TB細胞協(xié)作研究的重大突破——濾泡輔助性T細胞的發(fā)現(xiàn)

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1、TB細胞協(xié)作研究的重大突破——濾泡輔助性T細胞的發(fā)現(xiàn) 　　 Tfh; IL21; ICOS; CXCR5; Bcl6 畢業(yè) 　　二十世紀(jì)60年代, Claman和Miller等［1, 2］分別采用照射或胸腺切除的小鼠模型, 同時過繼轉(zhuǎn)移正常小鼠骨髓細胞和胸腺細胞, 或過繼轉(zhuǎn)移胸腺細胞或胸導(dǎo)管淋巴細胞, 才能產(chǎn)生針對羊紅細胞抗體, 發(fā)現(xiàn)了B細胞對某些抗原（后稱為T細胞依賴抗原）刺激產(chǎn)生抗體必須要有T細胞的輔助?！　】贵w分泌細胞產(chǎn)生于外周淋巴器官（脾臟、 淋巴結(jié)、 扁桃腺和派氏集合淋巴結(jié)等）生發(fā)中心（germinal centers,GC）, 并在那里發(fā)生體細胞高

2、頻突變、 抗體類別轉(zhuǎn)換和高親和力的選擇。GC也是CD4+輔助性T細胞（Th）直接輔助B細胞的部位, Th對于GC的形成, 選擇高親和力B細胞分化為記憶細胞或漿細胞, 以及維持長時間的體液免疫應(yīng)答等方面都發(fā)揮著關(guān)鍵作用?！　‰m然Th細胞輔助B細胞產(chǎn)生抗體的研究已有40年歷史, 但“輔助性T細胞”的真正面貌并不清楚, 一度曾認為認為Th2是T細胞輔助B細胞的主角(圖1)。2000年Schaerli和Breitfeld幾乎同時報道了一個定位于淋巴濾泡、 具有輔助B細胞功能、 表型為CXCR5+ CD40L+ ICOS+的T細胞亞群, 稱為濾泡B輔助性T細胞［3,4］。2002年Moser等［5］撰寫

3、了題為“CXCR5+ T cells:follicular homing takes center stage in Thelpercell response”綜述, 并且提出了Tfh可能是不同于Th1和Th2的一個新的T細胞亞群。直到最近才確定, 濾泡輔助性T細胞（T follicular helper cells,Tfh）是主要負責(zé)輔助B細胞的T細胞亞群。Tfh上表達的CD40Lhi和ICOShi分別通過與B細胞上CD40和ICOSL結(jié)合, 以及Tfh所分泌的IL21, 在刺激B細胞的增殖、 分化以及免疫球蛋白類別的轉(zhuǎn)換中起著十分重要的作用。此外, 表達CXCR5的Tfh在淋巴濾泡處

4、產(chǎn)生CXCL13的趨化下, 被募集到淋巴濾泡并與B細胞共定位和相互作用, 因此, CXCR5成為Tfh遷移、 定位重要的“轉(zhuǎn)運分子”（trafficking molecules）, 也是Tfh細胞重要的表面標(biāo)志。Bcl6目前認為是可能控制初始T細胞分化為Tfh的轉(zhuǎn)錄因子。不難看出, 黏附分子、 細胞因子、 趨化因子和受體、 轉(zhuǎn)錄因子以及這些分子基因敲除模型的建立, 為發(fā)現(xiàn)和確定Tfh細胞亞群提供了堅實的基礎(chǔ), 從這個意義上來說, 現(xiàn)在確定Tfh為一個新的CD4+效應(yīng)細胞亞群是“水到渠成”的。 畢業(yè) 　　圖1T細胞輔助B細胞40年研究歷史（略） 畢業(yè) 　　1Tfh的來源以及

5、與Th1、 Th2、 Th17和Treg的關(guān)系　　以往認為, Th2細胞通過分泌IL4刺激B細胞增殖和Ig類別轉(zhuǎn)換, 上調(diào)B細胞CD40和MHCⅡ類分子的表達, 是輔助B細胞主要的T細胞亞群。實際上, IL4-/-小鼠仍然可產(chǎn)生針對T細胞依賴抗原的抗體［11］。目前已經(jīng)明確, Tfh是輔助B細胞主要的T細胞亞群, 而Th1和Th2所分泌的細胞因子在B細胞活化和Ig類別轉(zhuǎn)換中只起到調(diào)節(jié)的作用?！　〕跏糡細胞表達CCR7而不表達CXCR5, 通過CCR7與相應(yīng)配體二級淋巴組織來源的趨化因子（SLC）/CCL21結(jié)合, 使初始T細胞進入外周淋巴器官的T細胞區(qū)［12］?；罨疌D4+T細胞可一過性表

6、達CXCR5, 因此也具有被遷移到淋巴濾泡的能力, 這一過程與CD28、 OX40和ICOS所介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān), 而且CXCR5表達發(fā)生在活化T細胞增殖和分化之前。但是完全極化（full polarized）的Th1和Th2又不表達CXCR5（圖2）?！　≡赥細胞中有一部分持續(xù)表達CXCR5, 主要遷移到B細胞濾泡中, 同時表達ICOShi、 CD40Lhi和分泌IL21, 執(zhí)行輔助B細胞的功能, 成為濾泡輔助性T細胞。 畢業(yè) 　　圖2CD4+T細胞亞群的分化與轉(zhuǎn)錄因子、 趨化因子受體以及分泌細胞因子的關(guān)系（略）畢業(yè) 　　有趣的是, Tfh與Th17兩個亞群有某些相似之處, 如

7、都表達IL21, 分化發(fā)育都依賴于IL6、 IL21和STAT3。但Tfh不產(chǎn)生IL17A、 IL17F和IL22, 其分化也不依賴TGFβ的RORγt轉(zhuǎn)錄因子［9］。 畢業(yè) 　　2參與Tfh細胞功能的關(guān)鍵分子　　參與Tfh細胞功能的關(guān)鍵分子見表1。 畢業(yè) 　　表1參與Tfh細胞功能的重要分子（略） 畢業(yè) 　　注: （1）除Tfh外, IL21還可由Th17和NK T細胞產(chǎn)生;（2）在Tfh表達的共刺激分子中, CD40Lhi對B細胞體液免疫功能也有重要調(diào)節(jié)作用;（3）Tfh表達高水平的IL6R和IL21R, 后者參與Tfh自分泌IL21的功能; 此外T

8、fh還分泌IL10;（4）Tfh還表達PD1和BTLA等負性調(diào)節(jié)的共刺激分子. 畢業(yè) 　　2.1Bcl6與Tbet、 GATA3/Stat6、 FoxP3、RORγt分別決定Th1、 Th2、 Treg或Th17譜系分化不同, 決定Tfh細胞的轉(zhuǎn)錄因子目前尚不能完全確定。但多種證據(jù)提示, Bcl6(Bcell CLL/Lymphoma 6, zinc finger protein 51)可能發(fā)生揮著重要作用。雖然GC中B細胞可表達Bcl6, 但在CD4+T細胞中, Bcl6優(yōu)先表達于Tfh［13］, 而不表達于Th1和Th2,Bcl6-/-小鼠由于缺乏GC形成,

9、 針對T細胞依賴抗原的抗體應(yīng)答受損, 抗體親和力成熟也發(fā)生障礙［17,18］?！　〈送? Bcl6表達還抑制了GATA3表達, 抑制T細胞IL4分泌［19］。Bcl6還可抑制TGFβSmad信號途徑, 提示不存在TGFβ可能有利于Tfh的分化［9］。值得注意的是, GC中CD4+T細胞僅有10%～15%表達Bcl6。 畢業(yè) 　　2.2IL21IL21是屬于γc依賴的細胞因子（cdependent cytokines）。共用γc（CD132）作為其受體亞單位的細胞因子有IL2、 IL4、 IL7、 IL9、 IL13、 IL15、 IL21以及胸腺基質(zhì)淋

10、巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin,TSLP）。IL21 2000年基因克隆成功。IL21主要由Tfh、 Th17和NK T細胞產(chǎn)生, Th1和Th2也可分泌IL21, 但水平較低［13］。由于IL21是Tfh細胞執(zhí)行效應(yīng)功能的主要細胞因子, 因此又稱為Tfh表達的輔助性細胞因子（Tfhexpressed helper cytokine）。IL21缺陷小鼠Tfh細胞發(fā)育障礙。IL21R由結(jié)合IL21的IL21R 鏈和γc組成, 分布廣泛, 但主要表達于B細胞、 Tfh、 Th17和NK細胞, 因此上述細胞也是IL21作用的主要靶細胞。 畢

11、業(yè) 　　2.2.1IL21對B細胞的調(diào)節(jié)作用B細胞是IL21作用的主要靶細胞。當(dāng)CD40 mAb交聯(lián)刺激人B細胞時, IL21可使活化B細胞分泌IgG1和IgG3。IL21可誘導(dǎo)所有B細胞亞群（包括新生B細胞、 初始B細胞、 過渡型B細胞、 生發(fā)中心B細胞以及記憶B細胞）分化為Ig分泌細胞（Igsecreting cells,ISC）, 分泌大量IgM、 IgG和IgA［14,20-22］。一般來說, IL4對初始B細胞的作用要明顯強于作用于GC和記憶B細胞的作用; 而IL10則優(yōu)先增強GC 中的B細胞和記憶B細胞分化為ISC。由Tfh產(chǎn)生的IL21, 在B細胞對T細胞依

12、賴抗原的初始免疫應(yīng)答、 再次免疫應(yīng)答以及體液免疫長期的維持中都發(fā)揮了主要作用［14］?！　∫酝J為, IL10是最為重要的刺激人B細胞分化為漿細胞的細胞因子。相比之下, IL21在CD40 mAb刺激人B細胞分化為漿細胞的效能是IL10作用的100倍［14］。CD40 mAb聯(lián)合IL21刺激人B細胞可誘導(dǎo)其表達酶活化誘導(dǎo)的胞嘧啶脫氨酶（enzyme activationinduced cytidine deaminase,AID）和B細胞成熟蛋白1（Blymphocyte maturation protein1,Blimp1）, AID和轉(zhuǎn)錄因子Blimp1分別在Ig類別轉(zhuǎn)換

13、和B細胞向漿細胞分化中起著關(guān)鍵作用［20］。IL4可通過抑制Blimp1的表達抑制IL21對初始B細胞的刺激作用; 而記憶B細胞則對IL4抑制IL21的作用有抵抗［14］。IL21-/-小鼠B細胞應(yīng)答水平明顯降低。 畢業(yè) 　　2.2.2IL21對Tfh的調(diào)節(jié)作用Tfh本身也表達IL21R, IL21通過以下幾方面調(diào)節(jié)Tfh: ①誘導(dǎo)Tfh分化, IL21或IL21R缺陷小鼠Tfh細胞數(shù)量銳減; ②IL21通過自分泌形式促進Tfh細胞表面CXCR5的表達, 使其向淋巴小結(jié)和生發(fā)中心遷移, 并在那里與B細胞相互作用, 因此IL21也是GC形成中的關(guān)鍵細胞因子

14、; ③誘導(dǎo)Tfh細胞ICOS表達, 發(fā)揮Tfh輔助B細胞的功能（見下述）?！　L21R信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過Vav1調(diào)控T細胞受體信號體（T cell receptor signalosome）實現(xiàn)的。Vav1是Rho家族GTPases中一種鳥嘌呤核苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factor,GEF）, 在NFATc1活化中發(fā)揮重要作用, 可下調(diào)細胞周期抑制物p27kip1水平, 促進IL2產(chǎn)生、 肌動蛋白多聚化和TCR成簇。IL21誘導(dǎo)Vav1中酪氨酸發(fā)生磷酸化, 從而增強了TCR信號強度, 有利于Tfh分化［10］。 畢業(yè) 　　2.2

15、.3IL21對Th17和NK細胞的調(diào)節(jié)作用IL21也是Th17產(chǎn)生和分化的重要的自分泌細胞因子。由于Th17表達CCR4和CCR6而不表達CXCR5, 因此Th17被募集到炎癥區(qū)域, 而不遷移到淋巴小結(jié)。IL21可促進NK細胞的分化, 誘導(dǎo)其產(chǎn)生IFNγ。 畢業(yè) 　　2.3ICOS誘導(dǎo)性協(xié)同刺激分子（inducible costimulator,ICOS）是CD28家族中的一個成員, 為T細胞活化所誘導(dǎo)。ICOS基因1999年克隆成功［23］, 2004年命名為CD278。ICOS配體（ICOS ligand,ICOSL）即B7H2（B7 homologue 2）, 命名為C

16、D275。以往認為, ICOS主要表達在Th2細胞。實際上, 形態(tài)學(xué)上早就觀察到ICOS高表達于扁桃體生發(fā)中心明區(qū)頂部的T細胞。只是那時還沒有認識到這群細胞其實主要是Tfh細胞。ICOSL主要表達于包括B細胞在內(nèi)的APC。 畢業(yè) 　　2.3.1ICOSL/ICOS相互作用調(diào)節(jié)Tfh和B細胞功能B細胞上ICOSL與Tfh細胞上ICOS相互作用, 對于Tfh細胞的產(chǎn)生和維持, 生發(fā)中心和記憶B細胞的形成發(fā)揮重要作用［9,24］。在體外, 來自扁桃腺中CXCR5hiICOShiCD4+細胞可有效誘導(dǎo)B細胞產(chǎn)生IgG［25］。ICOS/ICOSL相互作用對于Tfh表達IL21是必需的, 其機制

17、可能是通過NFATc1來調(diào)節(jié)IL21表達［9］。純合子缺乏ICOS與人普通變異免疫缺陷?。╟ommon variable immunodeficiency,CVID）有關(guān), 患者淋巴結(jié)中GC缺如, IgM+記憶B細胞明顯減少, 外周血中CXCR5+CD4+T細胞缺如［9,10］。 畢業(yè) 　　2.3.2Sanroque小鼠品系建立促進了對Roquin蛋白調(diào)節(jié)ICOS表達的認識2005年Vinuesa等采用致遺傳上發(fā)生改變的乙基亞硝基脲（ethylnitrosourea）處理C57BL/6小鼠, 獲得一種具有典型系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）特征的小鼠品系, 稱之為sanroque小鼠。

18、在細胞水平上發(fā)現(xiàn), sanroque小鼠淋巴結(jié)中有大量的Tfh, 自發(fā)形成GC。這種突變小鼠緣于一種ICOS表達的抑制物的缺陷, 從而使Tfh表達高水平的ICOS, 并分泌大量的IL21。進一步研究發(fā)現(xiàn), 導(dǎo)致小鼠發(fā)生病理改變的突變基因是編碼一種高度保守RING型泛素連接酶家族成員的Roquin（Rc3h1）。Roquin蛋白含有一個結(jié)合RNA的CCCH鋅指結(jié)構(gòu), 分布在胞質(zhì)RNA顆粒, 提示其可能調(diào)節(jié)mRNA的翻譯和穩(wěn)定性。Roquin是Tfh和自身抗體應(yīng)答的一種關(guān)鍵負調(diào)控蛋白, sanroque小鼠Roquin發(fā)生了突變（M199R）, 影響了Roquin 螺旋結(jié)構(gòu), 不能發(fā)揮抑制ICO

19、S表達的作用, 過多形成Tfh, 導(dǎo)致sanroque小鼠發(fā)生自身免疫綜合征［8］。 畢業(yè) 　　2.3.3Roquin抑制自身免疫的分子機制2007年Vinuesa研究組發(fā)現(xiàn)Roquin抑制自身免疫的分子機制是通過限制ICOS mRNA表達實現(xiàn)的。正常情況下, Roquin可通過促進ICOS mRNA降解而限制ICOS表達, 在ICOS mRNA 3′端非翻譯區(qū)有一個保守的區(qū)域, 由47個堿基對組成, 可與T細胞表達的microRNA（包括miR101）相互補。Roquin是否直接結(jié)合mRNAs靶分子和/或結(jié)合到與靶分子互補的miRNA還不清楚［26］。 畢業(yè) 　　2.4

20、CXCR5CXCR5（CD185）最初被稱為BLR1（Burkitt’s lymphoma receptor 1）, 1992年基因克隆成功［27］。其相應(yīng)的配體為BCA1（B cellattracting chemokine1/CXCL13）［28］。CXCR5主要表達于Tfh和B細胞。 畢業(yè) 　　2.4.1Tfh細胞表達CXCR5初始T細胞不表達CXCR5, T細胞活化后CXCR5可一過性表達, 這種活化依賴于CD28和ICOS等共刺激分子, CXCR5表達往往發(fā)生在細胞增殖和分化之前。一般認為, 完全極化的T細胞（如Th1和Th2）不表達CXCR5。在淋巴結(jié)中有一部分經(jīng)抗原

21、活化的CD4+T細胞, 表達高水平的ICOS和CD40L, 并分泌大量IL21, 發(fā)育成為Tfh。CD8+T細胞也不表達CXCR5。在活化的淋巴組織（例如扁桃腺）中, 將近50%的CD4+T細胞為CXCR5+, 并定位于生發(fā)中心。從扁桃腺中分離出來的CXCR5+CD4+T細胞可有效地輔助B細胞并使其分化為漿細胞。CD4+CXCR5+CD40LhiICOShi成為Tfh細胞重要的表型［29］。 畢業(yè) 　　2.4.2B細胞表達CXCR5在淋巴組織中, CXCR5表達于所有的成熟B細胞。由淋巴濾泡基質(zhì)細胞（包括濾泡樹突狀細胞, FDC）所產(chǎn)生的CXCL13趨化因子通過與其相應(yīng)受體CX

22、CR5結(jié)合, 招引B細胞和T細胞定位于淋巴組織的濾泡區(qū)域［3,30,31］。 畢業(yè) 　　3效應(yīng)Tfh細胞和記憶Tfh的遷移和組織定位 畢業(yè) 　　3.1CXCR5與Tfh和B細胞遷移到B細胞區(qū)的關(guān)系Tfh表達CXCR5是Tfh遷移到外周淋巴器官B細胞區(qū)的關(guān)鍵trafficking分子。此外, CXCR5也表達于B細胞, 參與外周淋巴器官中B細胞濾泡的發(fā)育。CXCR5-/-或CXCL13-/-小鼠淋巴小結(jié)結(jié)構(gòu)紊亂, 淋巴結(jié)和派氏集合淋巴結(jié)數(shù)量降低［30,32］。雖然活化T細胞可一過性表達CXCR5, 但在T細胞中只有Tfh持續(xù)性表達CXCR5。在GC中, Tfh與B細胞相互作用有利于C

23、XCR5持續(xù)表達。實際上, B細胞與效應(yīng)T細胞的相互作用首先發(fā)生在外周淋巴器官的T細胞區(qū)。接受抗原刺激后的B細胞有兩種命運: 一是遷移到淋巴小結(jié)外, 發(fā)育分化為漿細胞, 并很快分泌低親和力抗體; 另一種歸宿是同T細胞一起遷移到淋巴小結(jié)B細胞區(qū), 并形成生發(fā)中心, 發(fā)生體細胞突變和抗體親和力成熟。而且Tfh遷移到B細胞濾泡對GC的發(fā)育是必不可少的?！　〕跏糡細胞表達CCR7和CD62L, 在高內(nèi)皮微靜脈（HEV）產(chǎn)生CCL21趨化下遷移至外周淋巴器官的T細胞區(qū), 接受來自DC的抗原刺激。活化T細胞上調(diào)CXCR5, 賦予其遷移到淋巴小結(jié)的能力, Tfh細胞在淋巴小結(jié)中與抗原刺激過的（antigen

24、primed）B細胞相遇, 發(fā)生CD40CD40L依賴的B細胞的活化。Tfh是否可直接從血液進入淋巴濾泡區(qū)尚不清楚(圖3)［7, 9］。 畢業(yè) 　　圖3Tfh細胞的分化、 遷移和組織定位（略） 畢業(yè) 　　注: （1）由外周淋巴器官T細胞區(qū)高內(nèi)皮微靜脈（HEV）產(chǎn)生的SLC（secondarylymphoid tissue chemokine）/CCL21招引表達CCR7的初始T細胞從外周循環(huán)進入T細胞區(qū); （2）T細胞與成熟樹突狀細胞（mDC）等APC相互作用后表達IL6R和IL21R, APC產(chǎn)生的IL6與經(jīng)抗原刺激后T細胞IL6R結(jié)合; （3）活化T細胞表達高水平

25、ICOS、 IL6R、 IL21R和CXCR5, IL6和IL21調(diào)節(jié)Tfh細胞分化時通過其受體激活STAT3, 表達有CXCR5的Tfh被濾泡基質(zhì)細胞（包括FDC、 血管細胞和網(wǎng)狀細胞）產(chǎn)生的BCA1（B cell attracting chemokine）/CXCL13趨化遷移到淋巴小結(jié), 進一步形成生發(fā)中心; （4）高表達CXCR5 B細胞從T細胞區(qū)遷移到B細胞濾泡（未顯示）, TfhB細胞相互作用, CD40L/CD40和ICOSL/ICOS共刺激分子以及Tfh分泌IL21, 在Tfh輔助B細胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用; （5）活化B細胞發(fā)生增殖分化、 Ig類別轉(zhuǎn)換和親和力成熟。

26、畢業(yè) 　　3.2記憶Tfh在外周血T細胞中約有10%為CXCR5+CD4+, 并同時表達CD62L和CCR7, 可能是Tfh來源的記憶性T細胞亞群。探討Tfh在GC中發(fā)生應(yīng)答后的轉(zhuǎn)歸, 與免疫記憶、 疫苗研制和自身免疫性疾病有著密切的關(guān)系。目前認為, Tfh是終未分化的T細胞亞群, 由于其高表達CD95, 易于發(fā)生凋亡。但是, 最近發(fā)現(xiàn)在GC應(yīng)答消退后, 記憶性CXCR5+CD69+Tfh繼續(xù)存在于B細胞濾泡局部, 即有一群高親和力CXCR5+T細胞存在于表達CXCL13 FDC細胞的周圍, 當(dāng)發(fā)生再次免疫應(yīng)答時可被重新活化。顯然Tfh的免疫記憶不同于其他T細胞亞群。局部環(huán)境的因素與Tfh記憶細胞存在密切相關(guān)。在B細胞濾泡中的記憶Tfh細胞還會接受來自B細胞和其他APC細胞的抗原刺激, 但這些刺激的強度尚不足于誘導(dǎo)效應(yīng)Tfh表達ICOS和IL21的分泌。其他T細胞亞群如效應(yīng)Th1和CD8+T細胞大都定位于外周的組織和炎癥損傷部位, 而效應(yīng)和記憶的Tfh主要定位于淋巴樣組織, 尤其在B細胞濾泡［33］。淋巴濾泡中記憶Tfh細胞還可調(diào)節(jié)記憶B細胞功能, 使其保持長時間體液免疫應(yīng)答能力。 畢業(yè)