《醫(yī)學(xué)生物化學(xué)》PPT課件.ppt

第二章,蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能,Structure and Function of Protein,蛋白質(zhì)的分子組成,1,蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及其分離純化,2,3,4,protein ？,含量大,分布廣,種類多,功能繁雜,蛋白質(zhì)的重要性,1,2,3,4,蛋白質(zhì)的生物活性,催化作用,調(diào)節(jié)作用,免疫作用,載體作用,凝血作用,收縮作用,緩沖作用,其它作用,第一節(jié),蛋白質(zhì)的分子組成,組成蛋白質(zhì)的元素,C、H、O、N和S,主要,少量,磷、鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬、碘,蛋白質(zhì)的含氮量平均為16,100克樣品中蛋白質(zhì)的含量 ( g % ) = 每克樣品含氮克數(shù) 6.25100,1/16%,一 氨基酸（amino acid）,氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位,自然界,300余種,人體,僅20種,除G外,均屬L-AA,NH2,H,R,COOH,C,（一）氨基酸的一般結(jié)構(gòu),中心 碳原子,羧基,氨基,氫原子,側(cè)鏈,L-AA,D-AA,蛋白質(zhì)中為L-AA,（二）氨基酸的分類,非極性疏水性氨基酸,1,2,3,4,極性中性氨基酸,酸性氨基酸,堿性氨基酸,非極性疏水性氨基酸,極性中性氨基酸,堿性氨基酸,酸性氨基酸,胱氨酸,半胱氨酸,記憶口訣,甘、丙、纈、亮、異，三、四碳烴基,丙、丁羥絲、蘇，（半）胱、蛋含有硫,酸有天冬、谷，堿有精、賴、組,苯、酪、色、脯環(huán)，中性天、谷胺,要點,編碼AA 20種,除G外均為L-型,P為環(huán)狀亞AA,含羥基AA：S、T、Y,含硫AA：C、M,芳香AA：F、Y、W,支鏈AA：V、L、I,酸性AA：D、E,堿性AA：R、K、H,（二）氨基酸的理化性質(zhì),1. 兩性解離及等電點,解離程度取決于所處溶液的酸堿度,氨基酸是兩性電解質(zhì),等電點(isoelectric point, pI),在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，成為兼性離子，呈電中性。此時溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點。,pH=pI,pHpI,pH<pI,兼性離子,陽離子,陰離子,2.紫外吸收,色氨酸、酪氨酸 最大吸收峰 280 nm,3.茚三酮反應(yīng),在氨基酸與茚三酮水合物共熱，可生成藍(lán)紫色化合物，其最大吸收峰在570nm處。,氨基酸定量分析方法,二 肽（peptide）,肽 氨基酸通過肽鍵縮合而成的化合物,肽鍵(peptide bond) 一個氨基酸的-羧基與另一個氨基酸的-氨基脫水縮合而形成的化學(xué)鍵。,+,甘氨酰甘氨酸,肽鍵,二肽 兩分子氨基酸,三肽 三分子氨基酸,寡肽(oligopeptide) 十個以內(nèi)氨基酸,多肽(polypeptide) 多個氨基酸,多肽鏈(polypeptide chain) 許多氨基酸之間以肽鍵連接而成的一種結(jié)構(gòu),氨基酸殘基(residue) 肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團(tuán)不全,氨基末端（N末端） 自由氨基的一端 羧基末端（C末端） 自由羧基的一端,多肽鏈有兩端,絲氨酰-甘氨酰-酪氨酰-丙氨酰-亮氨酸 (ser-gly-tyr-ala-leu),肽單元（peptide unit）,肽鍵中4個原子C、O、N、H和與之相鄰的 C1、 C2位于同一平面,肽鍵(C-N)具有部分雙鍵的性質(zhì),天然存在的活性肽,谷胱甘肽(glutathione, GSH),肽類激素及神經(jīng)肽,抗生素肽,谷胱甘肽(glutathione, GSH),還原劑,清除H2O2,結(jié)合有害物質(zhì),GSH生物活性,GSH過氧化物酶,GSH還原酶,NADPH+H+,NADP+,肽類激素,促甲狀腺素釋放激素 (TRH),第二節(jié),蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次圖,分子結(jié)構(gòu),一級結(jié)構(gòu) （基本結(jié)構(gòu)）,高級結(jié)構(gòu) （空間結(jié)構(gòu)）,三級結(jié)構(gòu),四級結(jié)構(gòu),-螺旋,-折疊,-轉(zhuǎn)角,不規(guī)則卷曲,二級結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu) (primary structure),肽鏈中氨基酸的數(shù)目及排列順序 包括二硫鍵的數(shù)目和位置,定義,主要化學(xué)鍵,肽鍵 有些蛋白質(zhì)有二硫鍵,牛胰島素的一級結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu) (secondary structure),肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置 不涉及氨基殘基側(cè)鏈的構(gòu)象,定義,主要化學(xué)鍵,氫鍵,-折疊,-轉(zhuǎn)角,無規(guī)卷曲,-螺旋,蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要形式,-螺旋,要點,1,一圈3.6個氨基酸殘基，螺距0.54nm,2,螺旋穩(wěn)定靠氫鍵，與螺旋長軸平行,呈右手螺旋,側(cè)鏈影響螺旋的形成和穩(wěn)定,3,4,-折疊(反平行),-折疊(平行),要點,1,順向平行和反向平行兩種構(gòu)象,2,呈伸展、鋸齒狀結(jié)構(gòu),折疊的穩(wěn)定靠氫鍵,3,4,側(cè)鏈影響折疊的形成和穩(wěn)定,-轉(zhuǎn)角,超二級結(jié)構(gòu)（模體motif）,多肽鏈內(nèi)順序上相互鄰近的二級結(jié)構(gòu)常常在空間折疊中靠近，彼此相互作用，形成規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)聚集體,鈣結(jié)合蛋白,鋅指結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu) (tertiary structure),整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的整體排布,定義,主要化學(xué)鍵是次級鍵,疏水鍵、離子鍵、氫鍵 和 Van der Waals力,肌紅蛋白（Mb）的三級結(jié)構(gòu),血紅素,鐵原子,結(jié)構(gòu)域(domain),結(jié)構(gòu)域是是超二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上形成的一個或數(shù)個球狀或纖維狀的區(qū)域，能各行使其功能；是蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的基本結(jié)構(gòu)單位,細(xì)胞表面蛋白CD4分子4個相似結(jié)構(gòu)域,蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu) (quaternary structure),兩條或多條肽鏈蛋白質(zhì)的每一條具有完整三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈稱為亞基,亞基,化學(xué)鍵,主要 疏水作用 次要 離子鍵、氫鍵,定義,亞基的空間排布,血紅蛋白（Hb）的四級結(jié)構(gòu),鏈,鏈,血紅素,蛋白質(zhì)的分類,根據(jù)組成,結(jié)合蛋白質(zhì),單純蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)部分,非蛋白質(zhì)部分,根據(jù)形狀,球狀蛋白質(zhì),纖維狀蛋白質(zhì),根據(jù)功能,調(diào)節(jié)蛋白,酶蛋白,運(yùn)輸?shù)鞍?結(jié)構(gòu)蛋白,根據(jù)分布,核蛋白質(zhì),膜蛋白質(zhì),第三節(jié),蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu) 與功能的關(guān)系,一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ),一級結(jié)構(gòu)是功能的基礎(chǔ),一級結(jié)構(gòu)改變與分子病,一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ),天然RNaseA（有活性）,天然RNaseA（有活性）,變性RNaseA（無活性）,8M尿素,去掉尿素,分子伴侶(chaperon) 是一類幫助新生多肽鏈正確折疊的蛋白質(zhì),防止肽段錯誤聚集,使錯誤聚集肽段正確折疊,保證二硫鍵的正確形成,分子伴侶功能,一級結(jié)構(gòu)是功能的基礎(chǔ),結(jié)構(gòu)相似，功能相似,胰島素,細(xì)胞色素c,促腎上腺皮質(zhì)激素和促黑激素,一級結(jié)構(gòu)改變與分子病,分子病,由蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導(dǎo)致的疾病,案 例,鐮刀狀紅細(xì)胞性貧血,（a）正常紅細(xì)胞,（ b）鐮型紅細(xì)胞,蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu) 與功能的關(guān)系,空間結(jié)構(gòu)是功能的基礎(chǔ),胰島素原轉(zhuǎn)變成胰島素,蛋白質(zhì)的功能依賴于特定的空間結(jié)構(gòu),胰島素原 （一條肽鏈）,胰島素 （兩條肽鏈）,C肽,肌紅蛋白,血紅蛋白,血紅蛋白的空間構(gòu)象變化與結(jié)合,肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線,協(xié)同效應(yīng) 一個亞基與其配體結(jié)合后，能影響其 中另一個亞基與配體結(jié)合能力的現(xiàn)象,協(xié)同效應(yīng)(cooperativity),正協(xié)同效應(yīng)(positive cooperativity) 促進(jìn)作用,負(fù)協(xié)同效應(yīng)(negative cooperativity) 抑制作用,配體與亞基結(jié)合后引起亞基構(gòu)象變化的效應(yīng),變構(gòu)效應(yīng)(allosteric effect),蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)改變與疾病,蛋白質(zhì)構(gòu)象病（protein conformational diseases）,因蛋白質(zhì)折疊錯誤或折疊導(dǎo)致構(gòu)象異常變化引起的疾病,蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)改變與疾病,朊病毒蛋白(prion protein, PrP),第四節(jié),蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及其分離純化,蛋白質(zhì)的理化性質(zhì),蛋白質(zhì)的等電點( isoelectric point, pI) 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為pI,（一）兩性電離及等電點,pH=pI,pHpI,pH<pI,兼性離子,陽離子,陰離子,P,NH3+,COOH,P,NH3+,COO-,P,NH2,COO-,（二）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì),膠體穩(wěn)定因素,顆粒表面電荷,水化膜,水化膜,（三）蛋白質(zhì)的變性與沉淀,蛋白質(zhì)的變性(denaturation) 在某些理化因素的作用下，蛋白質(zhì)中維系其空間結(jié)構(gòu)的次級鍵（甚至二硫鍵）斷裂，使其空間結(jié)構(gòu)遭受破壞，造成其理化性質(zhì)的改變和生物活性的喪失。,變性因素,變性本質(zhì),破壞非共價鍵和二硫鍵 不改變蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu),加熱、乙醇等有機(jī)溶劑、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬離子及生物堿試劑等,理化性質(zhì)變化,黏度增大,溶解度降低,易被蛋白酶水解,應(yīng)用,消毒,雞蛋要煮熟吃,疫苗保存,蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能,蛋白質(zhì)的復(fù)性(renaturation),天然RNaseA（有活性）,天然RNaseA（有活性）,變性RNaseA（無活性）,8M尿素,去掉尿素,蛋白質(zhì)從溶液中析出,蛋白質(zhì)沉淀,沉淀本質(zhì),破壞水化膜,中和電荷,中性鹽,沉淀方法,有機(jī)溶劑,生物堿試劑,重金屬離子,應(yīng)用,重金屬中毒口服牛奶或生雞蛋,變性與沉淀的關(guān)系,變性,沉淀,容易,不一定,蛋白質(zhì)變性后的絮狀物加熱可變成比較堅固的凝塊，不易再溶于強(qiáng)酸和強(qiáng)堿中,蛋白質(zhì)的凝固作用(protein coagulation),（四）蛋白質(zhì)的光譜吸收與呈色反應(yīng),280nm最大吸收峰 OD280 ：Y、W,蛋白質(zhì)的光譜吸收,雙縮脲反應(yīng),蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng),酚試劑呈色反應(yīng),蛋白質(zhì)的分離和純化,方法 鹽析 有機(jī)溶劑沉淀 調(diào)節(jié)pH 改變溫度,（一）改變蛋白質(zhì)的溶解度,將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀,鹽析(salt precipitation),低溫(04 0C) 快速,有機(jī)溶劑沉淀,方法 離心 透析 超濾 凝膠過濾,（二）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同分離,利用機(jī)械的快速旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，將不同密度的物質(zhì)分離,離心（centrifugation）,蛋白質(zhì)在離心場中的行為用沉降系數(shù)(sedimentation coefficient, S)表示,利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法,透析(dialysis),純化蛋白質(zhì) 濃縮蛋白質(zhì),作用,超濾,利用超濾膜在一定壓力下使大分子蛋白質(zhì)滯留，而小分子物質(zhì)和溶劑濾過,凝膠過濾（gel-filtration chromatography）,按照天然蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大小進(jìn)行分離的技術(shù)，又稱為分子篩層析或排阻層析,方法 離子交換層析 電泳,（三）根據(jù)蛋白質(zhì)電荷性質(zhì)分離,離子交換層析 （ion exchange chromatography）,利用蛋白質(zhì)兩性解離特性和等電點作為分離依據(jù),電泳(elctrophoresis）,帶點粒子在電場作用下向所帶電荷相反電極移動的現(xiàn)象,支持物的不同分為薄膜電泳、凝膠電泳,SDS-PAGE,SDS-PAGE 可測定蛋白質(zhì)分子量,蛋白質(zhì)含量測定與純度鑒定,凱氏定氮法,（一）蛋白質(zhì)含量測定,紫外線吸收法,考馬斯亮藍(lán)染色法,Folin-酚試劑法,蛋白質(zhì)純度常用某一特定成分與總蛋白之比來表示，如每毫克蛋白質(zhì)含多少活性單位,（二）蛋白質(zhì)的純度鑒定,多肽鏈中氨基酸序列分析,測定蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成,測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端,將肽鏈水解成片段，分別進(jìn)行分析,Edman降解法測定各肽段的氨基酸排列順序,比較多種水解法產(chǎn)生的肽鏈，通過組合排列對比，確定完整肽鏈中的氨基酸順序,Edman降解法測定氨基酸序列,