《植物組織培養(yǎng)技術(shù)》PPT課件

掌 握 培 養(yǎng) 基 配 制 、 培 養(yǎng) 條 件 的 控 制第 四 章 植 物 組 織 培 養(yǎng) 的 培 養(yǎng) 條 件知 識(shí) 目 標(biāo) ：能 力 目 標(biāo) ： ：會(huì) 配 制 培 養(yǎng) 基 培 養(yǎng) 基 ： 是 植 物 組 織 培 養(yǎng) 的 重 要 基 質(zhì) 。 在 離 體 培 養(yǎng) 條件 下 ， 不 同 種 植 物 的 組 織 對 營 養(yǎng) 有 不 同 的 要 求 ， 甚 至 同 一種 植 物 不 同 部 位 的 組 織 對 營 養(yǎng) 的 要 求 也 不 相 同 ， 只 有 滿 足了 它 們 各 自 的 特 殊 要 求 ， 它 們 才 能 很 好 地 生 長 。 因 此 ， 沒有 一 種 培 養(yǎng) 基 能 夠 適 合 一 切 類 型 的 植 物 組 織 或 器 官 ， 在 建立 一 項(xiàng) 新 的 培 養(yǎng) 系 統(tǒng) 時(shí) ， 首 先 必 須 找 到 一 合 適 的 培 養(yǎng) 基 ，培 養(yǎng) 才 有 可 能 成 功 。 營 養(yǎng) 條 件 培 養(yǎng) 基 (culture medium)A 概 念 B 培 養(yǎng) 基 的 種 類 培 養(yǎng) 基 有 許 多 種 類 ， 根 據(jù) 不 同 的 植 物 和 培 養(yǎng) 部 位 及 不 同 的 培 養(yǎng)目 的 需 選 用 不 同 的 培 養(yǎng) 基 。 培 養(yǎng) 基 的 產(chǎn) 生 最 早 是 Sacks(1680)和 Knop(1681)， 他 們 對 綠 色植 物 的 成 分 進(jìn) 行 了 分 析 研 究 ， 根 據(jù) 植 物 從 土 中 主 要 是 吸 收 無 機(jī) 鹽營 養(yǎng) ， 設(shè) 計(jì) 出 了 由 無 機(jī) 鹽 組 成 的 Sacks和 Knop溶 液 ， 至 今 仍 在 作為 基 本 的 無 機(jī) 鹽 培 養(yǎng) 基 得 到 廣 泛 應(yīng) 用 。 以 后 根 據(jù) 不 同 目 的 進(jìn) 行 改良 產(chǎn) 生 了 多 種 培 養(yǎng) 基 ， White培 養(yǎng) 基 在 40年 代 用 得 較 多 ， 現(xiàn) 在 還常 用 。 而 到 60和 70年 代 則 大 多 采 用 MS等 高 濃 度 培 養(yǎng) 基 ， 可 以 保 證培 養(yǎng) 材 料 對 營 養(yǎng) 的 需 要 ， 并 能 生 長 快 、 分 化 快 ， 且 由 于 濃 度 高 ，在 配 制 、 消 毒 過 程 中 某 些 成 分 有 些 出 入 ， 也 不 致 影 響 培 養(yǎng) 基 的 離子 平 衡 。 培 養(yǎng) 基 的 名 稱 ， 一 直 根 據(jù) 沿 用 的 習(xí) 慣 。 多 數(shù) 以 發(fā) 明 人 的 名 字 來 命名 ， 如 White培 養(yǎng) 基 ， Murashige和 Skoog培 養(yǎng) 基 (簡 稱 MS培 養(yǎng) 基 )， 也 有 對 某 些 成 分 進(jìn) 行 改 良 稱 作 改 良 培 養(yǎng) 基 。 (1)MS培 養(yǎng) 基 它 是 1962年 由 Murashige和 Skoog為 培 養(yǎng) 煙 草 細(xì) 胞 而 設(shè) 計(jì) 的 。特 點(diǎn) 是 無 機(jī) 鹽 和 離 子 濃 度 較 高 ， 為 較 穩(wěn) 定 的 平 衡 溶 液 。 其 養(yǎng) 分 的 數(shù) 量 和比 例 較 合 適 ， 可 滿 足 植 物 的 營 養(yǎng) 和 生 理 需 要 。 它 的 硝 酸 鹽 含 量 較 其 他 培養(yǎng) 基 為 高 ， 廣 泛 地 用 于 植 物 的 器 官 、 花 藥 、 細(xì) 胞 和 原 生 質(zhì) 體 培 養(yǎng) ， 效 果良 好 。 有 些 培 養(yǎng) 基 是 由 它 演 變 而 來 的 。 (2)B5培 養(yǎng) 基 是 1968年 由 Galmborg等 為 培 養(yǎng) 大 豆 根 細(xì) 胞 而 設(shè) 計(jì) 的 。 其 主要 特 點(diǎn) 是 含 有 較 低 的 銨 ， 這 可 能 對 不 少 培 養(yǎng) 物 的 生 長 有 抑 制 作 用 。 從 實(shí)踐 得 知 有 些 植 物 在 B5培 養(yǎng) 基 上 生 長 更 適 宜 ， 如 雙 子 葉 植 物 特 別 是 木 本 植 物 。 (3)White培 養(yǎng) 基 是 1943年 由 White為 培 養(yǎng) 番 茄 根 尖 而 設(shè) 計(jì) 的 。 1963年 又作 了 改 良 ， 稱 作 White改 良 培 養(yǎng) 基 ， 提 高 了 MsSO4的 濃 度 和 增 加 了 硼 素 。 其特 點(diǎn) 是 無 機(jī) 機(jī) 鹽 數(shù) 量 較 低 ， 適 于 生 根 培 養(yǎng) 。 （ 4） N 6培 養(yǎng) 基 是 1974年 朱 至 清 等 為 水 稻 等 禾 谷 類 作 物 花 藥 培 養(yǎng) 而 設(shè) 計(jì) 的 。其 特 點(diǎn) 是 成 分 較 簡 單 ， KNO3和 （ NH4） 2SO4含 量 高 。 在 國 內(nèi) 已 廣 泛 應(yīng) 用 于 小麥 、 水 稻 及 其 他 植 物 的 花 藥 培 養(yǎng) 和 其 他 組 織 培 養(yǎng) 。 (5)KM 8P培 養(yǎng) 基 它 是 1974年 為 原 生 質(zhì) 體 培 養(yǎng) 而 設(shè) 計(jì) 的 。 其 特 點(diǎn) 是 有 機(jī)成 分 較 復(fù) 雜 ， 它 包 括 了 所 有 的 單 糖 和 維 生 素 ， 廣 泛 用 于 原 生 質(zhì) 融 合 的 培養(yǎng) 。 目 前 國 際 上 流 行 的 培 養(yǎng) 基 有 幾 十 種 ， 常 用 的 培 養(yǎng) 基 及 特 點(diǎn) 如 下 ： C 培 養(yǎng) 基 的 成 分 培 養(yǎng) 基 的 成 分 主 要 可 以 分 水 、 無 機(jī) 鹽 、 有 機(jī) 物 、天 然 復(fù) 合 物 、 培 養(yǎng) 體 的 支 持 材 料 等 五 大 類 。 是 植 物 原 生 質(zhì) 體 的 組 成 成 分 ， 也 是 一 切 代 謝 過 程的 介 質(zhì) 和 溶 媒 。 它 是 生 命 活 動(dòng) 過 程 中 不 可 缺 少 的物 質(zhì) 。 配 制 培 養(yǎng) 基 母 液 時(shí) 要 用 蒸 餾 水 ， 以 保 持 母液 及 培 養(yǎng) 基 成 分 的 精 確 性 ， 防 止 貯 藏 過 程 發(fā) 霉 變質(zhì) 。 大 規(guī) 模 生 產(chǎn) 時(shí) 可 用 自 來 水 。 但 在 少 量 研 究 上盡 量 用 蒸 餾 水 ， 以 防 成 分 的 變 化 引 起 不 良 效 果 。 1 水 2 無 機(jī) 元 素 (inorganic element) (1)N 是 蛋 白 質(zhì) 、 酶 、 葉 綠 素 、 維 生 素 、 核 酸 、 磷 脂 、 生 物 堿 等的 組 成 成 分 ， 是 生 命 不 可 缺 少 的 物 質(zhì) 。 在 制 備 培 養(yǎng) 基 時(shí) 以 NO3N和 NH 4N兩 種 形 式 供 應(yīng) 。 大 多 數(shù) 培 養(yǎng) 基 既 含 有 N03N又 含NH 4N。 NH 4N對 植 物 生 長 較 為 有 利 。 供 應(yīng) 的 物 質(zhì) 有 KNO3、NH 4NO3等 。 有 時(shí) ， 也 添 加 氨 基 酸 來 補(bǔ) 充 氮 素 。 (2)P 是 磷 脂 的 主 要 成 分 。 而 磷 脂 又 是 原 生 質(zhì) 、 細(xì) 胞 核 的 重 要 組成 部 分 。 磷 也 是 ATP、 ADP等 的 組 成 成 分 。 在 植 物 組 織 培 養(yǎng) 過 程中 ， 向 培 養(yǎng) 基 內(nèi) 添 加 磷 ， 不 僅 增 加 養(yǎng) 分 、 提 供 能 量 ， 而 且 也 促 進(jìn)對 N的 吸 收 ， 增 加 蛋 白 質(zhì) 在 植 物 體 中 的 積 累 。 常 用 的 物 質(zhì) 有 KH 2P04或 NaH 2P04等 。大 量 元 素 ： 指 濃 度 大 于 0.5mmol L的 元 素 。 其 作 用 是 ： (3)K 對 碳 水 化 合 物 合 成 、 轉(zhuǎn) 移 、 以 及 氮 素 代 謝 等 有 密 切關(guān) 系 。 K增 加 時(shí) ， 蛋 白 質(zhì) 合 成 增 加 ， 維 管 束 、 纖 維 組 織 發(fā)達(dá) ， 對 胚 的 分 化 有 促 進(jìn) 作 用 。 但 濃 度 不 易 過 大 ， 一 般 為1 3mg L為 好 。 制 備 培 養(yǎng) 基 時(shí) ， 常 以 KCI、 KN03等 鹽 類 提供 。 (4)Mg、 S和 Ca、 Mg 是 葉 綠 素 的 組 成 成 分 ， 又 是 激 酶 的 活化 劑 ； S是 含 S氨 基 酸 和 蛋 白 質(zhì) 的 組 成 成 分 。 它 們 常 以MgSO4 7H20提 供 。 用 量 為 1 3mg l較 為 適 宜 ； Ca是 構(gòu) 成細(xì) 胞 壁 的 一 種 成 分 ， Ca對 細(xì) 胞 分 裂 、 保 護(hù) 質(zhì) 膜 不 受 破 壞 有顯 著 作 用 ， 常 以 CaCl 2 2H2O提 供 。 鐵 是 一 些 氧 化 酶 、 細(xì) 胞 色 素 氧 化 酶 、 過 氧 化 氫 酶 等 的 組 成 成分 。 同 時(shí) ， 它 又 是 葉 綠 素 形 成 的 必 要 條 件 。 培 養(yǎng) 基 中 的 鐵 對胚 的 形 成 、 芽 的 分 化 和 幼 苗 轉(zhuǎn) 綠 有 促 進(jìn) 作 用 。 在 制 做 培 養(yǎng) 基 時(shí) 不 用 Fe2SO4， 和 FeCl3(因 其 在 pH值 5 2以 上 ，易 形 成 Fe(OH)3的 不 溶 性 沉 淀 )， 而 用 FeSO4 7H20和 Na2 EDTA結(jié) 合 成 合 物 使 用 。 B， Mn， Zn， Cu， Mo， Co等 ， 也 是 植 物 組 織 培 養(yǎng) 中 不 可 缺 少 的元 素 ， 缺 少 這 些 物 質(zhì) 會(huì) 導(dǎo) 致 生 長 、 發(fā) 育 異 常 現(xiàn) 象 。 微 量 元 素 ： 指 小 于 0.5mmol L的 元 素 ， Fe， B， Mn， Cu， Mo， Co等 。 3 有 機(jī) 化 合 物 (organic compound) 培 養(yǎng) 基 中 若 只 含 有 大 量 元 素 與 微 量 元 素 ， 常 稱 為基 本 培 養(yǎng) 基 （ basic medium)。 為 不 同 的 培 養(yǎng) 目 的 往 往 要 加 入 一 些 有 機(jī) 物 以 利 于快 速 生 長 。 常 加 入 的 有 機(jī) 成 分 主 要 有 以 下 幾 類 ： 高 壓 滅 菌 時(shí) ， 一 部 分 糖 會(huì) 發(fā) 生 分 解 ， 制 定 配 方 時(shí) 要 給 予 考 慮 。1） 碳 水 化 合 物 最 常 用 的 碳 源 是 蔗 糖 ， 葡 萄 糖 和 果 糖 也 是 較 好 的 碳 源 ， 可 支 持 許多 組 織 很 好 的 生 長 。蔗 糖 使 用 濃 度 在 2% 3%， 常 用 3%， 即 配 制 一 升 培 養(yǎng) 基 稱 取 30g蔗糖 ， 有 時(shí) 可 用 2.5%， 但 在 胚 培 養(yǎng) 時(shí) 采 用 4%-15%的 高 濃 度 ， 因 蔗 糖對 胚 狀 體 的 發(fā) 育 起 重 要 作 用 。不 同 植 物 不 同 組 織 的 糖 類 需 要 量 也 不 同 ， 實(shí) 驗(yàn) 時(shí) 要 根 據(jù) 配 方 規(guī) 定按 量 稱 取 ， 不 能 任 意 取 量 。在 大 規(guī) 模 生 產(chǎn) 時(shí) ， 可 用 食 用 的 綿 白 糖 代 替 。 VB1對 愈 傷 組 織 的 產(chǎn) 生 和 生 活 力 有 重 要 作 用 ， VB6能 促 進(jìn) 根 的 生長 ， Vpp與 植 物 代 謝 和 胚 的 發(fā) 育 有 一 定 關(guān) 系 。 Vc有 防 止 組 織 變褐 的 作 用 。 2） 維 生 素 (vitamin)這 類 化 合 物 在 植 物 細(xì) 胞 里 主 要 是 以 各 種 輔 酶 的 形 式 參 與 多 種 代 謝活 動(dòng) ， 對 生 長 、 分 化 等 有 很 好 的 促 進(jìn) 作 用 。主 要 有 VBl(鹽 酸 硫 胺 素 )、 VB6(鹽 酸 吡 哆 醇 )、 Vpp(煙 酸 )、 Vc（ 抗 壞 血 酸 ） 、 有 時(shí) 還 使 用 生 物 素 、 葉 酸 、 VB12等 。一 般 用 量 為 0 11 0mg L。 3） 肌 醇 (myoinosltol)在 糖 類 的 相 互 轉(zhuǎn) 化 中 起 重 要 作 用 。 用 于 構(gòu) 建 細(xì) 胞 壁 、 細(xì) 胞 膜 。使 用 濃 度 一 般 為 lOOmg L。 4） 氨 基 酸 (almino acide)是 很 好 的 有 機(jī) 氮 源 ， 可 直 接 被 細(xì) 胞 吸 收 利 用 。培 養(yǎng) 基 中 最 常 用 的 氨 基 酸 是 甘 氨 酸 。用 量 在 10-1000mg L之 間 。由 于 它 們 營 養(yǎng) 豐 富 ， 極 易 引 起 污 染 。 如 在 培 養(yǎng) 中 無 特 別 需 要 ，以 不 用 為 宜 。 4 天 然 復(fù) 合 物 其 成 分 比 較 復(fù) 雜 ， 大 多 含 氨 基 酸 、 激 素 、 酶 等 一些 復(fù) 雜 化 合 物 。 它 對 細(xì) 胞 和 組 織 的 增 殖 與 分 化 有明 顯 的 促 進(jìn) 作 用 ， 但 對 器 官 的 分 化 作 用 不 明 顯 。它 的 成 分 大 多 不 清 楚 ， 所 以 一 般 應(yīng) 盡 量 避 免 使 用 。 1)椰 乳 是 椰 子 的 液 體 胚 乳 。 它 是 使 用 最 多 、 效 果 最 大 的 一 種 天 然 復(fù) 合物 。 一 般 使 用 濃 度 在 10% 20%， 與 其 果 實(shí) 成 熟 度 及 產(chǎn) 地 關(guān) 系 也 很 大 。 它 在愈 傷 組 織 和 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 中 有 促 進(jìn) 作 用 。 在 馬 鈴 薯 莖 尖 分 生 組 織 和 草 莓 微 莖 尖培 養(yǎng) 中 起 明 顯 的 促 進(jìn) 作 用 ， 但 莖 尖 組 織 的 大 小 若 超 過 1nun時(shí) ， 椰 乳 就 不 發(fā)生 作 用 。 2 香 蕉 用 量 為 150-200ml L。 用 黃 熟 的 小 香 蕉 ， 加 入 培 養(yǎng) 基 后 變 為 紫 色 。對 pH值 的 緩 沖 作 用 大 。 主 要 在 蘭 花 的 組 織 培 養(yǎng) 中 應(yīng) 用 ， 對 發(fā) 育 有 促 進(jìn) 作 用 。 3)馬 鈴 薯 (potato) 去 掉 皮 和 芽 后 ， 加 水 煮 30min， 再 經(jīng) 過 過 濾 ， 取 其濾 液 使 用 。 用 量 為 150 200g L。 對 pH值 緩 沖 作 用 也 大 。 添 加 后 可 得 到 健壯 的 植 株 。 4)水 解 酪 蛋 白 為 蛋 白 質(zhì) 的 水 解 物 ， 主 要 成 分 為 氨 基 酸 ， 使 用 濃 度 為100 200mg L。 受 酸 和 酶 的 作 用 易 分 解 ， 使 用 時(shí) 要 注 意 。 5)其 他 酵 母 提 取 液 (YE)(0.01%-0.05%)， 主 要 成 分 為 氨 基 酸 和 維 生 素 類 ；麥 芽 提 取 液 (0.01% 0.5%)、 蘋 果 和 番 茄 的 果 汁 、 黃 瓜 的 果 實(shí) 、 未 熟 玉 米 的胚 乳 等 。 遇 熱 較 穩(wěn) 定 ， 大 多 在 培 養(yǎng) 困 難 時(shí) 使 用 ， 有 時(shí) 有 效 。 5 植 物 生 長 調(diào) 節(jié) 物 (hormone) 植 物 激 素 是 植 物 新 陳 代 謝 中 產(chǎn) 生 的 天 然 化 合 物 ，它 能 以 極 微 小 的 量 影 響 到 植 物 的 細(xì) 胞 分 化 、 分 裂 、發(fā) 育 ， 影 響 到 植 物 的 形 態(tài) 建 成 、 開 花 、 結(jié) 實(shí) 、 成熟 、 脫 落 、 衰 老 和 休 眠 以 及 萌 發(fā) 等 許 許 多 多 的 生理 生 化 活 動(dòng) ， 在 培 養(yǎng) 基 的 各 成 分 中 ， 植 物 生 長 調(diào)節(jié) 物 是 培 養(yǎng) 基 的 關(guān) 鍵 物 質(zhì) ， 對 植 物 組 織 培 養(yǎng) 起 著決 定 性 作 用 。 1） 生 長 素 類 (auxin)在 組 織 培 養(yǎng) 中 ， 生 長 素 主 要 被 用 于 誘 導(dǎo) 愈 傷 組 織 形 成 ， 誘 導(dǎo) 根 的分 化 和 促 進(jìn) 細(xì) 胞 分 裂 、 伸 長 生 長 。在 促 進(jìn) 生 長 方 面 ， 根 對 生 長 素 最 敏 感 。 在 極 低 的 濃 度 下 ， (10-510-8rng L)就 可 促 進(jìn) 生 長 ， 其 次 是 莖 和 芽 。天 然 的 生 長 素 熱 穩(wěn) 定 性 差 ， 高 溫 高 壓 或 受 光 條 件 易 被 破 壞 。 在 植物 體 內(nèi) 也 易 受 到 體 內(nèi) 酶 的 分 解 。組 織 培 養(yǎng) 中 常 用 人 工 合 成 的 生 長 素 類 物 質(zhì) 。 IAA(indo acetic acid吲 哚 乙 酸 )是 天 然 存 在 的 生 長 素 ， 亦 可 人 工合 成 ， 其 活 力 較 低 ， 是 生 長 素 中 活 力 最 弱 的 激 素 ， 對 器 官 形 成的 副 作 用 小 、 ， 高 溫 高 壓 易 被 破 壞 ， 也 易 被 細(xì) 胞 中 的 1AA分 解酶 降 解 ， 受 光 也 易 分 解 。 NAA(naphthalene acetic acid萘 乙 酸 )在 組 織 培 養(yǎng) 中 的 起 動(dòng) 能 力要 比 IAA高 出 3-4倍 ， 且 由 于 可 大 批 量 人 工 合 成 ， 耐 高 溫 高 壓 ，不 易 被 分 解 破 壞 ， 所 以 應(yīng) 用 較 普 遍 。 NAA和 IBA廣 泛 用 于 生 根 ，并 與 細(xì) 胞 分 裂 素 互 作 促 進(jìn) 芽 的 增 殖 和 生 長 。 IBA(indolebutyri acid吲 哚 丁 酸 )是 促 進(jìn) 發(fā) 根 能 力 較 強(qiáng) 的 生 長 調(diào)節(jié) 物 質(zhì) 。 2， 4D(2， 4二 氯 苯 氧 乙 酸 )起 動(dòng) 能 力 比 IAA高 10倍 ， 特 別 在促 進(jìn) 愈 傷 組 織 的 形 成 上 活 力 最 高 ， 但 它 強(qiáng) 烈 抑 制 芽 的 形 成 ， 影響 器 官 的 發(fā) 育 。 適 宜 的 用 量 范 圍 較 狹 窄 ， 過 量 常 有 毒 效 應(yīng) 。 在 培 養(yǎng) 基 中 添 加 細(xì) 胞 分 裂 素 有 三 個(gè) 作 用 ： 誘 導(dǎo) 芽 的 分 化 促 進(jìn) 側(cè) 芽 萌 發(fā) 生 長 。 促 進(jìn) 細(xì) 胞 分 裂 與 擴(kuò) 大 。 抑 制 根 的 分 化 。 因 此 ， 細(xì) 胞 分 裂 素 多 用 于 誘 導(dǎo) 不 定 芽 的 分 化 和莖 、 苗 的 增 殖 ， 而 在 生 根 培 養(yǎng) 時(shí) 使 用 較 少 或 用 量 較 低 。2） 細(xì) 胞 分 裂 素 類 ( cytokinin )這 類 激 素 是 腺 嘌 吟 的 衍 生 物 ， 包 括 6BA(6芐 基 氨 基 嘌 呤 )、 Kt (kinetin 激 動(dòng) 素 )、 Zt (zeatin 玉 米 素 )等 。 其 中 Zt活 性 最 強(qiáng) ， 但 非常 昂 貴 ， 常 用 的 是 6BA。 有 20多 種 ， 培 養(yǎng) 基 中 添 加 的 是 GA3。 主 要 用 于 促 進(jìn) 幼 苗 莖 的 伸 長 生 長 ， 促 進(jìn) 不 定 胚發(fā) 育 成 小 植 株 。 赤 霉 素 和 生 長 素 協(xié) 同 作 用 ， 對 形 成 層 的 分 化 有影 響 ， 當(dāng) 生 長 素 赤 霉 素 比 值 高 時(shí) 有 利 于 木 質(zhì)部 分 化 ， 比 值 低 時(shí) 有 利 于 韌 皮 部 分 化 。GA ( gibberellic acid赤 霉 素 ) 激 素 配 比 模 式 高 有 利 于 根 的 形 成 和 愈 傷 組 織 的 形 成 生 長 素 /細(xì) 胞 分 裂 素 適 中 有 利 于 根 芽 的 分 化 低 有 利 于 芽 的 形 成生 長 素 與 細(xì) 胞 分 裂 素 的 比 例 決 定 著 發(fā) 育 的 方 向 ， 是 愈 傷 組 織 、 長 根 還 是 長 芽 。 如 為 了 促 進(jìn) 芽 器 官 的 分 化 ， 應(yīng) 除 去 或 降 低 生 長 素 的 濃 度 ， 或 者 調(diào) 整 培 養(yǎng) 基 中 生 長 素 與 細(xì) 胞 分 裂 素 的 比 例 。 在 組 織 培 養(yǎng) 中 一 般 生 長 素 濃 度 的 使 用 為 0.05-5mg L， 細(xì) 胞 分 裂 素 0.0510mg L。生 長 調(diào) 節(jié) 物 質(zhì) 的 使 用 甚 微 ， 一 般 用 mg L表 示 濃 度 。 G rowth medium is optimised for regeneration of plantlets No sucrose (0%)Sucrose reduced to 1% Sucrose increased to 5%The explant is completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface Very few shoots have developed on the explant. No roots and no callus.Shoots developed on edges of upper surface, and some root development has occured Shoots have developed over the surface of the explant, along with roots from the lower surface. The result is comparable with the control mediumtissue culture in the African Violet No BAP BAP reduced to 0.1 mg. l-1 No NAA Poor shoot development and no roots. Extensive callus generationPoor shoot development and no roots NAA reduced to 0.1 mg. l-1 More balanced development of roots and shoots. However, undifferentiated callus is developing at the edges of the explantProfuse development of roots and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant NAA increased to 5.0 mg. l-1Profuse development of roots over the explant upper and lower surface, and few shoots. Some callus No MS saltsNo sign of regeneration from explant at all. MS salts reduced to 0.47 g. l -1 Some root growth but reduced development of shoots MS salts increased to 9.52 g. l-1 Shoots developed on upper surface of explant. No roots or callus. 6 培 養(yǎng) 材 料 的 支 持 物 瓊 脂 是 一 種 由 海 藻 中 提 取 的 高 分 子 碳 水 化 合 物 ， 本 身 并 不 提 供 任何 營 養(yǎng) 。 瓊 脂 能 溶 解 在 熱 水 中 ， 成 為 溶 膠 ， 冷 卻 至 40C即 凝 固 為固 體 狀 凝 膠 。 瓊 脂 的 用 量 在 6 10g L之 間 ， 若 濃 度 太 高 ， 培 養(yǎng) 基 就 會(huì) 變 得 很硬 ， 營 養(yǎng) 物 質(zhì) 難 以 擴(kuò) 散 到 培 養(yǎng) 的 組 織 中 去 。 若 濃 度 過 低 ， 凝 固 性不 好 。 新 買 來 的 瓊 脂 最 好 先 試 一 下 它 的 凝 固 力 。 一 般 瓊 脂 以 顏 色 淺 、 透 明 度 好 、 潔 凈 的 為 上 品 。 瓊 脂 的 凝 固 能 力除 與 原 料 、 廠 家 的 加 工 方 式 有 關(guān) 外 ， 還 與 高 壓 滅 菌 時(shí) 的 溫 度 、 時(shí)間 、 pH值 等 因 素 有 關(guān) ， 長 時(shí) 間 的 高 溫 會(huì) 使 凝 固 能 力 下 降 ， 過 酸 過堿 加 之 高 溫 會(huì) 使 瓊 脂 發(fā) 生 水 解 ， 喪 失 凝 固 能 力 。 時(shí) 間 過 久 ， 瓊 脂 變 褐 ， 也 會(huì) 逐 漸 喪 失 凝 固 能 力 。 瓊 脂 (agar) 在 固 體 培 養(yǎng) 時(shí) 瓊 脂 是 最 好 的 固 化 劑 。 培 養(yǎng) 物 與 培 養(yǎng) 基 的 接 觸 (即 吸 收 )面 積 小 ，各 種 養(yǎng) 分 在 瓊 脂 中 擴(kuò) 散 較 慢 ， 影 響 養(yǎng) 分 的 充 分 利 用 ，培 養(yǎng) 物 排 出 的 一 些 代 謝 廢 物 ， 聚 集 在 吸 收 表 面 ， 對 組 織 產(chǎn) 生 毒 害 作 用 。市 售 的 各 種 瓊 脂 幾 乎 都 含 有 雜 質(zhì) ， 特 別 是 Ca、 Mg及 其 他 微 量 元 素 。加 入 瓊 脂 的 固 體 培 養(yǎng) 基 與 液 體 培 養(yǎng) 基 相 比 優(yōu) 缺 點(diǎn) ：優(yōu) 點(diǎn) ：在 于 操 作 簡 便 ， 通 氣 問 題 易 于 解 決 ， 便 于 經(jīng) 常 觀 察 研 究 等 ，缺 點(diǎn) ： 因 此 在 研 究 植 物 組 織 或 細(xì) 胞 的 營 養(yǎng) 問 題 時(shí) ， 則 應(yīng) 避 免 使 用 瓊 脂 。可 在 液 體 培 養(yǎng) 基 表 面 安 放 一 個(gè) 無 菌 濾 紙 制 成 的 濾 紙 橋 ， 然 后 在濾 紙 橋 上 進(jìn) 行 愈 傷 組 織 培 養(yǎng) 。 7 抗 生 物 質(zhì) (antibiotic) 抗 生 素 對 植 物 組 織 的 生 長 也 有 抑 制 作 用 ， 可 能 某 些 植 物適 宜 用 青 霉 素 ， 而 另 一 些 植 物 卻 不 大 適 應(yīng) 。 在 工 作 中 不 能 以 為 有 了 抗 菌 素 ， 而 放 松 滅 菌 措 施 。 在 停 止 抗 生 素 使 用 后 ， 往 往 污 染 率 顯 著 上 升 ， 這 可 能 是原 來 受 抑 制 的 菌 類 又 滋 生 起 來 造 成 ?？?生 物 質(zhì) 有 青 霉 素 、 鏈 霉 素 、 慶 大 霉 素 等 ， 用 量 在 520mg/L之 間 。添 加 抗 生 物 質(zhì) 可 防 止 菌 類 污 染 ， 減 少 培 養(yǎng) 中 材 料 的 損 失 ， 尤 其 是 快速 繁 殖 中對 于 剛 感 染 的 組 織 材 料 ， 可 向 培 養(yǎng) 基 中 注 入 5%10%的 抗 菌 素 。抗 生 素 各 有 其 抑 菌 譜 ， 要 加 以 選 擇 試 用 ， 也 可 兩 種 抗 生 素 混 用 。注 意 ： 8 活 性 炭 (active carbon) 活 性 炭 為 木 炭 粉 碎 經(jīng) 加 工 形 成 的 粉 沫 結(jié) 構(gòu) ， 有 很 強(qiáng) 的吸 附 作 用 ， 它 的 顆 粒 大 小 決 定 著 吸 附 能 力 、 粒 度 越 小 ，吸 附 能 力 越 大 。 溫 度 低 吸 附 力 強(qiáng) ， 溫 度 高 吸 附 力 減 弱 ，甚 至 解 吸 附 。 通 常 使 用 濃 度 為 0.5l0g L。 它 可 以 吸 附 非 極 性 物 質(zhì)和 色 素 等 大 分 子 物 質(zhì) ， 包 括 瓊 脂 中 所 含 的 雜 質(zhì) ， 培 養(yǎng)物 分 泌 的 酚 、 醌 類 物 質(zhì) 以 及 蔗 糖 在 高 壓 消 毒 時(shí) 產(chǎn) 生 的5羥 甲 基 糖 醛 及 激 素 等 。 活 性 炭 的 應(yīng) 用 莖 尖 初 代 培 養(yǎng) ， 加 入 適 量 活 性 炭 ， 可 以 吸 附 外 植 體 產(chǎn) 生 的 致 死 性褐 化 物 ， 其 效 力 優(yōu) 于 Vc和 半 胱 氨 酸 ； 在 新 梢 增 殖 階 段 ， 活 性 炭 可明 顯 促 進(jìn) 新 梢 的 形 成 和 伸 長 ， 但 其 作 用 有 一 個(gè) 閾 值 ， 一 般 為0.1% 0.2%， 不 能 超 過 0.2%。 活 性 炭 在 生 根 時(shí) 有 明 顯 的 促 進(jìn) 作 用 ， 其 機(jī) 理 一 般 認(rèn) 為 與 活 性 炭 減弱 光 照 有 關(guān) ， 可 能 是 由 于 根 頂 端 產(chǎn) 生 促 進(jìn) 根 生 長 的 IAA， 但 IAA易受 可 見 光 的 光 氧 化 而 破 壞 ， 因 此 活 性 炭 的 主 要 作 用 就 在 于 通 過 減弱 光 照 保 護(hù) 了 IAA， 從 而 間 接 促 進(jìn) 了 根 的 生 長 ， 由 于 根 的 生 長 加快 ， 吸 收 能 力 增 強(qiáng) ， 反 過 來 又 促 進(jìn) 莖 、 葉 的 生 長 。 此 外 ， 在 培 養(yǎng) 基 中 加 入 0.3%活 性 炭 ， 還 可 降 低 玻 璃 苗 的 產(chǎn) 生 頻 率 ，對 防 止 產(chǎn) 生 玻 璃 苗 有 良 好 作 用 。 活 性 炭 在 胚 胎 培 養(yǎng) 中 也 有 一 定 作 用 ， 如 在 葡 萄 胚 珠 培 養(yǎng) 時(shí) 向 培 養(yǎng) 基 加 入 0.1%的 活 性 炭 ， 可 減 少 組 織 變 褐 和 培 養(yǎng) 基 變 色 ， 產(chǎn) 生 較 少的 愈 傷 組 織 。 但 是 ， 活 性 炭 具 有 副 作 用 ， 研 究 表 示 ， 每 毫 克 的 活性 炭 能 吸 附 l00ng左 右 的 生 長 調(diào) 節(jié) 物 質(zhì) ， 這 說 明 只需 要 極 少 量 的 活 性 炭 就 可 以 完 全 吸 附 培 養(yǎng) 基 中 的 調(diào)節(jié) 物 質(zhì) 。 大 量 的 活 性 炭 加 入 會(huì) 削 弱 瓊 脂 的 凝 固 能 力 ，因 此 要 多 加 一 些 瓊 脂 。 很 細(xì) 的 活 性 炭 也 易 沉 淀 ， 通常 在 瓊 脂 凝 固 之 前 ， 要 輕 輕 搖 動(dòng) 培 養(yǎng) 瓶 。 總 之 ， 那種 隨 意 抓 一 撮 活 性 炭 放 人 培 養(yǎng) 基 ， 會(huì) 帶 來 不 良 的 后果 。 因 此 ， 在 使 用 時(shí) 要 有 其 量 的 意 識(shí) ， 使 活 性 炭 發(fā)揮 其 積 極 作 用 。 D 培 養(yǎng) 基 的 制 備 所 謂 母 液 是 欲 配 制 液 的 濃 縮 液 ， 這 樣 不 但 可 以 保 證 各 物質(zhì) 成 分 的 準(zhǔn) 確 性 及 配 制 時(shí) 的 快 速 移 取 ， 而 且 還 便 于 低 溫保 藏 。 一 般 母 液 配 成 比 所 需 濃 度 高 10-200倍 。 母 液 配 制 時(shí) 可 分 別 配 成 大 量 元 素 （ 濃 縮 20倍 )、 微 量 元素 (濃 縮 200倍 ） 、 鐵 鹽 （ 濃 縮 200倍 ） 、 除 蔗 糖 以 外 的有 機(jī) 物 質(zhì) （ 濃 縮 200倍 ） 和 激 素 類 （ 1g/L） 等 5種 。一 、 母 液 (stock solution)的 配 制 和 保 存1 什 么 是 母 液 ？ 配 制 母 液 時(shí) 要 用 蒸 餾 水 或 重 蒸 餾 水 。 藥 品 應(yīng) 選 取 等 級 較 高 的 化 學(xué) 純 或 分 析 純 。 藥 品 的 稱 量 及 定 容 都 要 準(zhǔn) 確 。 各 種 藥 品 先 以 少 量 水 讓 其 充 分 溶 解 ， 然 后 依 次 混 合 。 母 液 配 好 后 都 應(yīng) 貯 存 于 適 當(dāng) 的 塑 料 瓶 或 玻 璃 瓶 中 ， 置 冰 箱 內(nèi) 低溫 保 存 ， 用 時(shí) 再 按 比 例 稀 釋 。 鐵 鹽 貯 備 液 必 須 貯 存 于 棕 色 玻 璃瓶 中 。 母 液 在 使 用 之 前 必 須 輕 輕 搖 動(dòng) 瓶 子 ， 如 發(fā) 現(xiàn) 其 中 有 沉 淀 懸 浮 物或 微 生 物 污 染 ， 必 須 立 即 將 其 淘 汰 。2 母 液 配 制 的 注 意 事 項(xiàng) ： 生 長 素 配 制 時(shí) 可 先 用 少 量 95%酒 精 助 溶 。 2， 4 D可 用 O 1mol L的 NaOH或 KOH助 溶 ， 加 入 溫 水 定 容 。 生 長 素 常 配 成 1mg ml的 溶 液貯 于 冰 箱 中 備 用 。 細(xì) 胞 分 裂 素 類 一 般 先 用 少 量 1N鹽 配 溶 解 后 ， 再 加 入 溫 水 冷 卻 后 定容 ， 貯 于 冰 箱 中 備 用 。 鐵 鹽 配 法 （ MS為 例 ） ： 在 裝 有 400ml 蒸 餾 水 的 燒 杯 中 加 入 2粒 苛性 鈉 ， 溶 解 后 加 入 3.73g EDTA-Na2， 加 熱 使 其 全 部 溶 解 ， 然 后 邊攪 拌 邊 慢 慢 加 入 2.78g FeSO4.7H2O直 至 全 部 溶 解 ， 冷 卻 后 定 容 至500ml， 置 于 棕 色 瓶 冰 箱 中 備 用 。二 、 母 液 的 配 制 方 法將 培 養(yǎng) 基 配 方 中 的 各 種 成 分 分 別 配 成 一 定 濃 度 的 母 液 。一 般 用 a:b表 示 ， 即 每 b毫 升 溶 液 中 含 有 a毫 克 溶 質(zhì) 。2 注 意 事 項(xiàng) ：1單 配 法 ： 三 、 培 養(yǎng) 基 配 制 程 序水 藥 品 糖瓊 脂 水玻 璃 器 皿 及 其 他 準(zhǔn) 備+ + 加 熱 融 化混 勻 混 合調(diào) 節(jié) PH 值定 容分 裝 滅 菌冷 卻接 種 稱 出 規(guī) 定 數(shù) 量 的 瓊 脂 和 蔗 糖 ， 加 水 直 到 培 養(yǎng) 基 最 終 容 積的 3/4， 加 熱 使 之 溶 解 。 在 配 制 液 體 培 養(yǎng) 基 時(shí) 則 無 需 加熱 。 分 別 加 入 一 定 量 的 各 種 貯 備 液 ， 包 括 生 長 調(diào) 節(jié) 劑 和 其 他的 特 殊 加 物 。 加 蒸 餾 水 直 至 培 養(yǎng) 基 的 最 終 容 積 。 充 分 混 合 后 ， 用 0.1mol/L的 氫 氧 化 鈉 或 鹽 酸 調(diào) 節(jié) 培 養(yǎng) 基的 pH值 （ 6.0） 。 把 培 養(yǎng) 基 分 裝 到 所 選 用 的 培 養(yǎng) 容 器 中 ， 每 個(gè) 150毫 升 的三 角 瓶 約 裝 50毫 升 。 用 適 宜 的 塞 或 蓋 封 嚴(yán) 瓶 口 。 滅 菌 。 使 培 養(yǎng) 基 在 室 溫 下 冷 卻 ， 置 冰 箱 中 在 4 下 保 存 。 做 上標(biāo) 記 。 滅 菌 后 的 培 養(yǎng) 基 最 好 在 短 期 內(nèi) 使 用 ， 臨 時(shí) 可 在 黑 暗 條 件下 低 溫 保 存 。 一 般 不 宜 重 復(fù) 消 毒 。 移 液 器四 、 常 用 設(shè) 備 移 液 管 電 子 天 平 酸 度 計(jì)酸 度 計(jì) 簡 稱 pH計(jì) ， 由 電 極 和 電 計(jì) 兩 部 分 組 成 。 電 爐 E 培 養(yǎng) 基 的 選 擇 在 建 立 一 個(gè) 新 的 實(shí) 驗(yàn) 體 系 時(shí) ， 為 了 能 研 制 出 一 種 適 合 的 培養(yǎng) 基 ， 最 好 先 由 一 種 已 被 廣 泛 使 用 的 基 本 培 養(yǎng) 基 (如 Ms培 養(yǎng)基 或 B5培 養(yǎng) 基 )開 始 。 當(dāng) 通 過 一 系 列 的 實(shí) 驗(yàn) ， 對 這 種 培 養(yǎng) 基做 了 某 些 定 性 和 定 量 的 小 變 動(dòng) 之 后 ， 即 有 可 能 得 到 一 種 能滿 足 實(shí) 驗(yàn) 需 要 的 新 培 養(yǎng) 基 ， 選 擇 最 佳 培 養(yǎng) 基 。 常 用 試 驗(yàn) 方 法 主 要 有 單 因 子 試 驗(yàn) 、 多 因 子 試 驗(yàn) 及 廣 譜 實(shí) 驗(yàn)等 。 一 、 單 因 子 試 驗(yàn) 在 單 因 子 試 驗(yàn) 中 由 于 培 養(yǎng) 基 中 其 他 成 分 都 維 持 在 一 般 水 平上 ， 所 以 只 變 動(dòng) 一 個(gè) 因 子 ， 就 可 以 找 出 這 一 因 子 對 試 驗(yàn) 的 影響 和 影 響 的 程 度 。 例 如 Ms基 本 培 養(yǎng) 基 的 其 他 成 分 和 用 量 都 不變 ， 只 變 動(dòng) NAA用 量 對 某 一 培 養(yǎng) 物 生 根 的 影 響 ， 這 種 只 研 究一 個(gè) 因 素 的 試 驗(yàn) 就 是 單 因 子 試 驗(yàn) 。 生 物 學(xué) 試 驗(yàn) 不 同 于 物 理 學(xué) 或 化 學(xué) 試 驗(yàn) ， 最 顯 著 的 差 別 是 在 生物 學(xué) 試 驗(yàn) 中 必 需 設(shè) 置 對 照 組 與 試 驗(yàn) 組 ， 試 驗(yàn) 組 可 以 有 一 組 或幾 組 ， 隨 試 驗(yàn) 的 復(fù) 雜 性 而 設(shè) 置 ， 對 照 組 也 可 能 有 一 組 以 上 。試 驗(yàn) 中 要 求 對 照 組 與 試 驗(yàn) 組 中 的 試 驗(yàn) 個(gè) 體 ， 即 植 物 組 織 塊 或其 他 培 養(yǎng) 物 ， 必 須 在 遺 傳 性 、 生 理 狀 態(tài) 、 前 培 養(yǎng) 條 件 等 方 面 ，盡 可 能 完 全 一 致 。 以 保 證 試 驗(yàn) 結(jié) 果 是 來 源 于 試 驗(yàn) 因 子 ， 而 不是 由 于 試 驗(yàn) 材 料 的 不 一 致 導(dǎo) 致 的 。 試 驗(yàn) 中 各 處 理 一 般 都 要 設(shè) 有 一 定 的 重 復(fù) ， 以 取 得 可 靠 的 試 驗(yàn)結(jié) 果 。 隨 試 驗(yàn) 規(guī) 模 和 要 求 不 同 ， 大 多 每 個(gè) 項(xiàng) 目 要 有 4 10瓶 ， 每 瓶 至 少 3塊 培 養(yǎng) 物 或 3叢 小 幼 苗 。 2種 激 素 5種 濃 度 的 實(shí) 驗(yàn) 組 合6-BAmg/L） 0 0.5 2.5 5 10NAA 0 1 2 3 4 5(mg/L) 0.5 6 7 8 9 10 2.5 11 12 13 14 15 5 16 17 18 19 20 10 21 22 23 24 25 對 培 養(yǎng) 基 中 兩 個(gè) 或 兩 個(gè) 以 上 因 素 進(jìn) 行 研 究 的 試 驗(yàn) 稱 為 多 因 子 實(shí)驗(yàn) ， 試 驗(yàn) 可 采 用 完 全 試 驗(yàn) 方 案 ， 也 可 選 用 正 交 設(shè) 計(jì) 方 案 ， 完 全 試驗(yàn) 方 案 具 有 均 衡 完 全 的 特 點(diǎn) ， 各 個(gè) 因 子 的 每 個(gè) 水 平 都 相 互 搭 配 ，構(gòu) 成 了 所 有 可 能 的 處 理 組 合 ， 如 研 究 NAA和 6 BA的 最 佳 濃 度 組 合 ，每 個(gè) 因 子 各 設(shè) 5個(gè) 濃 度 水 平 (0， 0.5， 2.5， 5， 10mg L)， 這 兩 種因 子 各 種 濃 度 的 所 有 組 合 ， 就 構(gòu) 成 了 一 個(gè) 具 有 25項(xiàng) 處 理 的 試 驗(yàn) 見表 3 3。 二 、 多 因 子 試 驗(yàn) 三 、 逐 步 添 加 和 逐 步 排 除 的 試 驗(yàn) 方 法 在 植 物 組 織 分 化 與 再 生 的 研 究 中 ， 在 沒 有 取 得 可 靠 的 分化 與 再 生 之 前 ， 往 往 添 加 各 種 有 機(jī) 營 養(yǎng) 成 分 ， 而 在 取 得了 穩(wěn) 定 的 再 生 之 后 ， 就 可 以 逐 步 減 少 這 些 成 分 。 在 逐 步 添 加 時(shí) 是 使 試 驗(yàn) 成 功 ， 在 逐 步 減 少 時(shí) 是 縮 小 范 圍 ，以 便 找 到 最 有 影 響 力 的 因 子 ， 或 是 為 了 實(shí) 用 上 的 需 要 竭力 使 培 養(yǎng) 基 簡 化 ， 以 降 低 成 本 和 利 于 推 廣 。 在 尋 求 最 佳 激 素 配 比 時(shí) ， 也 經(jīng) 常 用 到 這 種 加 加 減 減 的 簡單 方 法 。 四 、 廣 譜 實(shí) 驗(yàn) 法 在 廣 譜 實(shí) 驗(yàn) 法 中 ， 把 培 養(yǎng) 基 中 所 有 組 分 分 為 4大 類 ： 無 機(jī)鹽 、 有 機(jī) 營 養(yǎng) 物 質(zhì) (蔗 糖 、 氨 基 酸 和 肌 醇 等 )、 生 長 素 、 細(xì)胞 分 裂 素 。 對 每 一 類 物 質(zhì) 選 定 低 (L)、 中 (M)、 和 高 (H)3個(gè) 濃 度 。 4類物 質(zhì) 各 3種 濃 度 的 自 由 組 合 即 構(gòu) 成 了 一 項(xiàng) 包 括 81個(gè) 處 理 的實(shí) 驗(yàn) 。 在 這 81個(gè) 處 理 中 最 好 的 一 個(gè) 可 用 4個(gè) 字 母 表 示 。 例 如 ， 一個(gè) 包 含 中 等 濃 度 無 機(jī) 鹽 ， 低 等 濃 度 生 長 素 、 中 等 濃 度 細(xì) 胞分 裂 素 和 高 等 濃 度 有 機(jī) 營 養(yǎng) 物 質(zhì) 的 處 理 即 可 表 示 為 MLMH。 達(dá) 到 這 個(gè) 階 段 ， 再 試 用 不 同 類 型 的 生 長 素 和 細(xì) 胞 分 裂 素 即可 找 到 培 養(yǎng) 基 的 最 佳 配 方 。 這 是 因 為 不 同 類 型 的 生 K素 和細(xì) 胞 分 裂 素 對 不 同 植 物 的 活 性 有 所 不 同 。 環(huán) 境 條 件 在 植 物 組 織 培 養(yǎng) 中 溫 度 、 光 照 、 濕 度 等 各 種 環(huán) 境條 件 ； 培 養(yǎng) 基 組 成 、 pH 值 、 滲 透 壓 等 各 種 化 學(xué) 環(huán) 境 條件 都 會(huì) 影 響 組 織 培 養(yǎng) 育 苗 的 生 長 和 發(fā) 育 。 1 溫 度 (temperature) 溫 度 不 僅 影 響 植 物 組 織 培 養(yǎng) 育 苗 的 生 長 速 度 ， 也 影響 其 分 化 增 殖 以 及 器 官 建 成 等 發(fā) 育 進(jìn) 程 。 不 同 植 物 培 養(yǎng) 的 適 溫 不 同 . 不 同 培 養(yǎng) 目 標(biāo) 采 用 的 培 養(yǎng) 溫 度 也 不 同 . 大 多 數(shù) 植 物 組 織 培 養(yǎng) 都 是 在 23 27 之 間 進(jìn) 行 ， 一般 采 用 25 2 。 2 光 照 (light) 一 般 來 說 ， 光 照 強(qiáng) 度 較 強(qiáng) ， 幼 苗 生 長 的 粗 壯 ， 而 光 照 強(qiáng)度 較 弱 幼 苗 容 易 徒 長 。 離 體 培 養(yǎng) 中 一 般 光 量 在 2000-3000lx。組 培 中 光 照 是 重 要 的 條 件 之 一 ， 主 要 表 現(xiàn) 在 光 強(qiáng) 、 光 質(zhì) 、 以 及光 照 時(shí) 間 方 面 ： 1） 光 照 強(qiáng) 度 (light intensity) 2） 光 質(zhì) (light wave) 光 質(zhì) 對 愈 傷 組 織 誘 導(dǎo) ， 培 養(yǎng) 組 織 的 增 殖 以 及 器 官 的分 化 都 有 明 顯 的 影 響 。 對 苗 再 生 最 有 利 的 光 譜 是 藍(lán) 光 區(qū) ， 根 的 發(fā) 生 則 是 紅光 區(qū) 。 3） 光 周 期 (light period) 試 管 苗 培 養(yǎng) 時(shí) 要 選 用 一 定 的 光 暗 周 期 來 進(jìn) 行組 織 培 養(yǎng) ， 一 般 每 天 光 照 12-16小 時(shí) 。 3 濕 度 (humidity) 容 器 內(nèi) 主 要 受 培 養(yǎng) 基 水 分 含 量 和 封 口 材 料 的 影 響 。 前 者 又 受 瓊 脂含 量 的 影 響 。 在 冬 季 應(yīng) 適 當(dāng) 減 少 瓊 脂 用 量 ， 否 則 ， 將 使 培 養(yǎng) 基 干硬 ， 以 致 不 利 于 外 植 體 接 觸 或 插 進(jìn) 培 養(yǎng) 基 ， 導(dǎo) 致 生 長 發(fā) 育 受 阻 。封 口 材 料 直 接 影 響 容 器 內(nèi) 濕 度 情 況 ， 但 封 閉 性 較 高 的 封 口 材 料 易引 起 透 氣 性 受 阻 ， 也 會(huì) 導(dǎo) 致 植 物 生 長 發(fā) 育 受 影 響 。 環(huán) 境 的 相 對 濕 度 可 以 影 響 培 養(yǎng) 基 的 水 分 蒸 發(fā) ， 一 般 要 求 70% 80%的 相 對 濕 度 ， 常 用 加 濕 器 或 經(jīng) 常 灑 水 的 方 法 來 調(diào) 節(jié) 濕 度 。 濕 度 過低 會(huì) 使 培 養(yǎng) 基 喪 失 大 量 水 分 ， 導(dǎo) 致 培 養(yǎng) 基 各 種 成 分 濃 度 的 改 變 和滲 透 壓 的 升 高 ， 進(jìn) 而 影 響 組 織 培 養(yǎng) 的 正 常 進(jìn) 行 。 濕 度 過 高 時(shí) ， 易 引 起 棉 塞 長 霉 ， 造 成 污 染 。 濕 度 的 影 響 包 括 培 養(yǎng) 容 器 保 持 和 環(huán) 境 的 濕 度 條 件 4 滲 透 壓 (penetrating pressure) 培 養(yǎng) 基 中 由 于 有 添 加 的 鹽 類 、 蔗 糖 等 化 合 物 ， 因 此 ， 影響 到 滲 透 壓 的 變 化 。 培 養(yǎng) 基 各 種 物 質(zhì) 中 ， 糖 對 培 養(yǎng) 基 滲 透 壓 起 決 定 性 作 用 。因 此 調(diào) 節(jié) 滲 透 壓 往 往 從 調(diào) 節(jié) 糖 濃 度 著 手 。 5 pH值 (pH value) 不 同 的 植 物 對 培 養(yǎng) 基 最 適 pH值 的 要 求 也 是 不 同 的 (表 2 1)， 大 多在 5-6.5左 右 ， 一 般 培 養(yǎng) 基 皆 要 求 5.8. pH值 適 度 因 材 料 而 異 ， 也 因 培 養(yǎng) 基 的 組 成 而 不 同 。 以 硝 態(tài) 氮 作 氮源 和 以 銨 態(tài) 氮 作 氮 源 就 不 一 樣 ， 后 者 較 高 一 些 。 一 般 來 說 當(dāng) pH值高 于 6 5時(shí) ， 培 養(yǎng) 基 全 變 硬 ； 低 于 5時(shí) ， 瓊 脂 不 能 很 好 地 凝 固 。 高 溫 滅 菌 會(huì) 降 低 pH值 (約 0.2 0.3個(gè) pH值 )， 因 此 在 配 制 時(shí) 常 提 高pH值 0 2 0 3單 位 。 pH值 大 小 調(diào) 整 可 用 0 1M的 NaOH和 0 IM的 HCI來 調(diào) 整 。 lml的 NaOH可 使 pH值 升 高 0 2單 位 ， lml的 HCl可 使 pH值 降 低 0 2單 位 。 調(diào) 節(jié) 時(shí) 一 定 要 充 分 攪 拌 均 勻 。 種 類 最 適 pH 值 種 類 最 適 pH 值杜 鵑 4.0 月 季 5.8越 桔 4.5 胡 蘿 卜 、 石 刁柏 6.0蠶 豆 5.5 桃 7.0番 茄 5.7 不 同 植 物 的 最 適 pH值 6 氧 氣 (oxygen) 氧 氣 是 組 織 培 養(yǎng) 中 必 需 的 因 素 ， 瓶 蓋 封 閉 時(shí) 要 考 慮通 氣 問 題 ， 可 用 附 有 濾 氣 膜 的 封 口 材 料 。 通 氣 最 好的 是 棉 塞 封 閉 瓶 口 ， 但 棉 塞 易 使 培 養(yǎng) 基 干 燥 ， 夏 季易 引 起 污 染 。 固 體 培 養(yǎng) 基 可 加 進(jìn) 活 性 炭 來 增 加 通 氣 度 ， 以 利 于 發(fā)根 。 培 養(yǎng) 室 要 經(jīng) 常 換 氣 ， 改 善 室 內(nèi) 的 通 氣 狀 況 。 液 體 振 蕩 培 養(yǎng) 時(shí) ， 要 考 慮 振 蕩 的 次 數(shù) 、 振 幅 等 ， 同時(shí) 要 考 慮 容 器 的 類 型 、 培 養(yǎng) 基 等 練 習(xí) ： 培 養(yǎng) 基 一 般 包 括 哪 些 基 本 成 分 ？ 起 作 用 是 什么 ？ 培 養(yǎng) 基 的 配 制 步 驟 及 注 意 事 項(xiàng) ？ 用 于 植 物 組 織 培 養(yǎng) 的 植 物 生 長 調(diào) 節(jié) 物 質(zhì) 主 要有 哪 兩 種 ？ 他 們 在 組 培 中 各 起 什 么 作 用 ？ 接 種 后 的 離 體 培 養(yǎng) 物 對 光 、 溫 度 、 濕 度 等 有何 具 體 要 求 ？ 如 何 調(diào) 控 ？ 第 五 章 組 培 苗 的 培 養(yǎng) 、 試 管 苗 的馴 化 與 移 栽 指 把 培 養(yǎng) 材 料 放 在 培 養(yǎng) 室 (有 光 照 、 溫 度 條 件 )里 ，使 之 生 長 ， 分 裂 和 分 化 形 成 愈 傷 組 織 或 進(jìn) 一 步 分 化成 再 生 植 株 的 過 程 。 培 養(yǎng) 一 、 培 養(yǎng) 方 法 (1)固 體 培 養(yǎng) 法 即 用 瓊 脂 固 化 培 養(yǎng) 基 來 培 養(yǎng) 植 物 材 料 的 方 法 。 是 現(xiàn) 在 最常 用 的 方 法 。 雖 然 該 方 法 設(shè) 備 簡 單 ， 易 行 ， 但 養(yǎng) 分 分 布 不 均 ，生 長 速 度 不 均 衡 ， 并 常 有 褐 化 中 毒 現(xiàn) 象 發(fā) 生 。 (2)液 體 培 養(yǎng) 法 即 用 不 加 固 化 劑 的 液 體 培 養(yǎng) 基 培 養(yǎng) 植 物 材 料 的 方 法 。 由于 液 體 中 氧 氣 含 量 較 少 ， 所 以 通 常 需 要 通 過 攪 動(dòng) 或 振 動(dòng) 培 養(yǎng) 液的 方 法 以 確 保 氧 氣 的 供 給 ， 采 用 往 復(fù) 式 搖 床 或 旋 轉(zhuǎn) 式 搖 床 進(jìn) 行培 養(yǎng) ， 其 速 度 一 般 為 50-100r min， 這 種 定 期 浸 沒 的 方 法 ， 既能 使 培 養(yǎng) 基 均 一 ， 又 能 保 證 氧 氣 的 供 給 。 簡 單 ， 一 般 只 要 有 培 養(yǎng) 室 及 接 種 箱 即 可 。優(yōu) 點(diǎn) ： 固 體 培 養(yǎng)定 義 ：指 在 培 養(yǎng) 液 中 加 入 一 定 的 凝 固 劑 ， 使 培 養(yǎng) 液 固 化 ，然 后 將 外 植 體 直 接 介 入 此 培 養(yǎng) 液 中 的 培 養(yǎng)適 用 范 圍 ：一 般 用 于 組 織 塊 、 愈 傷 組 織 、 短 枝 或 莖 尖 等 材 料的 培 養(yǎng) 外 植 體 只 有 底 部 表 面 能 接 觸 培 養(yǎng) 基 ， 造 成 細(xì) 胞 各部 分 營 養(yǎng) 濃 度 差 異 。 外 植 體 插 入 培 養(yǎng) 基 后 ， 氣 體 交 換 不 暢 及 排 泄 物 質(zhì)積 累 ， 影 響 組 織 吸 收 養(yǎng) 分 和