《植物體細(xì)胞雜交》PPT課件

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1、植物體細(xì)胞雜交,周有文,主要內(nèi)容,體細(xì)胞雜交研究歷程及一般概念,體細(xì)胞雜交的一般流程,雜交細(xì)胞的鑒定及相關(guān)應(yīng)用領(lǐng)域,細(xì)胞雜交的相關(guān)文獻(xiàn),4,1,2,3,我們從以下幾方面來(lái)探討植物體細(xì)胞雜交技術(shù)。,,發(fā)展歷程,70年代，技術(shù)建立和完善優(yōu)化 1972年獲得煙草種間體細(xì)胞雜種 1975年高Ca高pH加PEG融合方法，電融合法 大量成功報(bào)道，不少為異想天開的實(shí)驗(yàn) 80年代初，由模式植物轉(zhuǎn)向農(nóng)作物/經(jīng)濟(jì)作物，對(duì)稱融合到非對(duì)稱融合，創(chuàng)造新種質(zhì)的技術(shù)手段 80年代末，大量木本植物細(xì)胞融合成功的報(bào)道 90年代至今，成為一種育種手段,,植物體細(xì)胞雜交的幾個(gè)重要進(jìn)展,1960年，Kocking用酶法制備高等植物原

2、生質(zhì)體首次獲得成功； 1971年，Takebe首次從離體煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)中獲得再生完整植株； 1972年，Carlson首次獲得粉藍(lán)煙草和郎氏煙草的細(xì)胞雜種，這是第一個(gè)植物體細(xì)胞雜種； 1974年，Kao將聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)融合法應(yīng)用于植物細(xì)胞融合并建立了相應(yīng)的融合技術(shù)； 1978年，Melchers獲得第一個(gè)屬間體細(xì)胞雜種（番茄馬鈴薯）； 1981年，Zimmerman發(fā)明了電融合儀，并首次提出了電融合概念； 1987年，Schweiger建立了單對(duì)原生質(zhì)體電融合技術(shù)程序。,體細(xì)胞雜交的一般概念,體細(xì)胞雜交，即原生質(zhì)體融合，將兩個(gè)不同親本的原生質(zhì)體，經(jīng)人工誘導(dǎo)融合并培養(yǎng)再生成株的過(guò)程，統(tǒng)

3、稱為體細(xì)胞雜交（A + B）。,,根據(jù)概念，在理論上任何細(xì)胞都可能通過(guò)體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源。這對(duì)于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義。 融合過(guò)程不存在有性雜交過(guò)程中的種性隔離機(jī)制的限制，為遠(yuǎn)緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。 體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞含有來(lái)自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過(guò)程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。,體細(xì)胞雜交與有性雜交的異同,幾種不同的表述：,體細(xì)胞雜交：Somatic hybridization 細(xì)胞融合：Cell fusion 原生質(zhì)體融合：Protoplast fusion 無(wú)性雜交：asexual

4、hybridization 超性雜交：Parasexual hybridization 超性融合：Parasexual fusion 細(xì)胞操作：Cell manipulation 細(xì)胞工程（Cell engineering）,體細(xì)胞雜交步驟：,1 原生質(zhì)體的制備 2 原生質(zhì)體的融合 3 雜種細(xì)胞選擇 4 雜種細(xì)胞培養(yǎng) 5 由愈傷組織再生植株 6 雜種植株的鑒定,植物體細(xì)胞雜交技術(shù)的過(guò)程：,,,雜交的兩個(gè)細(xì)胞,,再生細(xì)胞壁,雜種細(xì)胞,脫分化,再分化,（植物體細(xì)胞融合完成的標(biāo)志）,植物細(xì)胞融合,植物組織培養(yǎng),植物細(xì)胞A,植物細(xì)胞B,,去壁,去壁,原生質(zhì)體A,原生質(zhì)體B,,融合,融合的原生質(zhì)

5、體AB,,再生細(xì)胞壁,雜種細(xì)胞AB,脫分化,,,愈傷組織,雜種植株,再分化,,,植物細(xì)胞融合,,植物組織培養(yǎng),植物體細(xì)胞雜交,怎樣才能去除細(xì)胞壁但又不破壞細(xì)胞的生命活性呢？,酶解法,融合的原理及常用的融合方法？,物理方法：離心、振蕩、電刺激 化學(xué)方法：聚乙二醇（PEG）,,融合可能的類型？ 怎樣篩選雜種細(xì)胞？,植物體細(xì)胞雜交成功的標(biāo)志是什么？,,利用雜種細(xì)胞獲得雜種植株所依據(jù)的原理？,植物細(xì)胞具全能性,酶的 專一性,生物膜的 流動(dòng)性,獲得的雜種植株是否能表現(xiàn)出人們所期望的性狀？,雜種植株的鑒定,雜交細(xì)胞的篩選,細(xì)胞融合的方法及步驟,,,,聚乙二醇 PEG）,,化學(xué)方法,細(xì)胞融合流程,,仙臺(tái)

6、病毒 (Sendai virus),自發(fā)融合 在酶解細(xì)胞壁的過(guò)程中，有些相鄰的原生質(zhì)體能彼此融合形成同核體(homokaryon)，每個(gè)同核體包含240個(gè)核。 形成的原因：由不同細(xì)胞間胞間連絲的擴(kuò)展和粘連造成的。 減少自發(fā)融合的措施：在用酶液處理之前，使細(xì)胞受到強(qiáng)烈的質(zhì)壁分離藥物的作用，切斷胞間連絲。,,NaNO3處理,高PH-高濃度Ga2+,飛秒激光誘導(dǎo)融合,電融合芯片,空間細(xì)胞融合,原生質(zhì)體融合的有關(guān)名詞,對(duì)稱雜種（雙親給雜種貢獻(xiàn)的遺傳物質(zhì)均為100%） 非對(duì)稱雜種（雙親給雜種貢獻(xiàn)的遺傳物質(zhì)不等（相對(duì)值） 胞質(zhì)雜種（cytoplasmic hybrid, Cybrid）：細(xì)胞質(zhì)

7、重組，細(xì)胞核未重組 對(duì)稱融合（symmetric fusion） 也稱標(biāo)準(zhǔn)融合（Standard fusion） 非對(duì)稱融合（asymmetric fusion）：融合前對(duì)一方進(jìn)行處理，使其染色體丟失一部分,原生質(zhì)體融合的有關(guān)名詞-II,供-受體融合：Donor-recipient fusion 體配融合（gameto-somatic fusion）（性細(xì)胞與體細(xì)胞融合） 亞原生質(zhì)體-原生質(zhì)體融合： Subprotoplast-protoplast fusion 小原生質(zhì)體：Miniprotoplast 微原生質(zhì)體：Microprotoplast 胞質(zhì)體：Cytoplast 胞質(zhì)體

8、-原生質(zhì)體融合: Cytoplast-protoplast fusion,微原生質(zhì)體融合,植物微原生質(zhì)體融合是在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的將一種植物的一條或幾條染色體轉(zhuǎn)移到另一種植物中的新的非對(duì)稱原生質(zhì)體融合的方法。 其原理是采用適當(dāng)濃度的微核誘導(dǎo)劑，包含DNA合成抑制劑和紡錘體毒素兩大類，常用的如秋水仙素(COL)、安磺靈(oryzalin)、草胺磷除草劑(eremart)、甲基氨草磷(ApM)、甲氨喋吟(MTx)、氯苯胺靈(CIPC)等。 這些藥劑可使正在分裂的植物細(xì)胞停留在有絲分裂中期，數(shù)小時(shí)后，染色體解開螺旋，形成內(nèi)含多個(gè)微原生質(zhì)體的微核化細(xì)胞，每個(gè)微原生質(zhì)體內(nèi)含有一條或幾條染色體，由于有絲分

9、裂停留在中期，每條染色體的兩個(gè)姐妹染色單體仍在一起，著絲點(diǎn)不分開。通過(guò)酶解去掉微核化細(xì)胞的細(xì)胞壁獲得微核化原生質(zhì)體，再用離心等技術(shù)分離出帶有一條或幾條染色體的微原生質(zhì)體，誘導(dǎo)其與完整的受體原生質(zhì)體融合，從而實(shí)現(xiàn)部分基因組的轉(zhuǎn)移。 微原生質(zhì)體融合主要包括3個(gè)步驟:微原生質(zhì)體誘導(dǎo)、分離以及富集、微原生質(zhì)體融合和植株再生。,,微核是細(xì)胞的染色體發(fā)生斷裂后,細(xì)胞進(jìn)入下一次分裂時(shí),染色體片段不能隨有絲分裂進(jìn)入子細(xì)胞,而在細(xì)胞漿中形成直徑小于主核的,嗜色與主核一致,完全與主核分開的圓形或橢圓形微小核 ，位于細(xì)胞漿中獨(dú)立于主核的核小體，其染色同主核，但比主核淡，其直徑小于主核1/3，主要由外界損害因素(生物

10、、物理、化學(xué))作用細(xì)胞后，導(dǎo)致細(xì)胞染色體丟失或斷裂，從而在胞漿中形成1個(gè)或數(shù)個(gè)小核。,根據(jù)融合時(shí)細(xì)胞的完整程度，原生質(zhì)體融合可分為兩大方式：,對(duì)稱融合（symmetric fusion）即兩個(gè)完整的細(xì)胞原生質(zhì)體融合。 非對(duì)稱融合（asymmetric fusion）利用物理或化學(xué)方法使某親本的核或細(xì)胞質(zhì)失活后再進(jìn)行融合。,1.PEG誘導(dǎo)融合法 【Polyethylene glycol （PEG）】,PEG誘導(dǎo)融合的特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過(guò)程不受物種限制。缺點(diǎn)是融合過(guò)程繁瑣，PEG可能對(duì)細(xì)胞有毒害。 PEG作用機(jī)理： Kao等認(rèn)為，由于PEG分子具

11、有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，從而在原生質(zhì)體之間形成分子橋，其結(jié)果使原生質(zhì)體發(fā)生粘連進(jìn)而促進(jìn)原生質(zhì)體融合；另外，PEG能增加類脂膜的流動(dòng)性，也使原生質(zhì)體的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。,在細(xì)胞工程中普遍認(rèn)為聚乙二醇（PEG)分子能改變各類細(xì)胞的生物膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞接觸點(diǎn)處質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，由于兩細(xì)胞接口處雙分子層質(zhì)膜的相互親和以及彼此的表面張力作用，從而使細(xì)胞發(fā)生融合，從而形成雜種細(xì)胞，培養(yǎng)該雜種細(xì)胞（細(xì)胞質(zhì)雜種）可以獲得一些特殊的雜種植株。,PEG融合所需試劑,融合液：pH 5.6 CaCl2 2H2O 810mmol KH2PO4

12、 0.7mmol 甘露醇或山梨醇 0.51.0mol 誘導(dǎo)液：融合液PEG 2045 稀釋液： A液（g/100ml）pH6.0 B液 (g/100ml) pH10.5 葡萄糖 7.21 甘氨酸 0.375 CaCl2 2H2O 0.79 NaOH 0.169,一般PEG融合細(xì)胞流程,NaNO3處理,1909年，Kuster在一個(gè)發(fā)生了質(zhì)壁分離的表皮細(xì)胞中，低滲NaNO3溶液可以引起2個(gè)亞原生質(zhì)體的融合。 缺點(diǎn)：異核體(heterokaryon)形成頻率不高。,高PH-高濃度鈣離子處理,1973年，Keller和Melchers，用強(qiáng)堿性(PH10.5)的高濃度鈣離子

13、（50mmol.L-1)溶液在37下處理約30min，兩個(gè)品系的煙草葉肉原生質(zhì)體很容易融合。 但對(duì)于有些原生質(zhì)體系統(tǒng)，這樣高的PH值是有毒的。,電融合儀的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 交變電場(chǎng)部分 高頻直流電擊部分,電融合的基本過(guò)程：,細(xì)胞膜的接觸：當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時(shí)，電場(chǎng)通電后，電流即通過(guò)原生質(zhì)體而不是通過(guò)溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場(chǎng)作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串； 膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個(gè)緊密接觸的細(xì)胞融合在一起并圓球化。,關(guān)于融合參數(shù)：,交流電壓 交變電場(chǎng)的振幅頻率 交變電場(chǎng)的處理時(shí)間 直流高頻電壓

14、脈沖寬度 脈沖次數(shù),細(xì)胞電融合過(guò)程中,細(xì)胞排隊(duì)、電穿孔和電融合過(guò)程都是在一定的電壓條件下完成的。因此,選擇合適的電壓信號(hào)成為了細(xì)胞電融合過(guò)程的關(guān)鍵所在。與電壓信號(hào)相關(guān)的參數(shù)有:電壓波形、電壓幅值、電壓頻率和電壓持續(xù)時(shí)間。,飛秒激光誘導(dǎo)細(xì)胞融合技術(shù),在實(shí)驗(yàn)中,飛秒激光的中心波長(zhǎng)為810 nm,脈沖重復(fù)頻率100 MHz,脈沖寬度為40 fs,作用在被融合細(xì)胞上的平均功率為55 mW。 首先使用葡聚糖酶去掉酵母細(xì)胞壁,制成原生質(zhì)體。在細(xì)胞融合之前加入體積分?jǐn)?shù)為10%的聚乙二醇(PEG)和0.02 mol/L的CaCl2溶液,促使原生質(zhì)體細(xì)胞聚集并緊密接觸。選定緊密接觸的原生質(zhì)體細(xì)胞對(duì),調(diào)整載物臺(tái)

15、,使飛秒激光聚焦在質(zhì)膜緊密接觸的區(qū)域,通過(guò)光快門控制融合細(xì)胞被輻照時(shí)間。實(shí)驗(yàn)采用0.25 s的輻照時(shí)間,以CCD錄像系統(tǒng)監(jiān)測(cè)靶細(xì)胞的融合過(guò)程。實(shí)驗(yàn)表明,靶細(xì)胞被曝光后160 min便可融合成一個(gè)細(xì)胞。,激光誘導(dǎo)細(xì)胞融合技術(shù)具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，如： 1）高度的選擇性，可以選擇任意的兩個(gè)細(xì)胞之間進(jìn)行融合，易于實(shí)現(xiàn)特定細(xì)胞融合。 2）激光作用于細(xì)胞所產(chǎn)生的應(yīng)力小、定時(shí)和定位性強(qiáng)、損傷小，從而提高了融合細(xì)胞的生存能力。而且，激光參數(shù)易于控制、操作方便、融合過(guò)程利于觀察，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好。 3）激光操控時(shí)無(wú)菌、無(wú)毒性。激光誘導(dǎo)細(xì)胞融合技術(shù)也有自身的缺點(diǎn)，如： a.技術(shù)不夠成熟，需要進(jìn)一步完善。 b.設(shè)備非常

16、昂貴。 c.它是一種微操作技術(shù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和操作技術(shù)要求高，通常需要專門培訓(xùn)。 同時(shí)，該技術(shù)每次只能靠人工操作一對(duì)細(xì)胞，過(guò)程繁瑣，工作效率極差，產(chǎn)量也很低。,細(xì)胞電融合芯片,在細(xì)胞電融合研究向微芯片技術(shù)領(lǐng)域發(fā)展過(guò)程中，微電極間距縮小到幾十微米，而電融合中細(xì)胞排隊(duì)（約100700 V/cm）與電穿孔（約18 kV/cm）所需電場(chǎng)條件基本不變。根據(jù)電場(chǎng)強(qiáng)度與加載電壓的關(guān)系式E=V/d（E為電場(chǎng)強(qiáng)度，V為微電極兩側(cè)施加的電壓，d為微電極間距），如果電極間距d=1 mm，則排隊(duì)電壓需要1070 V，擊穿電壓則高達(dá)100800 V。如果電極間距縮小到d=50m，則排隊(duì)電壓需要0.52.5 V，擊穿

17、電壓只需要540 V。因此，當(dāng)通過(guò)微加工工藝使微電極間距縮小后，所需電壓信號(hào)就會(huì)大大降低，使細(xì)胞電融合系統(tǒng)成為可用電池供電的便攜式系統(tǒng)。由此可見，融合芯片的研究對(duì)細(xì)胞電融合微系統(tǒng)整體的實(shí)現(xiàn)有極其重要的意義，將是該研究的一個(gè)重要內(nèi)容，也是該系統(tǒng)發(fā)展成微全分析系統(tǒng)（micro total analysis system,-TAS）的基礎(chǔ)。,,,,電融合芯片缺點(diǎn),常規(guī)電融合系統(tǒng)中異源細(xì)胞的準(zhǔn)確配型難以實(shí)現(xiàn)與生物和化學(xué)融合方法相比，電融合方法由于效率較高、操作簡(jiǎn)便、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害、便于觀察、適于儀器應(yīng)用和規(guī)范操作，成為了主要的手段。不過(guò)，常規(guī)融合系統(tǒng)中融合配型難以控制，目標(biāo)配型的產(chǎn)率仍然很低。因此，細(xì)胞

18、電融合技術(shù)的研究進(jìn)入微觀層次，希望通過(guò)微操作方法來(lái)實(shí)現(xiàn)精確的細(xì)胞操作，從而解決融合配對(duì)特異性差的缺陷，同時(shí)提高自動(dòng)化程度和融合效率。目前，顯微操作的應(yīng)用雖可以提高配型的準(zhǔn)確度，但自動(dòng)化程度和效率都很低。 現(xiàn)有電融合系統(tǒng)中微電極數(shù)目偏少，難以提高細(xì)胞融合效率現(xiàn)有的電融合系統(tǒng)中融合電極一般只有少數(shù)幾對(duì)，可以同時(shí)控制和融合的細(xì)胞有限，造成融合效率不高。 常規(guī)融合儀器中融合電壓很高，有潛在安全隱患，也不利于設(shè)備微型化現(xiàn)有細(xì)胞電融合儀器中電極間距一般為2001000m，細(xì)胞電穿孔所需電壓在幾百伏特以上。過(guò)高的電壓對(duì)實(shí)驗(yàn)者造成不安全因素，同時(shí)，對(duì)融合后的細(xì)胞存活率也帶來(lái)不利的影響。另外，所需電壓越高，細(xì)胞

19、融合儀設(shè)備制造難度也相應(yīng)提高。設(shè)備研制成本很高，體積較大，難以實(shí)現(xiàn)便攜化，限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。 多核融合細(xì)胞比例過(guò)高現(xiàn)有細(xì)胞電融合方法中，多細(xì)胞排列成細(xì)胞串的比例很高，由此帶來(lái)的一個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題是融合細(xì)胞中多核細(xì)胞（多個(gè)細(xì)胞融合而成）的比例也相當(dāng)高。這種細(xì)胞難以存活和分化，也大大降低了實(shí)際融合效率。 電融合芯片技術(shù)不甚完善現(xiàn)有電融合芯片技術(shù)還處于相當(dāng)初級(jí)的階段，電極數(shù)量少、細(xì)胞控制困難、融合配對(duì)準(zhǔn)確性和融合效率難以同時(shí)得到保障，與其它微流控細(xì)胞研究技術(shù)的集成度也很低。,空間細(xì)胞融合技術(shù),植物細(xì)胞融合過(guò)程中由于地球重力的存在,有無(wú)液泡的原生質(zhì)體密度差很大,異源細(xì)胞融合率低。 20世紀(jì)80年代以

20、來(lái),在空間材料科學(xué)的啟發(fā)下,試圖利用空間微重力條件改進(jìn)細(xì)胞融合技術(shù)。 空間細(xì)胞融合技術(shù)是直接為生物加工服務(wù)的,例如將抗藥性或胞質(zhì)雄性不育等細(xì)胞質(zhì)基因?qū)肓硪粋€(gè)體細(xì)胞,有可能形成新的核質(zhì)雜種;通過(guò)誘導(dǎo)不同種間、科屬間原生質(zhì)體融合,可以打破遠(yuǎn)源雜交不親和性,廣泛組合各種基因型,形成正常重力下無(wú)法獲得的新型雜種植株。,生物誘導(dǎo)融合法仙臺(tái)病毒法,仙臺(tái)病毒是一類被膜病毒，屬于附黏液病毒族，它是多形性顆粒，直徑為5060 nm，由兩層磷脂組成的外膜包裹著RNA和蛋白質(zhì)復(fù)合體，外膜上有兩種糖蛋白，一種是HANA蛋白質(zhì)，一種是F蛋白質(zhì)，前者具有神經(jīng)氨酸酶和血凝活性（分子量較大），后者具有融合和溶血作用（分子

21、量較小）。 仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合的機(jī)理是：病毒被膜上的兩種糖蛋白可和細(xì)胞膜表面的糖蛋白發(fā)生相互作用，從而使兩個(gè)細(xì)胞可以互相接觸，在電鏡下觀察到在相接觸的相鄰細(xì)胞表面之間將產(chǎn)生一些微小的細(xì)胞質(zhì)橋。隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞質(zhì)橋數(shù)量和橋的體積也在增加，最后相鄰細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)就結(jié)合在一起了，形成細(xì)胞凝集塊再通過(guò)膜上蛋白質(zhì)分子的重新排列，使膜中脂類分子重排而打開質(zhì)膜，最后導(dǎo)致細(xì)胞融合。,,在利用仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)中主要包括以下四個(gè)步驟：（1）先將親本細(xì)胞（待融合的細(xì)胞）分別制成懸浮液、混合離心；（2）將沉積細(xì)胞懸于滅活的仙臺(tái)病毒懸液里，在4oC低溫下?lián)u動(dòng)20分鐘，使細(xì)胞形成凝集塊；（3）再將溫度升至

22、37oC，間歇搖動(dòng)30分鐘，使其融合；（4）洗去病毒，將融合細(xì)胞浮于選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。由于4oC低溫利于細(xì)胞聚集，在融合時(shí)需要提高溫度，否則融合不會(huì)發(fā)生。,體細(xì)胞雜種的鑒定及應(yīng)用領(lǐng)域,細(xì)胞融合產(chǎn)生的雜種及后代需經(jīng)過(guò)雜種性質(zhì)的鑒定，而體細(xì)胞雜種用于育種實(shí)踐時(shí)，則應(yīng)進(jìn)行再生植株及后代的遺傳分析，一般包括形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、原位雜交分析以及各種生化及分子標(biāo)記分析。,,形態(tài)標(biāo)記,形態(tài)標(biāo)記即植物的外部特征，如花的形狀及顏色、果實(shí)(種子)的形狀及顏色、葉型、表皮毛、株型、穗型、千粒重、耐逆性以及對(duì)疾病的抗性等。形態(tài)標(biāo)記簡(jiǎn)單直觀，但是標(biāo)記少、多態(tài)性差、易受環(huán)境條件和其它修飾基因的影響，并且許多性狀為

23、數(shù)量性狀，由幾個(gè)位點(diǎn)控制，表現(xiàn)為一個(gè)范圍，而不是簡(jiǎn)單的性狀差異。,細(xì)胞學(xué)標(biāo)記,細(xì)胞標(biāo)記主要包括染色體核型(染色體數(shù)目、大小、隨體、著絲點(diǎn)位置等)和帶型(C帶、N帶、G帶等)。細(xì)胞學(xué)標(biāo)記位點(diǎn)較少，而且對(duì)于親緣關(guān)系較近的物種，由于細(xì)胞學(xué)標(biāo)記差別不明顯，所以很難根據(jù)細(xì)胞學(xué)特征來(lái)區(qū)分。,同工酶標(biāo)記,同工酶為共顯性，父本和母本的基因可以同時(shí)在后代中表達(dá)，不受環(huán)境因素影響，中僅有相對(duì)穩(wěn)定;分析操作簡(jiǎn)便，所需材料較少;不足之處是位點(diǎn)數(shù)較少，植物1020種同工酶表現(xiàn)出位點(diǎn)的多態(tài)性，覆蓋的基因組范圍有限。,染色體原位雜交,染色體原位雜交（Genomic in situ hybridization，GISH）是一

24、項(xiàng)利用標(biāo)記的DNA探針與染色體上的DNA雜交，在染色體上直接進(jìn)行檢測(cè)的分子標(biāo)記技術(shù)。通常用同位素或生物素、地高辛標(biāo)記的DNA探針與染色體DNA雜交，通過(guò)放射自顯影或通過(guò)抗原抗體反應(yīng)，在熒光顯微鏡下觀察DNA探針與其互補(bǔ)的DNA序列結(jié)合的位置。最大優(yōu)點(diǎn)是可以顯示在體細(xì)胞雜種中哪條染色體來(lái)源于這個(gè)親本，哪條染色體來(lái)源于另一個(gè)親本，因而更準(zhǔn)確、直觀。,分子生物學(xué)標(biāo)記,植物的分子標(biāo)記主要有RApD、盯LP、AFLP、SSR、ISSR、EST等。,,下面是研究得出的新品種,植物體細(xì)胞雜交方式有對(duì)稱體細(xì)胞雜交、不對(duì)稱體細(xì)胞雜交。 對(duì)稱體細(xì)胞雜交是指雙方原生質(zhì)體直接進(jìn)行融合，雙親完整原生質(zhì)體融合使所有遺傳物

25、質(zhì)均勻混合和重組形成對(duì)稱雜種。利用體細(xì)胞雜交可創(chuàng)造新物種，研究物種的起源與進(jìn)化。Sundberg（1986）在進(jìn)行蕓薹屬白菜型油菜（Brassica competris）與甘藍(lán)（B.oleracea）體細(xì)胞雜交時(shí)成功地得到與甘藍(lán)型油菜（B.napus）十分相似的合成種，為三者之間親緣關(guān)系提供了有力的證據(jù)（Sundberg et al,1986）。對(duì)稱融合也可能產(chǎn)生非對(duì)稱雜種和胞質(zhì)雜種，非對(duì)稱雜種和胞質(zhì)雜種是由于一方親本染色體被排除而形成，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的兩個(gè)親本進(jìn)行融合時(shí)常出現(xiàn)染色體被消減的現(xiàn)象。 不對(duì)稱雜交是在原生質(zhì)體融合前用物理射線（X、、紫外線）照射其中一個(gè)親本使核基因組失活，然后與正常的

26、或經(jīng)化學(xué)物質(zhì)（碘乙酸鹽、若丹明6G）處理的原生質(zhì)進(jìn)行融合。物理射線（X、、紫外線）照射可打斷破壞親本一方完整的染色體結(jié)構(gòu)，使部分染色體被破壞失活，通過(guò)改變X、、紫外線的劑量可調(diào)節(jié)染色體的失活程度，可獲得各種各樣核基因組組成的不對(duì)稱雜種?；瘜W(xué)試劑主要包括2種，一種是碘乙酰胺或碘乙酸（Iodoacetate，IOA），另一種是若丹明6G。碘乙酰胺或碘乙酸作用機(jī)理上不清楚，若丹明6G是細(xì)胞線粒體氧化磷酸化的專性抑制劑。,原生質(zhì)體融合轉(zhuǎn)移CMS性狀的研究現(xiàn)狀細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS),在植物有性雜交中，由于胞質(zhì)基因組一般具有母性遺傳的特點(diǎn)，因此在大多數(shù)情況下得到的后代往往只具有母本的胞質(zhì)基因組。相對(duì)而言，原生質(zhì)體融合技術(shù)能夠創(chuàng)造大量新的胞質(zhì)基因組和新的核一質(zhì)互作模式，因此在通過(guò)轉(zhuǎn)移胞質(zhì)基因組控制的優(yōu)良農(nóng)藝性狀培育有潛在價(jià)值的植物資源方面具有極大的優(yōu)勢(shì)。在一些己經(jīng)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)基因組控制的性狀中，胞質(zhì)雄性不育(CMS)是最受關(guān)注的重要農(nóng)藝性狀之一。CMS具有使植物產(chǎn)生沒(méi)有正常功能花粉的特點(diǎn)，因此在一些作物的制種方面有重要的意義。,謝謝大家，請(qǐng)大家指教,周有文,