517 應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)篩選初期胃癌血清分子標(biāo)志物研究 摘要 目的：應(yīng)用表面加強(qiáng)解吸電離一飛行時間質(zhì)譜(surface-erthancod laser desorption／ionization time．of-flight mass spectrometry，SELDI．TOF．MS)技術(shù)對胃癌

2、 患者血清蛋白指紋圖譜進(jìn)行分析，篩選候選腫瘤標(biāo)志物以建立診斷模型，尋找更可 靠的評價原則用于初期胃癌診斷和臨床分型以指引個體化治療，旨在進(jìn)一步提高對 腫瘤分期和預(yù)后的判斷，以更好地監(jiān)測治療效果。 措施：表面加強(qiáng)解吸電離一飛行時間質(zhì)譜技術(shù)及其配套蛋白質(zhì)芯片檢測169例胃 癌患者和83．例健康人的血清蛋白質(zhì)組圖譜，運用Biomarker Wizard TM和 Biomarker PatternsTM軟件分析解決數(shù)據(jù)篩選具有明確臨床價值的分子標(biāo)記物或其 組合，以進(jìn)行初期分子診斷并建立胃癌診斷分類樹模型。 ’ 成果：胃癌組血清與正常人血清蛋白質(zhì)譜共有34蛋白體現(xiàn)存在記錄學(xué)差別 (p

3、．05)，其中2873 m／z，3163 m／z，4526 m／z，5762 m／z，6121 m／z和7778 m／z 蛋白質(zhì)峰構(gòu)成診斷模型I，可將胃癌與正常人對的分組，敏捷度、特異性分別為 93．49％、91．57％；此外，2873 m／z，6121 m／z和7778 m／z蛋白質(zhì)峰構(gòu)成診斷模型 II，可將初期胃癌與ii／iii／iv期胃癌，其敏感性和特異性分別為89．36％(42／47)、 92．62％(113／122)。 結(jié)論：運用SELDI-0F-MS技術(shù)在人血清中可以篩選到初期胃癌迅速診斷的特異 性標(biāo)志物，建立初期胃癌診斷的蛋白質(zhì)模型；該措施在胃癌診斷特別初期胃癌診斷 方面具

4、有重要的價值，值得進(jìn)一步研究。 研究生研究生：李春偉一般外科 指引教師：張佃良專家主任醫(yī)師 核心詞：胃癌 分子標(biāo)志物表面加強(qiáng)解吸電離一飛行時間質(zhì)譜 蛋白 質(zhì)組模式． ／y2 “0 m4n”3哺刪9眥4、、＼＼呱8 Analysis of serum biomarkers screening for diagnosis of stage I gastric cancer using SELDI-TOF-MS Abstract Objective：To make a proteomic analysis us

5、ing surface-enhanced laser desorption／ionization time—of=-flight mass spectrometry(SELDI-TOF—MS)on the serum of stage I gastric cancer patients and establish a early diagnostic model for identifying stage I gastric cancer preliminarily． Methods：Serum samples from 1 69 gastric cancer patients and

6、83 age and gender-matched healthy individuals were analyzed by SELDI·-TOF·-MS Protein Chip array technology．The resulting SELDI··TOF——MS spectral data were analyzed using the Biomarker Wizard TM and Biomarker PatternsTM software to f'md differential proteins and develop a classification tree for gas

7、tric carlcer． Results：A total of 34 mass peaks were identified．Six peaks at mass：charge ratios(nVz) of2873，3 163，4526，5762，6121 and 7778 were used to construct the diagnostic model I． The model I could effectively distinguish gastric cancel-samples from control samples， achieving a sensitivity

8、 and specifici夠of 93．49％and 91．57％，respectively．In addition, we identified three of the six protein peaks at 2873，6121and 7778m／z，which could construct the diagnostic model II．The model II could distinguish between stage I gastric cancer and stage II／III／N gastric CallCeT wim all accuracy of 9 1．72％

9、． Conclusion：Diagnostic models of serums proteins detects by SELDI-·TOF··MS Protein Chip array technology correctly distinguishes gastric CanCgl"from controls，and has significance for screening stage I gastric cancfeT from stage II／Ⅲ／Ⅳgastric cancer．SEI DI—FOF-MS is a useful tool for the detectio

10、n and identification of new proton markers． Key word：gastric cancer biomarkers SELDI-TOF—MS Serum Proteomic Patterns 引言 引言 胃癌是消化系統(tǒng)常用惡性腫瘤之一，在世界范疇內(nèi)為第四多發(fā)惡性腫瘤和第二 致死性腫瘤，值得注意的是幾乎近三分之二的胃癌發(fā)生在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)的地區(qū)或國家， 涉及中國n喇。近年來，雖然隨著上消化道造影、內(nèi)鏡活檢、術(shù)前新輔助治療、術(shù)后 綜合治療等診斷水平的提高，胃癌五年生存率有所提高

11、，但效果仍欠抱負(fù)。據(jù)報道， 初期胃癌(I期胃癌)五年生存率可達(dá)82．9％、II期胃癌62．8％、III期胃癌17．8％、 IV期胃癌3．3％，總體五年生存率20％左右口嘲。一般覺得影響胃癌預(yù)后的重要因素是 腫瘤的分期，分期越早，預(yù)后越好；初期診斷胃癌是最有效減少死亡率、提高治愈 率的措施。因此，有必要對初期胃癌診斷的措施進(jìn)行摸索和研究。 目前，內(nèi)鏡活檢、手術(shù)切除腫瘤進(jìn)行病理學(xué)檢查被覺得是胃癌診斷的金原則， 但這種技術(shù)具有諸多弊端，其缺陷如耗費時間長、費用貴、給病人帶來諸多不適， 更重要的是，諸多病人得到明確診斷后，即發(fā)展成進(jìn)展期胃癌甚至晚期胃癌，治療 效果較差：此外，內(nèi)窺鏡活檢送病理或手

12、術(shù)切除后送病理無法制定人口眾多的篩查 方案睜"。因此，有必要摸索研究創(chuàng)傷小、費用低、便于篩查，具有高度特異性和靈 敏度的腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行初期胃癌的診斷。 自進(jìn)入20世紀(jì)80年代以來，人們已經(jīng)開始在胃癌患者外周靜脈血中尋找與胃癌 有關(guān)的生物標(biāo)志物，以期可以對初期胃癌進(jìn)行盡早診斷。目前發(fā)現(xiàn)與胃癌有關(guān)的腫 瘤標(biāo)志物重要有癌胚抗原(CEA)和糖鏈抗原19．9(CAl9．9)、125(CAl25)、242(CA242)、 50(CA50)等睜103。但這些指標(biāo)敏感性、特異性均較低，尚局限性于用來進(jìn)行初期胃癌的 診斷。近來大量研究表白，單個腫瘤標(biāo)志物尚局限性用于初期腫瘤的診斷，有不少學(xué) 者運用多種腫瘤

13、標(biāo)志物構(gòu)成一種蛋白質(zhì)組診斷模型進(jìn)行全身多種系統(tǒng)腫瘤的診斷， 例如肝癌‘n1刳、卵巢癌nH"、乳腺癌n蝴1、肺癌乜4刪、前列腺癌嘲訓(xùn)、膀胱癌D2刊、胰 腺癌Ⅲ1、食管癌∞明’大腸癌∞1等疾病的差別蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)多種疾病有關(guān)的候 選蛋白標(biāo)志物。有關(guān)胃癌腫瘤標(biāo)志物的研究也有所報道，只是目前所報道胃癌有關(guān) 標(biāo)記物臨床價值具有不擬定性，這一方面反映了許多研究規(guī)模較小，納入病例數(shù)偏 少，隨訪時間較短，記錄學(xué)報告差；此外目前報道的研究大多數(shù)分析單一腫瘤標(biāo)記 物的臨床價值，對聯(lián)合應(yīng)用幾種標(biāo)記的組合分析局限性。因此，還需要高質(zhì)量的設(shè)計 科學(xué)的多中心實驗以得出可靠的結(jié)論，急切需要迸一步研究。 近幾年，

14、新興的表面增強(qiáng)激光解吸電離一飛行時間質(zhì)譜(surface enhanced 1aserdesorption／ionization—time of flight—mass spectrometry technology，’ SELDI-TOF-MS)技術(shù)為差別蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了一種十分抱負(fù)的平臺，同步也為全 身多種系統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物的研究提供了一種抱負(fù)的平臺。SELDI-TOF—MS技術(shù)是由日本 出名科學(xué)家田中耕一發(fā)明，美國Ciphergen Biosyetems公司進(jìn)行進(jìn)一步研究并使之 1 青島大學(xué)研究生學(xué)位論文 商品化。該系統(tǒng)由3部分構(gòu)成：①蛋白質(zhì)芯

15、片；②芯片閱讀器③生物信息學(xué)。該技術(shù) 的原理是芯池中的分析物在激光脈沖輻射的作用下，解析后形成荷電離子，不同質(zhì) 荷比離子在儀器場中飛行時間長短不同，而繪制出一張質(zhì)譜圖案，可以顯示不同蛋 白的相對分子量等信息。(工作示意圖i如下)。SELDI技術(shù)能迅速分析、解決大量質(zhì) 譜圖信息，將測得質(zhì)譜圖與正常人或某種疾病或者疾病不同階段的原則圖譜進(jìn)行對 比，就能捕獲該疾病不同階段特異性的有關(guān)分子蛋白質(zhì)。 蛾 麟 辮 圖1 SELDI-TOF’船工作示意圖 表面加強(qiáng)解吸電離一飛

16、行時間質(zhì)譜(SELDI—TOF—MS)技術(shù)不同與老式的蛋白質(zhì)組 學(xué)技術(shù)，有如下某些長處：(1)1次可以實現(xiàn)上萬種蛋白質(zhì)檢測分析，迅速、簡便、 易行、高通量、平行分析，； (2)需樣品量很少，只需25"-50個細(xì)胞所提取的蛋白 質(zhì)即可； (3)較高的信噪比； (4)可以對小分子量的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定； (5)可以 和基因芯片成果進(jìn)行比較分析，在蛋白質(zhì)組和基因組之間建立聯(lián)系；(6)應(yīng)用多種 未明確性質(zhì)的蛋白質(zhì)或肽信號可聯(lián)合構(gòu)成診斷模型，對全身各系統(tǒng)腫瘤的初期診斷 比單一的腫瘤標(biāo)志物更精確可靠，敏感性特異度更高等。SELDI-TOF-MS技術(shù)克服了 諸多老式蛋白質(zhì)組學(xué)研究中無法解決的問題，實現(xiàn)了蛋白質(zhì)芯

17、片技術(shù)臨床檢測應(yīng)用 的奔騰。高通量的質(zhì)譜技術(shù)為尋找新的標(biāo)志物用于初期腫瘤的診斷和監(jiān)測治療效果， 已經(jīng)成為一種臨床醫(yī)學(xué)研究的新方向。本課題設(shè)計總路線如下圖2。 圖2本課題設(shè)計總路線 3 資料和措施 第一章資料和措施 1．1研究對象 選用我院及青島市立

18、醫(yī)院普外科5月至5月持續(xù)入院的原發(fā)性 胃癌病人作為研究對象。胃癌分期原則按American Joint Conunittcc on Cancer(7th ed， )。所有病人均為漢族，經(jīng)病理證明為胃腺癌，入選病例排除原則如下：(1)年 齡不小于75歲；(2)患有神經(jīng)性厭食、炎性腸病、免疫性疾病和內(nèi)分泌疾患；(3)感 染；(4)幽門梗阻；(5)心力衰竭(心功能不小于3級)、肝衰竭(Child分級C級)、 腎衰竭；(6)近4個周通過外科治療、內(nèi)鏡支架術(shù)、放射治療或化學(xué)治療；(7)經(jīng)受 過可以嚴(yán)重影響新陳代謝或體質(zhì)量的藥物治療。健康人血清標(biāo)本取自本院健康查體 中心，排除原則同胃癌排除原則，并隨訪一年

19、，無胃癌病例發(fā)生。所有研究對象入 組前均獲得病人或家屬的知情批準(zhǔn)，并通過醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。 1．2實驗材料 · 1．2．1重要儀器 1．STS-2脫色搖床(上海琪特分析儀器有限公司) 2．震蕩器MSl Minishaker(廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司(IKA Works Guangzhou ID NO：L001500 3．Refrigerated centrifuge (SIGMA Type：1—15K) 4．Gi lson Pipette (上海肇嘉浜路590號) 5．pH meter(SARTORIUS PB20) 6．Electroni

20、c Balance(rag level)(SARTORIUS BS210S) 7．Tips P2，P20，P200，P1000(AXYGEN) 8．15 ml vial(AXYGEN) ． 9．0．5 ml，1．5 ml Microcentrifuge tube(AXYGEN) 10．高速臺式離心機(jī) 型號：TGL-16B (上海安亭科學(xué)儀器廠) 11．加熱磁力攪拌器 (IKA RH—KT／C) 12．Ul tra-low temperature freezer(-80攝氏度冰箱)(KELON型號：BCD一2 19wAK) 13．一30。攝氏度冰箱 (KELo

21、N型號：BCD-219WAK) 14．自動制冰機(jī)(automatic ice machines)(Grant： FM 70A) 4 青島大學(xué)研究生學(xué)位論文 15．制去離子水機(jī)(or Millipore)(PALL Model：PL5121) 16．SELDI—TOF—MS儀器及其配套的弱陽離子互換芯片(WCX2)(購自美國 ’ Ciphergen公司) 1．2．2重要試劑 1．尿素(urea) 2．乙睛(CAN) 3．三氟乙酸(TFA) 4．芥子酸(SPA) 5．三經(jīng)基甲基氨基甲烷一鹽酸緩沖液(Tris—HCL)

22、 6．經(jīng)基呱嚓乙磺酸(HEPES) ． 7．3一環(huán)乙胺-1-丙磺酸(CHAPS) 8．無水NaAC 9．二硫蘇糖醇(DTT) (以上試劑均購自美國Sigrma公司) 10．U9的配備-5ml： (9M Urea， 50n!lMTris—HCl， 2％CHAPS，pH9．0) 稱取2．709 Urea(MW 60．06，終濃度為9M)，加入HPLC H：O 3ml和1M Tri s—HCI 250ui pH9．0充足溶解；在上述溶液中加入CHAPS 0．1 g充足溶解；再用HPLC H：O定容至4．5ml， pH 9．0，加入DTT 0．059，定容至5ml；分裝入500

23、ul離心管，每管100 ul，封口， 放入-80。C深低溫冰箱保存。 I i．WCX-2 buffer的配備200ml：(50IIlM NaAC，pH4．0) 稱取無水NaAC 0．829，溶 入180ml HPLC心O中；用HCI調(diào)pH4．0，HPLC H20定容至200 ml，4"C保存。 12．其她試劑：HCL，HpLCHZO，生理鹽水等。 1．3實驗措施 1．3．1標(biāo)本采集與解決 所有病例及對照組均于上午抽取空腹靜脈血5ml，4"C靜置2h，然后于4"C以 3000r／：min離心lOmin，吸取上層血清分裝，每管50ul，立即置-80。C深低溫冰箱

24、保存。標(biāo)本采集與解決示意見圖1．1。 5 資料和措施 I 清晨～空腹母取5llII全血 U 4℃靜置靜置2小時 U l 4℃以3湖t／：min離心10mj琢 量} 吸取上層血淆分裝成每管50-J U I立即置一簟℃冰箱保存， 圖1．1標(biāo)本采集與解決示意圖， 1．3．2血清樣品解決 ． ． 1．從．80℃深低溫冰箱中取出血清樣品，放置冰盒上融解； 2．以10，000幣m，4。C離心2分鐘； 3．每個芯片點需要血清3ul，將血清樣品冰浴振蕩30分鐘并用2倍體積U9緩

25、沖液 稀釋； 5．將9ul上述樣品加入108ul相應(yīng)的結(jié)合緩沖液中，使血清樣品的總稀釋倍數(shù)達(dá)到 約40倍，混勻，避免產(chǎn)氣憤泡。 ． 6．將解決好的血清樣品上樣到芯片上。 1．3．3芯片的選擇 ．常用芯片涉及WCX-2(弱陽離子互換芯片)、SAX2(強(qiáng)陰離子互換芯片)、 IMAC．3．Ni(固定金屬親和表面芯片)和H4(疏水芯片)等化學(xué)修飾芯片。其中研究發(fā) 現(xiàn)【32-33]：化學(xué)修飾的WCX-2芯片，有弱陰型離子羧基結(jié)合其表面，通過與被分析 物表面正負(fù)電荷基團(tuán)的互相作用而捕獲蛋白，所得到的蛋白峰較多，蛋白分離效果 較好，且差別明顯、穩(wěn)定性強(qiáng)。本實驗通過預(yù)實驗驗證上述芯片，

26、成果現(xiàn)示W(wǎng)CX．2 芯片所得到的峰最多、蛋白分離效果最佳、差別明顯和穩(wěn)定性強(qiáng)。預(yù)實驗操作流程 (圖1．2)。 6 青島大學(xué)研究生學(xué)位論文 SEL翻囂Q霧壤瞄 {嘲■蟛娜蛐褂 Sample ’ 1溯q警黧■——嘲炒 圖1．2 SELDI．TOF．MS預(yù)實驗操作流程 1．3．4們x．2操作環(huán)節(jié) 1．小心取出WCX-2的芯片，在芯片背后標(biāo)記時間、芯片種類、人血清樣品的姓 名等基本資料。 2。將上述芯片裝入生物芯片解決器(Bioproces

27、sor)中。在組裝生物芯片解決器 時，注意密封。 一 3．在每孔中加入200ul結(jié)合緩沖液(50 mM NaAC，pH 4．0)，置振蕩器400-600 轉(zhuǎn)，分并震蕩5分鐘，再甩掉緩沖液。反復(fù)操作一次。操作時，注意保持芯片每 個點表面濕潤；加緩沖液后要注意觀測芯片表面有無氣泡，如果有氣泡產(chǎn)生， 用取液器吹去，其槍頭不要接觸到芯片上各點的表面。 4．上樣，在芯片解決器每個孔中加入解決好的血清樣品lOOul，置振蕩器400—600 轉(zhuǎn)，分。4"C震蕩1小時。 5．甩出樣品，然后將甩出的樣品甩入預(yù)先裝有消毒劑的容器內(nèi)。 6．每孔加入結(jié)合緩沖液200ul，(50 mM NaAc

28、，pH 4．0)，置振蕩器(400-600轉(zhuǎn) ，分，4℃震蕩5分鐘，甩去孔中液體，再次加入200ul結(jié)合緩沖液，反復(fù)上述 操作一次。 7 ————————————_—_——__-————-————-—_——__--_●-—--_-_l-—————_-_-_-_-I__-—————————————一。． 窒型塑查鯊—— 7．每孔加入HPLC水200ul，然后立即甩出。 8．迅速拆開芯片解決器，取出芯片待干后，在每孔上加SPA 0．5 ul，干后在反復(fù) 加SPA0．5ul一次。 9．待干后，即上機(jī)測定。實驗操作流程示意圖見圖1．3

29、。 圖1．3 SELDI-TOF-MS實驗操作流程示意圖 青島大學(xué)研究生學(xué)位論文 1．4數(shù)據(jù)的采集與成果分析： 運用PBS-C型蛋白質(zhì)芯片閱讀儀讀取數(shù)據(jù)，’每日用原則多肽和原則蛋白質(zhì)分子 校正儀器。蛋白質(zhì)芯片閱讀器設(shè)立如下：檢測敏感度8，激光強(qiáng)度165，優(yōu)化蛋白質(zhì) 荷比范疇—30000kDa，最低信噪比為5，每個樣品收集50個點。采用Biomar

30、ker Wizard軟件分析胃癌組與健康對照組血清蛋白質(zhì)譜差別，兩組之間蛋白峰比較采用 t檢查，擬定兩組之間P

31、 9 成果 第二章成果 2．1實驗對象一般臨床資料 根據(jù)入院納入及排除原則，符合條件的I期胃癌47例；并根據(jù)年齡、性別相匹 配的原則，隨機(jī)選用II期胃癌39例、III期胃癌46例、IV胃癌37例、健康人83 例作為對照組。一般臨床資料見表2．1。 表2．1初期胃癌組與對照組一般臨床資料 注：I期胃癌與健康人、 II／III／IV期胃癌三組間性別、年齡無記錄學(xué)意義。 2．2 WCX-2芯片蛋白質(zhì)譜的反復(fù)性測定 SELDI-TOF-MS質(zhì)譜技術(shù)反復(fù)性測定用質(zhì)控標(biāo)

32、本進(jìn)行，分別在將同一標(biāo)本、同一 芯片上八個點同步檢測(批內(nèi))，并且在非同日檢測的每個芯片上分析(批間)，獲得 蛋白峰位置批間和批內(nèi)變異系數(shù)分別為0．05％和0．04％；蛋白峰原則化強(qiáng)度(峰高) 批間和批內(nèi)變異系數(shù)分別為14％和11％；每日儀器操作及抽樣無明顯差別，本研究結(jié) 果的可靠性可以得到保證。(見圖2．1) 2湖，嘲 ?S00 tOOO@ 笳"協(xié)5 o雄掄“圳|i蚓嘲矧—_叫—刪j糾 一25∞50∞ 750@ lO嘲 圖2．1不同WCX-2芯片不同步間檢測同一血清樣本的蛋白質(zhì)圖 10

33、青島大學(xué)研究生學(xué)位論文 注：橫坐標(biāo)為所測蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比，縱坐標(biāo)為所測蛋白質(zhì)的相對豐度；所用的質(zhì)控 血清在不同步間、不同的WCX-2(弱陽離子互換芯片)芯片進(jìn)行反復(fù)性實驗，顯示 所測蛋白質(zhì)的峰值無明顯變化。 2．3胃癌和健康人之間血清中差別蛋白的檢測 用Biomarker Wi zard軟件對169胃癌組與83例健康人組兩組血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜 圖進(jìn)行比較，成果顯示在質(zhì)荷比范疇-30000kDa范疇內(nèi)共檢測出34個差別蛋白 質(zhì)，將差別蛋白峰導(dǎo)入Biomarker Pattern記錄分析軟件，對胃癌組與健康人組進(jìn) 行記錄分析，成果發(fā)現(xiàn)質(zhì)荷比分別為2873m／z、5762 m／

34、z、4526 m／z、6121 m／z、 3163 m／z、和7778 m／z的6個差別蛋白具有明顯性差別(P<0．05)(表2．2)，可組 成的診斷模型I，可以對的地將胃癌患者與健康人分組，敏感性和特異性分別為 93．49％(158／169)、91．57％(76／83)。它們在質(zhì)荷比橫坐標(biāo)上的分布如圖2．2。 表2．2胃癌和健康人之間血清差別蛋白的相對含量的比較 注：f為胃癌血清中高體現(xiàn)的蛋白，I胃癌血清中低體現(xiàn)的蛋白；胃癌和健康人之 間血清差別蛋白的相對含量的比較具有記錄學(xué)意義，P(t-test)<0

35、．05。 2．4 I期胃癌和II／III／IV期胃癌之間血清差別蛋白的檢測 在相似條件及參數(shù)下，對47例I期胃癌患者與122例II／III／IV期胃癌患者6 個蛋白質(zhì)進(jìn)行對比研究，成果發(fā)現(xiàn)質(zhì)荷比分別為2873、6121、和7778 m／z的3個 差別蛋白具有明顯性差別(P

36、分布如 圖2．5。 成果 表2．3健康人、I期胃癌和II／III／IV期胃癌之間血清差別蛋白的相對含量的比較 注：f為胃癌血清中高體現(xiàn)的蛋白，I胃癌血清中低體現(xiàn)的蛋白；健康人、I期胃 癌和II／III／Iv期胃癌之間血清差別蛋白的相對含量具有記錄學(xué)意義，P

37、癌 與健康人之間血清差別蛋白的體現(xiàn)。 青島大學(xué)研究生學(xué)位論文 健康人、初期胃癌、II／III／IV菇]之間血清差別蛋白的體現(xiàn) ZU 18 Z 16 14 魁12 口健康人 #10 俠 罌8 F'l ii／iii／IV期胃癌 6 T 4 T 2 1-／ l l U 2873 f 6121 f 7778 l m／z 成果 注：橫軸代表蛋白質(zhì)荷比，縱軸代表蛋白相對強(qiáng)度。此質(zhì)譜圖顯示健康人血清蛋白 質(zhì)譜的體現(xiàn)。

38、 圖2．5 I期胃癌和II／I I I／IV期胃癌之間血清差別蛋白的體現(xiàn) 注：橫軸代表蛋白的質(zhì)荷比，縱軸代表蛋白相對豐度。此質(zhì)譜圖顯示I期胃癌和 II／III／IV期胃癌之間血清差別蛋白的體現(xiàn)。質(zhì)荷比為2873m／z、5762 m／z、4526 m／z、 6121 m／z、3163 m／z、和7778 m／z 6個差別蛋白均在胃癌患者中異常體現(xiàn)；質(zhì)荷比 分別為2873m／z、6121 m／z、和7778 m／z的3個差別蛋白均在I期胃癌患者中異常體現(xiàn)。

39、 14 討論 第三章討論 目前，胃癌被覺得是一種多基因，多環(huán)節(jié)的復(fù)雜性疾病，其發(fā)生發(fā)展是多種基 因突變的過程?；虍惓Ｍ蛔冇幸苍S會引起蛋白質(zhì)水平的變化；人血清是一種相稱 豐富并不斷變化的蛋白質(zhì)系統(tǒng)，單一分子標(biāo)記物難以追溯到有關(guān)的細(xì)胞、組織，而 發(fā)現(xiàn)一組與特定細(xì)胞、組織癌變有關(guān)的血清蛋白質(zhì)并對其進(jìn)行研究有也許直接獲取 疾病有關(guān)的特性性分子標(biāo)志物。以蛋白質(zhì)構(gòu)成成分為研究對象的蛋白質(zhì)組學(xué)的措施 為腫瘤初期診斷的研究提供了新的思維模式。從理論上說，任何疾病在浮現(xiàn)病理改 變之前，其細(xì)胞、組織和體液中的蛋白質(zhì)成分及數(shù)量都會有相應(yīng)變化。近來研究表 明，血清、尿液、

40、淋巴液等體液中具有大量與疾病有關(guān)的特異性分子標(biāo)志物，特別 是血液中也許具有大量尚未被發(fā)現(xiàn)的可用作疾病初期診斷的多種分子標(biāo)志物口訓(xùn)。 3、1蛋白質(zhì)組學(xué)的定義及研究措施 一 近年來，隨著人類基因組籌劃全面發(fā)展及完善，后基因組籌劃的概念被許多著 名科學(xué)家提出，并將研究重點集中蛋白質(zhì)水平。蛋白質(zhì)組(proteome)源于蛋白質(zhì) (Pprotein)和基因組(genome)兩個詞的組合，是由澳大利亞出名科學(xué)家Wilkins和 Viiliams在1994年在乎大利一次國際蛋白質(zhì)組學(xué)研討會上第一次提出，重要是指 細(xì)胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)的存在形式及其活動方式，后來引申為一種基因組所體現(xiàn)的全套 蛋白質(zhì)，而

41、一種基因組可涉及一種細(xì)胞乃至一種生物㈨1。目前，蛋白質(zhì)組的確切定 義是：一種細(xì)胞、組織或生物體擁有的全套蛋白質(zhì)，它不僅在同一機(jī)體的不同組織和 細(xì)胞中不同，并且在同一機(jī)體不同生理狀態(tài)、不同發(fā)育階段及不同外界環(huán)境下也有 不同‘馴。 蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是一門新興的學(xué)科，以蛋白質(zhì)組為研究對象，大規(guī)模、 系統(tǒng)地研究蛋白質(zhì)的特性及微細(xì)構(gòu)造m1，特別是蛋白質(zhì)分子水平的研究，涉及蛋白 質(zhì)體現(xiàn)、蛋白質(zhì)間互相作用、翻譯后修飾等，由此獲得疾病發(fā)生發(fā)展過程、細(xì)胞生 理生化特性和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)廣泛、完整的結(jié)識。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究，差別蛋白質(zhì)組學(xué) 越來越受到科學(xué)家注重，并通過疾病組和對照組的比較分析，其在

42、疾病研究中的應(yīng) 用潛能得到充足展示，從而獲得對于疾病發(fā)生發(fā)展及細(xì)胞代謝整體過程全面的結(jié)識 C4t]。蛋白質(zhì)組學(xué)最大的優(yōu)勢是可以在實驗中觀測一種或一組蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞型在 特定期間下，其在生理或病理狀態(tài)所發(fā)生的相應(yīng)變化H引。 3．2蛋白指紋圖譜技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用 蛋白指紋圖譜技術(shù)最早是由許洋博士于本世紀(jì)初在中國提出，并于8月 在《亞太地區(qū)國際腫瘤生物學(xué)和醫(yī)學(xué)暨第21屆國際腫瘤標(biāo)志物學(xué)術(shù)會議》和 年4月《美國第96屆腫瘤年會》上正式報道蛋白指紋圖譜技術(shù)在中國的應(yīng)用。蛋白 15 青島大學(xué)研究生學(xué)文論文 指紋圖譜儀技術(shù)的原理：芯池中的分

43、析物在激光脈沖輻射的作用下，解析后形成荷 電離子，不同質(zhì)荷比離子在儀器場中飛行時間長短不同，而繪制出一張質(zhì)譜圖案。 將所檢測人的蛋白質(zhì)圖譜與正常人原則圖譜相對照，分析有無差別，就懂得這個人 的圖譜是與否患有某種疾病，或是存有某一種或一組尚未探明的新的特異性分子標(biāo) 志物。幾十分鐘或幾分鐘就可以完畢整個質(zhì)譜的測定過程，十分迅速，措施敏感、 特異性高，同步一般不會破壞所測定的蛋白質(zhì)化學(xué)構(gòu)造。 蛋白指紋圖譜技術(shù)通過對蛋白質(zhì)動態(tài)、全程的分析觀測，對疾病初期微小變化 進(jìn)行摸索，將病人全套血清蛋白質(zhì)變化記錄下來：繪制成蛋白指紋圖譜就可以顯示 所測樣品中多種蛋白質(zhì)不同信息，并將這張圖譜原則圖譜進(jìn)行對照，

44、就能發(fā)現(xiàn)捕獲 到與疾病有關(guān)的、新的、敏感性特異性高的血清蛋白質(zhì)及特性。 3．3應(yīng)用SELDI-TOF-MS篩選結(jié)胃癌或初期胃癌血清蛋白標(biāo)志物 近年來，SELDI-TOF-MS技術(shù)在多種腫瘤的研究中已經(jīng)得到越來越多的應(yīng)用。臨 床醫(yī)學(xué)研究表白，初期發(fā)現(xiàn)是腫瘤治療的核心，篩選特異性敏感性高的腫瘤有關(guān)生 物標(biāo)志物對腫瘤的初期診斷和治療具有重要意義。SELDI—TOF—MS技術(shù)重要由蛋白質(zhì) 芯片、芯片閱讀器和生物信息學(xué)3大部分構(gòu)成，具有操作簡便、檢測迅速、多樣本檢 測、敏捷性和特異性高等長處。根據(jù)美國國立腫瘤研究所多中心的三期臨床實驗得 出結(jié)論：SELDI-TOF-MS技術(shù)是目前最有但愿的對

45、腫瘤進(jìn)行初期檢測診斷的技術(shù)。在 蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，蛋白質(zhì)的分離技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的進(jìn)步完善，將 對初期腫瘤進(jìn)行診斷的研究有著重要作用。 本實驗結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和蛋白指紋圖譜技術(shù)，運用SELDI—TOF—MS技術(shù)對實 驗組I期胃癌47例、對照組II期胃癌39例、III期胃癌46例、IV胃癌37例、健 康人83例血清樣品進(jìn)行蛋白檢測，成果發(fā)現(xiàn)質(zhì)荷比分別為2873m／z、5762 m／z、4526 m／z、6121 m／z、3163 m／z、和7778 m／z的6個差別蛋白指紋圖譜具有明顯性差別 (P

46、 特異性分別為93．49％(158／169)、91．57％(76／83)。除此之外，更重要的是6種蛋白 質(zhì)中其中3種質(zhì)荷比為2873m／z、6121 m／z、和7778 m／z的3個差別蛋白指紋圖譜 具有明顯性差別可構(gòu)成的初期胃癌診斷模型II，可以對的地將I期胃癌患者與 II／III／IV期胃癌患者分組，敏感性和特異性分別為89．36％(42／47)、 92．62％(113／122)。我們還需要進(jìn)一步多樣本多中心驗證我們的胃癌診斷模型和初期 胃癌診斷模型，但愿能盡快推向臨床應(yīng)用。 一 、Lti HB[蜘等學(xué)者報道了2046 m／z，3179 m／z，1817 m／z，1725 m／z和1

47、929 m／z 五種蛋白質(zhì)構(gòu)成的胃癌診斷模型，可以把胃癌組與正常人分組，且一種質(zhì)荷比為 16 討論 4665m／z得蛋白質(zhì)可以把I／II期胃癌和III／IV期胃癌分組，敏感度和特異性分別 為91．6％(1 1／12)和95．4％(21／22)。此報道與我們的研究成果有所不同，其因素可 能是所檢測的分子量范疇不同樣，她們分子量范疇(1500“20，000 m／z)不同于我們 的(2，000’30，000 m／z)。Matthias㈨等人運用SELDI—TOF-MS技術(shù)建立初期胃癌診斷 分類樹，敏感度為88．9％(8／9)，病例數(shù)較少，但也為

48、我們大樣本、多中心的研究 指明了研究胃癌初期診斷的方向。SuH53等學(xué)者運用類似技術(shù)也建立了胃癌診斷的蛋 白質(zhì)模型，敏感度、特異性均較高，她們所用芯片為SAX2不同于我們的wcX一2，目 前對于那類芯片好尚沒有權(quán)威性定論，我們通過預(yù)實驗比較，選用WCX一2芯片蛋白 質(zhì)譜體現(xiàn)更清晰。Liang呻1等學(xué)者證明通過研究蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)建議蛋白質(zhì)模型可以 對的把胃癌及正常人分組。我們的研究不僅把胃癌與正常人分組，更重要的是也對 初期胃癌與ii／in／iv期胃癌分組，可以對初期胃癌進(jìn)行診斷，從而提高胃癌治愈 率，改善預(yù)后。 本研究采用回憶性及前瞻性隊列研究，立足于整體角度，對目前報道的腫瘤標(biāo) 志物在

49、重要人腫瘤中以單一或新的組合形式進(jìn)行大規(guī)模驗證，篩選，進(jìn)一步采用血清 蛋白質(zhì)組的措施試圖尋找新的腫瘤標(biāo)記。建立以血清蛋白標(biāo)記為主的人惡性腫瘤早 期診斷，分子分期指標(biāo)體系與有關(guān)原則，國內(nèi)外未見類似大規(guī)模的研究報道。我們 使用SELDL-TOF-MS研究人惡性腫瘤血清特異蛋白標(biāo)記，系統(tǒng)篩選有關(guān)標(biāo)記物及其組 合，將可以提高診斷的精確性。有也許發(fā)現(xiàn)更加精確和可反復(fù)的診斷措施，從而篩 選出用于人惡性腫瘤初期診斷的方案。對這些分子的純化、鑒定等進(jìn)一步分析可以更 進(jìn)一步地理解腫瘤發(fā)病機(jī)理，同步為藥物、生物治療腫瘤提供重要的耙點選擇和理論 支持。 人惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸常常與該腫瘤胚胎發(fā)育和胚胎細(xì)

50、胞與組織分化 限度有關(guān)。目前臨床上存在分期與分型一致但治療效果不同的狀況，通過大規(guī)模系 統(tǒng)篩選將在老式措施基本上發(fā)現(xiàn)與臨床治療效果有關(guān)的也許具有不同發(fā)病機(jī)制的腫 瘤新型分類原則，更注重腫瘤質(zhì)的變化，建立新型人腫瘤的分子定義，特別是引入 耐藥基因檢測，從而對腫瘤個體化治療以及發(fā)病機(jī)制的摸索更具有重要意義；并將是 制定新的腫瘤分期方案，提高人腫瘤治療效果的重要根據(jù)。新型標(biāo)記及其新組合的 臨床意義的發(fā)現(xiàn)對涉及成人惡性腫瘤在內(nèi)的所有腫瘤的研究將具有重要啟示價值。 3．4面臨的闖題與展望 近年來，各國出名科學(xué)家涉及不少諾貝爾獲獎?wù)?，對腫瘤在分子生物學(xué)方面的 行為、特性進(jìn)行了大量的研究摸索，獲

51、得了多項非常有價值的研究成果，但這些研究 成果在減少腫瘤發(fā)生、減少腫瘤引起死亡等方面效果不明顯。美國腫瘤學(xué)界曾經(jīng)公 布一項權(quán)威性的比較研究，顯示自上世紀(jì)70年代以來，雖然不斷有新的初期腫瘤診 17 青島大學(xué)研究生學(xué)文論文 斷和檢測治療效果的措施問世，但是全世界初期腫瘤診斷率及腫瘤致死率并沒有顯 著改善。 ． 表面加強(qiáng)解吸電離～飛行時間質(zhì)譜(SELDI—TOF_MS)技術(shù)在初期胃癌診斷的差別 蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，雖然優(yōu)于老式的蛋白質(zhì)分析技術(shù)，但在臨床實際運用中仍面臨 嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，其局限性如下：不能對所檢測的蛋白質(zhì)直接進(jìn)行鑒定，對蛋白質(zhì)性質(zhì)、空 間構(gòu)

52、造、功能等研究仍需要依賴?yán)鲜降牡鞍阻b定技術(shù)，如激光解析離子化質(zhì)譜儀、 生物信息學(xué)、二維電泳、基質(zhì)輔助等。質(zhì)譜信息的分析解決及分子生物信息學(xué)的廣 泛應(yīng)用尚有待進(jìn)一步研究，芯片制備質(zhì)量均一性、質(zhì)控方面及實驗反復(fù)性評價等問 題的研究尚有待完善。隨著芯片技術(shù)、質(zhì)譜分析技術(shù)及蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)的發(fā)展， 以及在研究措施上新的突破和分子生物信息學(xué)工具的不斷完善，在更高水平上尋找 新的腫瘤有關(guān)功能蛋白組和標(biāo)記物成為也許，從而在腫瘤發(fā)生機(jī)制、診斷、分期和 治療效果檢測中獲得重大突破，同步也為探尋新的診斷措施和治療靶標(biāo)提供有力依 據(jù)，也為胃癌的研究、初期診斷和初期治療帶來新的曙光。通過差別蛋白質(zhì)組學(xué)的 研究，尋找

53、和確立一組初期腫瘤有關(guān)的蛋白質(zhì)特異性分子標(biāo)志物，這些分子標(biāo)志物將 有也許成為發(fā)現(xiàn)初期腫瘤的“利器"。 結(jié)論 結(jié)論=口 J，匕 本研究提示：運用SELDI-TOF-MS技術(shù)在血清中可以篩選到診斷胃癌的特異性蛋 白質(zhì)標(biāo)志物，該措施在胃癌診斷特別初期胃癌診斷方面具有重要的價值，為初期胃癌 的診斷指明研究的方向。 19

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