西伯利亞白刺果實(shí)花青素成分的分析鑒定

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1、西伯利亞白刺果實(shí)花青素成分的分析鑒定 　　西伯利亞白刺( Niraria sibirica) 是我國白刺屬植物中分布范圍最廣的一種,除西北地區(qū)外,在東北和華北地區(qū)也有分布[1 -3],具有耐干旱、耐嚴(yán)寒、耐高溫、耐鹽堿和抗風(fēng)沙等特性,適應(yīng)環(huán)境能力極強(qiáng),果實(shí)富含花青素,其生態(tài)和資源價(jià)值成為經(jīng)濟(jì)開發(fā)的備選目標(biāo),因此有必要進(jìn)行深入研究[4 -5].花青素為天然水溶性色素,屬黃酮類化合物,是植物中廣泛存在的一大類天然多酚化合物的總稱[6],主要聚集于植物的花卉、果實(shí)及有色葉片等部位.花青素作為一種天然食用色素,安全、無毒、資源豐富,具有一定營養(yǎng)和藥理作用,在

2、食品、化妝品、醫(yī)藥等方面有著巨大的應(yīng)用潛力.隨著對(duì)天然產(chǎn)物活性研究的不斷進(jìn)展,大量研究表明,花青素類化合物具有抗自由基、改善視力、預(yù)防心血管疾病、提高認(rèn)知能力、抗腫瘤、抗突變等活性[7 -8]. 　　目前,白刺屬植物果實(shí)中花青素組分的生物學(xué)功能已經(jīng)引起了人們的關(guān)注,但針對(duì)西伯利亞白刺果實(shí)的研究尚不多.本研究采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法,對(duì)產(chǎn)自內(nèi)蒙古西部地區(qū)的西伯利亞白刺果實(shí)花青素成分進(jìn)行了系統(tǒng)分析與鑒定,為進(jìn)一步豐富對(duì)白刺屬植物資源的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù). 　　1 材料和方法 　　1. 1 植物材料及試劑 　　西伯利亞白刺果實(shí)采自庫布齊沙地北緣的獨(dú)貴塔拉( 4045 N,1086

3、0 E,海拔1 060 m) 和烏蘭布和沙地南緣的吉蘭泰( 3970 N,10570 E,海拔 1 100 m) .果實(shí)于 2012 年 7 月和 8 月間,分別采集未成熟的黃色果實(shí)、半成熟的紅色果實(shí)和完全成熟的紫色果實(shí).采集時(shí)隨機(jī)選取 3 株白刺植株,并摘取不同高度枝條上的果實(shí),果實(shí)迅速存于保鮮箱中,使用冰袋降溫,24 h 內(nèi)轉(zhuǎn)入 -80 ℃冰箱儲(chǔ)存. 　　試劑: 甲醇和乙腈( 色譜級(jí)) 購自美國飛世爾公司( Fisher Scientific,USA) .甲酸( 色譜級(jí)) 購自上海安譜科技公司,三氟乙酸( TFA,色譜級(jí)) 購自德國默克公司( Merck,Darmstadt,

4、Germany) .HPLC 級(jí)水由 Milli-Q 超純水系統(tǒng)制備( Millipore,Billerica,MA,USA) .分析級(jí)甲醇和甲酸購自北京化工公司.花青素標(biāo)準(zhǔn)品: 矢車菊素 3-葡萄糖苷( Cyanidin 3-O-glucoside chloride,純度≥98% ) 購自成都普思生物科技公司,用于花青素定量分析. 　　1. 2 方法 　　1. 2. 1 花青素的提取 西伯利亞白刺果實(shí)花青素的提取方法參照 Zheng 等[9]方法略修改.取西伯利亞白刺紫果、紅果以及黃果各若干,去核,勻漿,各稱取 20 g 果漿,加入 10 mL 甲醇溶液( 含 2% 甲酸) ,室溫

5、避光提取 24 h,重復(fù)3 次,合并3 次離心后的上清液,用濾紙過濾除去蛋白質(zhì)、不溶物以及多糖.再經(jīng) 0. 22 μm 尼龍有機(jī)濾膜過濾后,用于定性和定量分析. 　　1. 2. 2 花青素的定性分析 采用 Agilent 1100 LC /MSD Trap XCT plus 液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行花青素定性分析.電離源類型為 ESI,選擇正離子模式全掃描和自動(dòng)二級(jí)離子掃描.掃描范圍: ( m/z) 100 ~900 u;正離子模式下質(zhì)譜參數(shù)為: 以氮?dú)庾鳛楦稍餁夂蛧婌F氣,干燥氣溫度 350 ℃; 氮?dú)饬魉?11. 0 L/min,霧化氣壓 35 psi; 離子化方式為 ESI + ,所用的電離電壓為

6、 +4 000 V; 毛細(xì)管出口電壓 106. 0 V; 八級(jí)射頻電壓振幅 171 Vpp; Skim 電壓 40. 0 V.色譜分析體系見 1. 2. 4. 　　1. 2. 3 花青素的定量分析 定量分析采用的HPLC 系統(tǒng)為 Waters 1525 高效液相色譜儀,系統(tǒng)配置包括: Waters 1525 泵、Waters 2998 DAD 檢測器、2707 自動(dòng)進(jìn)樣器.HPLC 所用色譜分析柱為 TSKgel ODS-80 Ts QA ( 150 mm × 4. 6 mm,5 μm i. d. ,Tosoh,Japan) .保護(hù)柱為 C18 柱( 10 mm ×

7、4. 6 mm,5 μm,Kromasil,Sweden) .HPLC 所用的流動(dòng)相組成為: A 相為10%甲酸-水溶液( 含0. 1%TFA) ,B 相為15% 甲醇-乙腈溶液.梯度洗脫程序( B% ) : 0 min,8% ; 20 min,12% ; 30 min,9% ; 55 min,18% ; 70 min,18% ; 71 min,100% ; 81 min,100% ; 83 min,8% ;95 min,8% ; 流速 0. 8 mL / min; 柱溫 35 ℃ .檢測波長 525 nm.進(jìn)樣體積 30 μL. 　　1. 2. 4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以矢車菊素 3-葡萄糖苷

8、( Cyanidin 3-O-glucoside chloride,Cy3G) 為半定量標(biāo)準(zhǔn)物用以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線.稱取矢車菊素 3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品適量溶于 1% 鹽酸甲醇溶液中,配制成0. 32 mg / mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液.取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 0. 01,0. 02,0. 05,0. 06,0. 08,1. 00 mL 定容至 10 mL 的1% 鹽酸甲醇溶液中,配制成濃度分別為 0. 003 2,0. 006 4,0. 016 0,0. 019 2,0. 025 6,0. 032 0 mg / mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,按 1. 2. 3 所述色譜條件進(jìn)行分析. 　　利用標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線為: Y(

9、 色譜峰面積) =1 419 332 490x( Cy3G 濃度) - 97 335,R = 0. 999 7,表明標(biāo)準(zhǔn)品濃度與吸光度在 0. 003 2 ~0. 032 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.精密度分析 RSD =0. 5%,顯示儀器進(jìn)樣精密度良好.將西伯利亞白刺果實(shí)樣品中測得花青素成分峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線,花青素含量表述為每 100 g 去核鮮果中所含的毫升數(shù),所有樣品均測試 3 次. 　　1. 2. 5 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)分析軟件 SAS9. 0 進(jìn)行方差分析. 　　2 結(jié)果與分析 　　2. 1 花青素的鑒定 　　西伯利亞白刺果實(shí)中富含多種黃酮成分,黃酮和花青素在 2

10、70 ~ 280 nm 附近均有吸收,而花青素成分在 520 nm 附近波段為特征吸收[10],因此,采用520 nm 附近進(jìn)行 DAD 掃描,可以有效識(shí)別果實(shí)提取物中的花青素,避免與黃酮混淆.西伯利亞白刺紫果 525 nm 下提取的色譜圖見圖 1. 　　 　　分析色譜峰對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜信號(hào),結(jié)合保留時(shí)間和二級(jí)質(zhì)譜碎裂模式推測,與已有參考文獻(xiàn)進(jìn)行比對(duì),共識(shí)別到 12 個(gè)花青素組分,分屬 5 種花色素苷元:矢車菊素( Cyanidin,組分 1,2,8,9) 、矮牽牛素( Pe-tunidin,組分 3,5,12) 、芍藥素( Peonidin,組分 4,7,11) 、錦葵素 ( Malvidin

11、,組分 6 ) 和天竺葵素 ( Pelar-gonidin,組分 10) ( 表 1) . 　　組分 1,[M-H]-= m / z 611; MS / MS = m / z 287,與矢車菊素苷元相符,考慮出峰時(shí)間,該物質(zhì)應(yīng)為矢車菊素的糖苷衍生物.中性丟失質(zhì)量 324 Da 為二糖基團(tuán).結(jié)合參考文獻(xiàn),推測組分 1 為矢車菊素 3-槐糖苷( Cyanidin 3-O-sophoroside)[11].相似的,組分 4( m/z 625/301) 推測為芍藥素 3-槐糖苷( Peoni-din 3-O-sophoroside) . 　　組分 2,[M-H]-= m / z 449; MS /

12、 MS = m / z 287,為矢車菊素花青素,中性丟失質(zhì)量 162 Da,可知含有 1 個(gè)已糖基團(tuán),常見的已糖配基包括葡萄糖基( -glucoside) 和半乳糖基( -galacoside) ,現(xiàn)有信息無法確定配基,組分 2 推測為矢車菊素 3-己糖苷[12].組分 7( m/z 463/301) 與組分 2 質(zhì)譜模式相似,鑒定為芍藥素 3-己糖苷[12]. 組分 3,質(zhì) 譜 數(shù) 據(jù) ( m/z 787/641/625/479/317) ,為矮牽牛素苷元,存在 2 種碎裂方式: 787→641( - 146)→479( -162)→317( -162) ;

13、787→625( -162)→479( -146)→317( -162) ; 因此,該物質(zhì)含有2 個(gè)已糖基團(tuán)和1 個(gè)戊糖基團(tuán),上述特殊的碎裂方式根據(jù)已有報(bào)道[13]推測組分 3 為矮牽牛素 3-蕓香糖-葡萄糖苷( Petunidin 3-O-rutinoside-glucose) . 　　組分 5,m/z 463/317,中性丟失質(zhì)量 146 Da,組分 6,m/z 463/331,中性丟失質(zhì)量 132 Da,分別推測為矮牽牛素 3-鼠李糖苷( Petunidin 3-O-rhamnoside)和錦葵素3-阿拉伯糖苷( Malvidin 3-O-arabinos

14、e) ,后者為白刺屬植物果實(shí)花青素成分中首次報(bào)道. 　　組分 8 與組分 9,[M-H]-= m / z 757,MS / MS =m / z 287,皆為矢車菊素苷元,分子量相同且保留時(shí)間接近,推測為一對(duì)同分異構(gòu)體[14].根據(jù)丟失質(zhì)量470 Da = 324 + 146,結(jié)合洗脫時(shí)間分析,推測該物質(zhì)含有 2 個(gè)已糖和 1 個(gè)香豆酸基團(tuán)[9],二糖基團(tuán)因被?；?MS/MS 條件下易從苷元上完整脫落,獲得單一產(chǎn)物離子碎片[15].互為異構(gòu)的?；ㄇ嗨刂?順式構(gòu)型的極性強(qiáng)于反式構(gòu)型,故其保留時(shí)間更短[16 -17],因此,組分 8 推斷為矢車菊素 3-順式-香豆酰二 葡 萄 糖 苷 ( C

15、yanidin 3-O-( cis-p-coumaroyl) -diglucoside) ,組分 9 指認(rèn)為矢車菊素 3-反式-香豆酰二葡 萄 糖 苷 ( Cyanidin 3-O-( trans-p-coumaroyl) -diglucoside) . 　　組分 10,MS/MS = m/z 271,為天竺葵素衍生物,組分 12 MS/MS =317,為矮牽牛素衍生物,兩組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)均與組分 8、9 相似,據(jù)此可以推斷兩物質(zhì)同樣含有 2 個(gè)已糖基和 1 個(gè)香豆酸作為?；鶊F(tuán)[18],因未找到對(duì)應(yīng)異構(gòu)體,不足以確認(rèn)順反構(gòu)型,故指認(rèn)為天竺葵素 3-香豆酰二葡萄糖苷( Pelargoni-din

16、 3-O-( p-coumaroyl) -diglucoside) 和矮牽牛素 3-香豆酰 二 葡 萄 糖 苷 ( Petunidin 3-O-( p-coumaroyl) -diglucoside) . 　　組分 11,[M-H]-= m / z 549,MS / MS = m / z301,丟失質(zhì)量為 248 Da,根據(jù)洗脫順序和碎裂方式推測為芍藥素3-丙二酰葡萄糖苷( Peonidin 3-O-mal-onyl-glucoside)[19],這也是花青素丙二?；苌镌诎状虒僦参锕麑?shí)中的首次報(bào)道. 　　2. 2 花青素含量的測定 　　通過矢車菊素 3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)各樣品中花青素

17、進(jìn)行半定量分析,獲得各組分相對(duì)含量,結(jié)果見表 2. 　　 　　由表 2 可見,每 100 g 吉蘭泰、獨(dú)貴塔拉的西伯利亞白刺紫果樣品花青素總含量分別為 45. 83 mg和 40. 12 mg,矢車菊素苷元衍生物在所識(shí)別 5 種苷元中數(shù)量最多,吉蘭泰紫果樣品中矢車菊素占花青素總含量的 70. 4%,獨(dú)貴塔拉樣品中占 85. 6%; 芍藥素花青素含量比例為 15. 4% ( 吉蘭泰) 和 6. 68%( 獨(dú)貴塔拉) ; 矮牽牛素花青素含量比例為 11. 6%( 吉蘭泰) 和 5. 1% ( 獨(dú)貴塔拉) ; 天竺葵素和錦葵素花青素各有 1 種,含量比例均低于 2%.在花色素母核取代方式上,酰基

18、化形式比單純糖基取代方式占優(yōu)勢,在所測定的 12 種花青素成分中,?；煞钟?5 種,含量占花青素總含量的 65. 7% ( 吉蘭泰)和 80. 0%( 獨(dú)貴塔拉) .上述特征最突出的代表是矢車菊素 3-反式-香豆酰二葡萄糖苷( Cyanidin 3-O-( trans-p-coumaroyl) -diglucoside) ,該組分在西伯利亞白刺果實(shí) 3 個(gè)成熟階段含量均為最高.隨著果實(shí)的成熟,果實(shí)顏色逐漸加深,花青素含量也顯著增高,采自吉蘭泰的紫色果實(shí)中花青素總量是黃色果實(shí)的 30 倍,是紅色果實(shí)的 3 倍,采自獨(dú)貴塔拉的紫色果實(shí)中花青素含量是黃色果實(shí)的 18 倍,是紅色果實(shí)的近 4 倍.

19、質(zhì)譜指認(rèn)的 12 種花青素組分均可在紫色果實(shí)中測得,而在紅色和黃色果實(shí)中花青素組分?jǐn)?shù)目遞減. 　　花青素的大量積累可能與西伯利亞白刺特殊的生境條件有關(guān)[20].果實(shí)轉(zhuǎn)色到成熟階段正值夏季,日照強(qiáng)烈,紫外線對(duì)果實(shí)組織的損傷較重.花青素的積累能夠增強(qiáng)果實(shí)組織對(duì)紫外線脅迫的耐受能力.本研究中西伯利亞白刺果實(shí)花青素總含量低于柴達(dá)木盆地唐古特白刺,其中矢車菊素 3-反式-香豆酰二葡萄糖苷測得的含量每 100 g 達(dá) 215 mg[9],為本研究中含量的近 8 倍,兩種白刺屬間果實(shí)花青素含量的差異可能受物種和分布地域等多方面的影響.本研究通過多因素方差分析對(duì)成熟階段和采集點(diǎn) 2 個(gè)因素進(jìn)行了探討,結(jié)果見

20、表 3.　　 　　方差分析反映了 2 個(gè)地點(diǎn)、3 個(gè)成熟階段對(duì)花青素組分含量的影響,結(jié)果顯示,西伯利亞白刺花青素不同組分間含量有顯著性差異( P =0.002 0) ,不同顏色果實(shí)的花青素含量有顯著性差異( P =0. 002 7) ,而 2 個(gè)采樣地之間花青素含量無顯著性差異( P =0. 558 8) ,這可能是由于采樣地處于相近緯度,對(duì)花青素合成影響較為明顯的光照因素差異有限造成的,對(duì)花青素含量和組成的深入分析需要進(jìn)一步擴(kuò)大采集的范圍,而未來比較同一地點(diǎn)采集的不同種白刺將有助于分析物種間差異對(duì)花青素含量的影響. 　　3 討論 　　西伯利亞白刺作為白刺屬植物中分布范圍較廣的一種,在中

21、國東北、西北、華北多個(gè)省區(qū)市均有分布,具有廣泛的適應(yīng)性[1],在資源植物選育開發(fā)和抗逆生物學(xué)機(jī)理等方面都具有研究價(jià)值[21].現(xiàn)有白刺屬植物的花青素研究較多針對(duì)唐古特白刺,對(duì)西伯利亞白刺的重視不夠[3].HPLC-ESI-MS/MS 是植物提取物組分識(shí)別和結(jié)構(gòu)鑒定的有力工具,本研究通過液質(zhì)聯(lián)用手段結(jié)合已有報(bào)道,定性了內(nèi)蒙古西部兩地點(diǎn)采集的西伯利亞白刺 3 個(gè)成熟階段的果實(shí)中 12 種花青素成分,并對(duì)各成分進(jìn)行了半定量分析.結(jié)果顯示,西伯利亞白刺果實(shí)花青素組分包括5 種常見苷元,取代類型豐富,酰化糖基取代占主導(dǎo),同時(shí)存在單糖基取代和多糖基取代,不同組分間含量有顯著差異; 在果實(shí)成熟的 3 個(gè)階段

22、花青素含量變化明顯且受地點(diǎn)的影響不顯著.針對(duì)西伯利亞白刺廣泛分布的特點(diǎn),在今后的研究中應(yīng)選取更多采樣點(diǎn)對(duì)西伯利亞白刺中花青素等活性成分進(jìn)行分析,從而充分挖掘和實(shí)現(xiàn)這一資源植物的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值. 　　參考文獻(xiàn): 　　[1] 潘曉云,小 平,秋 實(shí),等. 多倍化-白刺屬的系統(tǒng)分類、進(jìn)化特征及應(yīng)用前景[J]. 植物學(xué)通報(bào),2003,20( 5) : 635 -638. 　　[2] 楊秀艷,張華新,唐 欣,等. 我國白刺植物資源及其開發(fā)利用[J]. 世界林業(yè)研究,2013,26( 5) : 63 -68. 　　[3] 潘曉玲,沈觀冕,陳 鵬. 白刺屬植物的分類學(xué)及系統(tǒng)學(xué)研究[J]. 云南植物研

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