生物技術概論：第六講2植物體細胞雜交技術

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1、植 物 體 細 胞 雜 交 技 術 周口師范學院生命科學系 植 物 體 細 胞 雜 交 的 意 義v 有 性 雜 交 是 植 物 遺 傳 改 良 的 一 種 傳 統(tǒng) 手 段 。 作 用 空 間 ： 主 要 限 于 種 內(nèi) 的 品 種 之 間 。 種 及 種 以 上 分 類 單 位 之 間 的 雜 交 ， 例 如種 間 或 屬 間 雜 交 ， 則 常 常 遭 遇 有 性 不 親 和 性障 礙 。 在 無 性 繁 殖 植 物 和 性 不 育 植 物 中 ， 如 在馬 鈴 薯 、 甘 薯 、 木 薯 、 甘 蔗 和 香 蕉 中 ， 更 是難 以 通 過 有 性 雜 交 進 行 遺 傳 改 良 。 因

2、 此 ， 建 立 在 原 生 質(zhì) 體 全 能 性 基 礎 上 的體 細 胞 雜 交 和 胞 質(zhì) 雜 交 技 術 ， 對 于 植 物 的 遺傳 改 良 具 有 重 要 的 意 義 。 體 細 胞 雜 交 （ somatic hybridization): 在 離 體 條 件 下 通 過 兩 個 親 本 體 細 胞 原 生 質(zhì)體 的 融 合 以 及 隨 后 將 融 合 產(chǎn) 物 培 養(yǎng) 成 雜 種 植株 的 過 程 。 1972年 ， Carlson首 次 獲 得 粉 藍 煙 草 和 郎氏 煙 草 的 細 胞 雜 種 ， 這 也 是 第 一 個 植 物 體 細胞 雜 種 。 1978年 梅 爾 徹

3、斯 (Melchers)等 首 次 獲 得了 番 茄 和 馬 鈴 薯 的 屬 間 體 細 胞 雜 種 “ Potamato” 。 去掉細胞壁 原生質(zhì)體融合 白 菜 甘 藍 體 細 胞 雜 交 步 驟 ：1 原 生 質(zhì) 體 的 制 備2 原 生 質(zhì) 體 的 融 合3 雜 種 細 胞 選 擇4 雜 種 細 胞 培 養(yǎng)5 由 愈 傷 組 織 再 生 植 株6 雜 種 植 株 的 鑒 定 雜 交 的 兩 個 細 胞用 纖 維 素 酶 、 果 膠 酶 處理 細 胞 壁原 生 質(zhì) 體 、 經(jīng) 離 心 、 振動 、 電 刺 激 用 聚 二 乙 醇（ ）誘 導融 合 后 的 原 生 質(zhì) 體再 生 細 胞 壁雜

4、 種 細 胞 脫 分 化細 胞 分 裂愈 傷 組 織雜 種 植 株 再 分 化 （ 植 物 體 細 胞融 合 完 成 的 標志 ）植物細胞融合 植 物組 織培 養(yǎng) 2 原 生 質(zhì) 體 融 合2.1自 發(fā) 融 合2.2 誘 發(fā) 融 合2.2.1 NaNO3處 理2.2.2 高 PH-高 濃 度 鈣 離 子 處 理2.2.3 PEG（ 聚 乙 二 醇 ） 處 理2.2.4 電 融 合 2 原 生 質(zhì) 體 融 合2.1自 發(fā) 融 合 在 酶 解 細 胞 壁 的 過 程 中 ， 有 些 相 鄰 的 原 生質(zhì) 體 能 彼 此 融 合 形 成 同 核 體 (homokaryon)，每 個 同 核 體 包

5、含 2 40個 核 。 形 成 的 原 因 ： 由 不 同 細 胞 間 胞 間 連 絲 的擴 展 和 粘 連 造 成 的 。 減 少 自 發(fā) 融 合 的 措 施 ： 在 用 酶 液 處 理 之前 ， 使 細 胞 受 到 強 烈 的 質(zhì) 壁 分 離 藥 物 的 作 用 ，切 斷 胞 間 連 絲 。 2 原 生 質(zhì) 體 融 合 2.2 誘 發(fā) 融 合 2.2.1 NaNO3處 理 1909年 ， Kuster在 一 個 發(fā) 生 了 質(zhì) 壁 分 離 的表 皮 細 胞 中 ， 低 滲 NaNO3溶 液 可 以 引 起 2個 亞原 生 質(zhì) 體 的 融 合 。 缺 點 ： 異 核 體 (heterokar

6、yon)形 成 頻 率 不高 。 2 原 生 質(zhì) 體 融 合 2.2.2 高 PH-高 濃 度 鈣 離 子 處 理 1973年 ， Keller和 Melchers， 用 強 堿 性(PH10.5)的 高 濃 度 鈣 離 子 （ 50mmol.L-1)溶 液在 37 下 處 理 約 30min， 兩 個 品 系 的 煙 草 葉肉 原 生 質(zhì) 體 很 容 易 融 合 。 但 對 于 有 些 原 生 質(zhì) 體 系 統(tǒng) ， 這 樣 高 的 PH值 是 有 毒 的 。 2 原 生 質(zhì) 體 融 合 2.2.3 PEG(聚 乙 二 醇 )處 理 PEG的 作 用 機 理 ： Kao等 認 為 ， 由 于PE

7、G分 子 具 有 輕 微 的 負 極 性 ， 故 可 以 與 具 有正 極 性 基 團 的 水 、 蛋 白 質(zhì) 和 碳 水 化 合 物 等 形成 H鍵 ， 從 而 在 原 生 質(zhì) 體 之 間 形 成 分 子 橋 ， 其結(jié) 果 是 使 原 生 質(zhì) 體 發(fā) 生 粘 連 進 而 促 使 原 生 質(zhì)體 的 融 合 。 另 外 ， PEG能 增 加 類 脂 膜 的 流 動 性 ， 也 使原 生 質(zhì) 體 的 核 、 細 胞 器 發(fā) 生 融 合 成 為 可 能 。 2 原 生 質(zhì) 體 融 合 2.2.3 PEG(聚 乙 二 醇 )處 理 PEG作 為 融 合 劑 的 優(yōu) 點 : 異 核 體 形 成 的 頻

8、率 高 ， 可 重 復 性 強 ， 對大 多 數(shù) 細 胞 低 毒 ； 形 成 雙 核 異 核 體 的 頻 率 高 。 2 原 生 質(zhì) 體 融 合 2.2.3 PEG(聚 乙 二 醇 )處 理 據(jù) Burgess和 Flenming（ 1974年 ） 報 道 ： 在 37 下 用 高 鈣 離 子 的 強 堿 性 溶 液 處 理 時 ，產(chǎn) 生 的 聚 集 體 很 大 ， 每 個 包 含 很 大 原 生 質(zhì) 體 。 以 PEG為 融 合 劑 時 ， 多 數(shù) 聚 集 體 包 含 2 3個 原 生 質(zhì) 體 。 2 原 生 質(zhì) 體 融 合 2.2.3 PEG (聚 乙 二 醇 )處 理融 合 基 本 過

9、程 2 原 生 質(zhì) 體 融 合 2.2.3 PEG(聚 乙 二 醇 )處 理 注 意 事 項 ： PEG的 分 子 量 （ MW 1500 6000） 酶 溶 液 濃 度 原 生 質(zhì) 體 來 源 PEG的 稀 釋 逐 步 進 行 在 PEG溶 液 中 ， 加 入 鈣 離 子 可 以 提 高 融 合效 率 ） 2 原 生 質(zhì) 體 融 合 2.2.3 PEG(聚 乙 二 醇 )處 理 高 溫 （ 35 37 ） 4% 5%（ V/V） 的 原 生 質(zhì) 體 懸 浮 液 所 用 酶 種 類 和 濃 度 ， 一 般 用 崩 潰 酶 。 材 料 預 培 養(yǎng) 融 合 地 點 （ 在 離 心 管 中 ， 在

10、小 液 滴 中 ） 在 PEG溶 液 中 的 保 溫 時 間 太 長 會 降 低 異 核體 形 成 頻 率 。 2 原 生 質(zhì) 體 融 合 2.2.4 電 融 合 將 一 定 密 度 的 原 生 質(zhì) 體 懸 浮 液 置 于 一 個 融合 小 室 中 ， 小 室 兩 端 有 電 極 ， 在 不 均 勻 的 交變 電 場 的 作 用 下 ， 原 生 質(zhì) 體 彼 此 靠 近 ， 在 兩個 電 極 間 排 列 成 串 珠 狀 。 這 時 ， 如 果 有 足 夠強 度 的 電 脈 沖 ， 就 可 以 使 質(zhì) 膜 發(fā) 生 可 逆 性 電擊 穿 ， 從 而 導 致 融 合 。 兩 個 電 極 間 串 珠 狀

11、 原 生 質(zhì) 體 細 胞 電 融 合 儀 2.3 融 合 產(chǎn) 物 的 細 胞 學 在 膜 融 合 以 后 的 數(shù) 小 時 內(nèi) ， 2個 細 胞 的 細 胞質(zhì) 混 在 一 起 ， 形 成 一 個 雙 核 異 核 體 。 在 雙 親 親 緣 關 系 較 近 的 異 核 體 中 ， 兩 個 核有 可 能 同 步 進 行 第 一 次 有 絲 分 裂 ， 而 且 在 這個 過 程 中 ， 二 者 的 染 色 體 被 一 個 共 同 的 紡 錘體 所 牽 引 ， 在 有 絲 分 裂 末 期 形 成 兩 個 雜 種 子細 胞 。 最 終 分 化 出 體 細 胞 雜 種 ， 其 核 內(nèi) 具 有雙 親 的 染

12、色 體 組 。 2.3 融 合 產(chǎn) 物 的 細 胞 學 在 雙 親 親 緣 關 系 比 較 遠 的 雜 種 細 胞 中 ， 兩個 來 源 不 同 的 染 色 體 組 常 常 不 能 完 全 結(jié) 合 在一 起 。 在 動 物 體 細 胞 雜 種 細 胞 系 中 ， 已 知 雙 親 之一 的 染 色 體 會 逐 漸 消 除 ， 在 植 物 中 也 看 到 這種 現(xiàn) 象 。 3 雜 種 細 胞 的 選 擇 系 統(tǒng)3.1 根 據(jù) 物 理 特 性 選 擇3.2 突 變 互 補 選 擇3.3 根 據(jù) 生 長 和 再 生 能 力 的 差 別 選 擇 3.1 根 據(jù) 物 理 特 性 選 擇3.1.1 根 據(jù)

13、可 見 標 志 選 擇 主 要 用 于 非 綠 色 原 生 質(zhì) 體 與 含 有 葉 綠 體 的原 生 質(zhì) 體 的 融 合 。 （ 半 綠 半 白 ）3.1.2 根 據(jù) 熒 光 標 記 選 擇 將 2種 原 生 質(zhì) 體 群 體 分 別 用 不 同 的 熒 光 染 料標 記 ， 然 后 通 過 熒 光 顯 微 鏡 鑒 別 異 核 體 。3.1.3 低 密 度 植 板 選 擇 對 細 胞 進 行 追 蹤 選 擇 。 3.2 突 變 互 補 選 擇3.2.1 隱 性 突 變 互 補 選 擇3.2.2 顯 性 抗 性 互 補 選 擇3.2.3 隱 性 突 變 與 野 生 型 互 補 選 擇3.2.4 顯

14、 -隱 性 雙 突 變 體 選 擇 3.3 根 據(jù) 生 長 和 再 生 能 力 的 差 別 選 擇3.3.1 根 據(jù) 愈 傷 組 織 生 長 差 別 選 擇3.3.2 植 株 再 生 能 力 的 差 別 選 擇3.3.3 根 據(jù) 生 長 和 分 化 對 培 養(yǎng) 基 要 求 的 差 別 選 擇 3.3 根 據(jù) 生 長 和 再 生 能 力 的 差 別 選 擇3.3.1 根 據(jù) 愈 傷 組 織 生 長 差 別 選 擇 在 曼 陀 羅 和 煙 草 種 間 體 細 胞 雜 交 以 及 在小 麥 和 某 些 其 他 禾 谷 類 植 物 屬 間 體 細 胞 雜 交中 ， 發(fā) 現(xiàn) 雜 種 愈 傷 組 織 表

15、現(xiàn) 生 長 優(yōu) 勢 現(xiàn) 象 ，因 此 融 合 處 理 后 只 要 挑 選 生 長 快 、 長 的 最 大的 愈 傷 組 織 ， 就 會 從 中 分 化 出 體 細 胞 雜 種 。 3.3 根 據(jù) 生 長 和 再 生 能 力 的 差 別 選 擇3.3.2 植 株 再 生 能 力 的 差 別 選 擇 不 同 來 源 的 原 生 質(zhì) 體 分 化 再 生 植 株 的 能 力不 同 。 在 體 細 胞 雜 交 中 ， 只 要 有 一 個 親 本 的 原 生質(zhì) 體 能 夠 再 生 植 株 ， 融 合 產(chǎn) 生 的 雜 種 細 胞 就能 再 生 植 株 。 3.3 根 據(jù) 生 長 和 再 生 能 力 的 差

16、別 選 擇3.3.3 根 據(jù) 生 長 和 分 化 對 培 養(yǎng) 基 要 求 的 差 別 選 擇 不 同 來 源 的 原 生 質(zhì) 體 對 培 養(yǎng) 基 成 分 和 激 素的 要 求 不 同 。 設 計 的 培 養(yǎng) 基 只 有 雜 種 細 胞 能 夠 生 長 。 4 胞 質(zhì) 雜 交 和 胞 質(zhì) 雜 種 有 性 雜 交 ， 細 胞 質(zhì) 基 因 組 來 源 于 母 本 。 體 細胞 雜 交 ， 雜 種 有 兩 個 親 本 的 細 胞 質(zhì) 基 因 組 。胞 質(zhì) 雜 種 (cybrid): 兩 種 來 源 不 同 的 核 外 遺 傳 成 分 （ 細 胞 器 ）與 一 個 特 定 的 核 基 因 組 結(jié) 合 在

17、 一 起 。核 質(zhì) 雜 種 (nucleo-cytoplasmic hybrid): 一 個 親 本 的 細 胞 核 與 另 一 個 親 本 的 細 胞質(zhì) 基 因 組 結(jié) 合 。 4 胞 質(zhì) 雜 交 和 胞 質(zhì) 雜 種獲 得 胞 質(zhì) 雜 種 的 方 法 ： 常 先 把 異 種 胞 質(zhì) 供 體 物 種 原 生 質(zhì) 體 的 核 滅活 ， 然 后 再 將 它 與 異 種 胞 質(zhì) 受 體 物 種 的 原 生質(zhì) 體 融 合 。 通 過 射 線 輻 照 滅 活 胞 質(zhì) 供 體 細 胞 核 胞 質(zhì) 體 和 原 生 質(zhì) 體 的 融 合 4 胞 質(zhì) 雜 交 和 胞 質(zhì) 雜 種 通 過 射 線 輻 照 滅 活 胞

18、 質(zhì) 供 體 細 胞 核 阻 止 沒 融 合 的 胞 質(zhì) 供 體 細 胞 的 分 裂 ， 細 胞核 部 分 或 完 全 失 活 。 阻 止 沒 融 合 的 受 體 細 胞 的 分 裂 胞 質(zhì) 體 和 原 生 質(zhì) 體 的 融 合 利 用 細 胞 質(zhì) 供 體 細 胞 的 去 核 原 生 質(zhì) 體 與 受 體親 本 的 完 整 原 生 質(zhì) 體 融 合 。 5 體 細 胞 雜 種 和 胞 質(zhì) 雜 種 的 鑒 定5.1 形 態(tài) 和 育 性 鑒 定5.2 細 胞 學 和 分 子 細 胞 學 鑒 定5.3 生 化 鑒 定5.4 分 子 生 物 學 鑒 定 5 體 細 胞 雜 種 和 胞 質(zhì) 雜 種 的 鑒 定

19、5.1 形 態(tài) 和 育 性 鑒 定 株 型 、 葉 形 、 花 形 ， 莖 、 葉 茸 毛 的 有 無 或 多 或 少 有 雙 親 的 特 點 育 性 取 決 于 雙 親 親 緣 關 系 的 遠 近 ， 雜 種 或是 育 性 很 低 ， 或 是 完 全 不 育 。 5 體 細 胞 雜 種 和 胞 質(zhì) 雜 種 的 鑒 定 5.2 細 胞 學 和 分 子 細 胞 學 鑒 定 通 過 確 定 雜 種 染 色 體 數(shù) 和 染 色 體 形 態(tài) 5 體 細 胞 雜 種 和 胞 質(zhì) 雜 種 的 鑒 定 5.3 生 化 鑒 定 同 工 酶 譜 分 析 法 ： 將 體 細 胞 雜 種 的 同 工 酶 譜 與 其

20、 雙 親 的 酶 譜比 較 ： 雜 種 植 株 的 酶 譜 可 能 是 雙 親 酶 譜 帶 的 總 和 可 能 只 出 現(xiàn) 雙 親 的 部 分 酶 帶 或 缺 少 雙 親 的 某 些 酶 譜 而 出 現(xiàn) 新 的 譜 帶 。 5 體 細 胞 雜 種 和 胞 質(zhì) 雜 種 的 鑒 定 5.4 分 子 生 物 學 鑒 定 RAPD (Random amplified polymorphic DNA， 隨 機 擴 增 多 態(tài) 性 DNA) AFLP ( Amplified fragment length polymorphism， 擴 增 片 段 長 度 多 態(tài) 性 ) SRAP(sequence-re

21、lated amplified polymorphism,序 列 相 關 擴 增 多 態(tài) 性 ) SSR （ Simple sequence repeat， 簡 單 序 列 重 復 ） 6 體 細 胞 雜 種 在 農(nóng) 業(yè) 生 產(chǎn) 上 的 應 用6.1 對 無 性 繁 殖 植 物 或 性 不 育 植 物 進 行 遺 傳 重 組 對 2個 不 能 進 行 有 性 繁 殖 的 物 種 之 間 實 現(xiàn) 遺傳 重 組 ， 體 細 胞 融 合 目 前 看 來 是 唯 一 途 徑 。 性 不 育 植 物 （ 單 倍 體 、 三 倍 體 和 非 整 倍體 ） ， 融 合 后 產(chǎn) 生 可 育 的 二 倍 體 或

22、 多 倍 體 。 6 體 細 胞 雜 種 在 農(nóng) 業(yè) 生 產(chǎn) 上 的 應 用 6.2 克 服 有 性 不 親 和 性 障 礙 由 于 存 在 不 親 和 障 礙 ， 種 間 或 屬 間 有 性 雜交 雖 能 進 行 ， 但 難 以 產(chǎn) 生 雜 種 ， 而 通 過 體 細 胞融 合 ， 有 可 能 突 破 有 性 雜 交 的 這 種 局 限 性 。 6 體 細 胞 雜 種 在 農(nóng) 業(yè) 生 產(chǎn) 上 的 應 用6.3 細 胞 質(zhì) 遺 傳 性 狀 的 轉(zhuǎn) 移 細 胞 質(zhì) 雄 性 不 育 （ cms） 性 狀 的 轉(zhuǎn) 移 轉(zhuǎn) 移 由 細 胞 質(zhì) 基 因 控 制 的 重 要 農(nóng) 藝 性 狀 ，如 光 和 速 率 、 對 高 溫 和 低 溫 的 耐 性 ， 以 及 抗 病性 和 抗 除 草 劑 特 性 等 。