人教版高中生物選修一專題5課題3《血紅蛋白的提取和分離》 課件 (共53張PPT)

血 紅 蛋 白 2003年 4月 14日 宣 布 人 類 基 因 組 序 列 圖 完 成這 標(biāo) 志 著 進(jìn) 入 了 后 基 因 組 時(shí) 代 。人 類 基 因 組 ： 指 DNA分 子 所 攜 帶 的 全 部遺 傳 信 息 。蛋 白 質(zhì) 組 ： 生 物 個(gè) 體 表 達(dá) 的 蛋 白 質(zhì) 分 子 的總 和 。 主 要 是 對(duì) 蛋 白 質(zhì) 功 能 的 研 究 思 考 1 分 離 生 物 大 分 子 的 基 本 思 路 是 什 么 ？選 用 一 定 的 物 理 或 化 學(xué) 的 方 法 分 離 具 有不 同 物 理 或 化 學(xué) 性 質(zhì) 的 生 物 大 分 子 。思 考 2 蛋 白 質(zhì) 的 分 離 和 提 取 的 原 理 是 什 么 ？根 據(jù) 蛋 白 質(zhì) 各 種 特 性 的 差 異 ， 如 分 子 的形 狀 和 大 小 、 所 帶 電 荷 的 性 質(zhì) 和 多 少 、溶 解 度 和 吸 附 的 性 質(zhì) 和 對(duì) 其 他 分 子 的 親和 力 等 等 ， 可 以 用 來 分 離 不 同 蛋 白 質(zhì) 。 思 考 3 高 溫 滅 菌 和 酒 精 滅 菌 分 別 利 用 蛋 白 質(zhì)的 何 種 作 用 ， 作 用 結(jié) 果 是 什 么 被 破 壞 ？變 性 、 變 性 、 空 間 結(jié) 構(gòu)思 考 4 人 們 用 雞 的 紅 細(xì) 胞 提 取 DNA， 用 人(豬 、 牛 、 羊 ） 的 紅 細(xì) 胞 提 取 血 紅 蛋 白 的 原因 是 什 么 ？雞 的 紅 細(xì) 胞 具 有 細(xì) 胞 核 ， 含 有 DNA，便 于 進(jìn) 行 DNA的 提 取 ， 人 的 紅 細(xì) 胞 無細(xì) 胞 核 ， 結(jié) 構(gòu) 簡(jiǎn) 單 ， 血 紅 蛋 白 含 量 豐富 便 于 提 取 血 紅 蛋 白 。 體驗(yàn)從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過程和方法，并了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理。 凝 膠 色 譜 法 電 泳 法 緩 沖 溶 液 它 們 在 血 紅 蛋 白 的 提 取 中 分 別 起 到 什 么 作 用 。 凝 膠 色 譜 法 分 離 蛋 白 質(zhì) 的 原 理 電 泳 法 分 離 樣 品 的 原 理 緩 沖 溶 液 的 組 成 和 作 用 機(jī) 理凝 膠 色 譜 法 的 原 理 和 方 法 樣 品 的 處 理 色 譜 柱 填 料 的 處 理 和 色 譜 柱 的 裝 填 。 一 、 基 礎(chǔ) 知 識(shí) ：（ 一 ） 凝 膠 色 譜 法 （ 分 配 色 譜 法 ） ： 1、 凝 膠 ：一 些 微 小 多 孔 的 球 體 （ 內(nèi) 含 許 多 貫 穿 的通 道 ， 由 多 糖 類 構(gòu) 成 如 葡 聚 糖 、 瓊 脂 糖 ，具 多 孔 的 凝 膠 就 叫 分 子 篩 ） 2、 概 念 ： 根 據(jù) 被 分 離 物 質(zhì) 的 蛋 白 質(zhì) 相 對(duì)分 子 質(zhì) 量 的 大 小 ， 利 用 具 有 網(wǎng) 狀 結(jié) 構(gòu) 的 凝膠 的 分 子 篩 作 用 ， 來 進(jìn) 行 分 離 。 3、 原 理 ： 當(dāng) 不 同 的 蛋 白 質(zhì) 通 過 凝 膠 時(shí) ，（ ） 的 蛋 白 質(zhì) 容 易 進(jìn) 入凝 膠 內(nèi) 部 的 通 道 ， 路 程 （ ） ， 移 動(dòng) 速度 （ ） ， 而 （ ）的 蛋 白 質(zhì) 無 法 進(jìn) 入 凝 膠 內(nèi) 部 的 通 道 ， 只 能在 （ ） 移 動(dòng) ， 路 程 （ ） ，移 動(dòng) 速 度 （ ） ， 相 對(duì) 分 子 質(zhì) 量 不 同的 蛋 白 質(zhì) 因 此 得 以 分 離 。4、 具 體 過 程相 對(duì) 分 子 質(zhì) 量 較 小 較 長(zhǎng)較 慢 相 對(duì) 分 子 質(zhì) 量 較 大凝 膠 外 部 較 短較 快 分 子 量 大 小直 徑 大 小 大 于 凝 膠 顆 粒 空隙 直 徑 ， 被 阻 擋在 顆 粒 的 外 面 小 于 凝 膠 顆 粒 空隙 直 徑 ， 可 以 進(jìn)入 顆 粒 內(nèi) 部運(yùn) 動(dòng) 方 式 垂 直 向 下 移 動(dòng) 垂 直 向 下 移 動(dòng) ，無 規(guī) 則 擴(kuò) 散 進(jìn) 入顆 粒 內(nèi) 部運(yùn) 動(dòng) 速 度 較 快 較 慢運(yùn) 動(dòng) 路 徑 較 短 較 長(zhǎng)洗 脫 次 序 先 從 凝 膠 柱 洗 脫出 來 后 從 凝 膠 柱 洗 脫出 來 1、 概 念 ： 在 一 定 的 范 圍 內(nèi) ， 能 對(duì) 抗 外來 少 量 強(qiáng) 酸 、 強(qiáng) 堿 或 稍 加 稀 釋 不 引 起 溶 液PH 發(fā) 生 明 顯 變 化 的 作 用 叫 做 緩 沖 作 用 ， 具有 緩 沖 作 用 的 溶 液 叫 做 緩 沖 溶 液 。(二 )緩 沖 溶 液 ： 2、 作 用 ： 能 夠 抵 制 （ ） 對(duì) 溶 液 的（ ） 的 影 響 ， 維 持 PH 基 本 不 變 。外 界 的 酸 或 堿PH 值 3、 緩 沖 溶 液 的 配 制 通 常 由 （ ） 種 緩 沖 劑 溶 解 于 水中 配 制 而 成 。 調(diào) 節(jié) 緩 沖 劑 的 （ ）就 可 以 制 得 （ ） 使 用 的緩 沖 液 。 1 2 使 用 比 例在 不 同 PH 范 圍 內(nèi) 思 考 ： 說 出 人 體 血 液 中 緩 沖 對(duì) 。 NaH 2PO4 / Na2H PO4H 2CO3 / NaH CO3 （ 三 ） 電 泳 ：1、 概 念 ： 指 帶 電 粒 子 在 電 場(chǎng) 作 用 下 發(fā) 生 遷 移 的 過 程 。思 考 ： 在 血 紅 蛋 白 的 提 取 和 分 離 實(shí) 驗(yàn) 中 用的 緩 沖 液 是 什 么 ？ 它 的 目 的 是 什 么 ？使 用 的 是 磷 酸 緩 沖 液 ， 目 的 是 利 用 緩 沖液 模 擬 細(xì) 胞 內(nèi) 的 PH 環(huán) 境 ， 保 證 血 紅 蛋 白的 正 常 結(jié) 構(gòu) 和 功 能 ， 便 于 觀 察 （ 紅 色 ）和 材 料 的 科 學(xué) 研 究 （ 活 性 ） 2、 原 理 ： 許 多 重 要 的 生 物 大 分 子 ， 如（ ） 等 都 具 有 ( ) 在 ( )下 ， 這 些 基 團(tuán) 會(huì) 帶 上（ ） 。 在 電 場(chǎng) 的 作 用 下 ， 這 些 帶電 分 子 會(huì) 向 著 與 其 （ ） 移 動(dòng) 。 電 泳 利 用 了 待 分 離 樣 品 中 各 種 分 子（ ） 以 及 分 子 本 身（ ） 、 （ ） 的 不 同 使 帶 電 分 子產(chǎn) 生 不 同 的 （ ） ， 從 而 實(shí) 現(xiàn) 樣 品中 各 種 分 子 的 分 離 。多 肽 、 核 酸 可 解 離 的 基 團(tuán)正 電 或 負(fù) 電 所 帶 電 荷 相 反 的 電 極帶 電 性 質(zhì) 的 差 異大 小 形 狀遷 移 速 度一 定 的 PH 聚 丙 稀 酰 胺 凝 膠 ： 是 由 單 體 丙 烯 酰 胺 和 交聯(lián) 劑 N,N-甲 叉 雙 丙 烯 酰 胺 在 引 發(fā) 劑 (過 硫酸 銨 和 催 化 劑 （ 四 甲 基 已 二 胺 ） 的 作 用 下聚 合 交 聯(lián) 成 三 維 網(wǎng) 狀 結(jié) 構(gòu) 的 凝 膠分 類 ：瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 和 聚 丙 稀 酰 胺 凝 膠 電 泳 。測(cè) 定 （ ） 通常 用 十 二 烷 基 硫 酸 鈉 （ SDS） 聚 丙 稀酰 胺 凝 膠 電 泳蛋 白 質(zhì) 相 對(duì) 分 子 質(zhì) 量 二 實(shí) 驗(yàn) 操 作蛋 白 質(zhì) 的 提 取 和 分 離 一 般 分 為 四 步 ：1.樣 品 處 理血液 血 漿 水 分固 體 物 質(zhì) 血 漿 蛋 白無 機(jī) 鹽磷 脂葡 萄 糖 等血 細(xì) 胞 白 細(xì) 胞血 小 板紅 細(xì) 胞（ 最 多 ） 血 紅蛋 白 （ ） 兩 個(gè) a 肽 鏈兩 個(gè) 一 肽 鏈 樣 品 處 理 粗 分 離 純 化 純 度 鑒 定共 四 條 肽 鏈 90 目 的 ： 去 除 （ ）方 法 ： （ ） 離 心 （ 速 度 越高 和 時(shí) 間 越 長(zhǎng) 會(huì) 使 白 細(xì) 胞 和 淋 巴 細(xì) 胞 等 一同 沉 淀 達(dá) 不 到 分 離 的 效 果 ） ， 然 后 用 膠 頭吸 管 吸 出 上 層 透 明 的 （ ） ， 將 下層 （ ） 的 紅 細(xì) 胞 液 體 倒 入 （ ）每 個(gè) 肽 鏈 環(huán) 繞 （ ） ， 此基 團(tuán) 可 攜 帶 （ ） 。血 紅 蛋 白 因 含 有 （ ） 而 呈 紅 色 。 本 課題 可 選 用 豬 、 牛 、 羊 或 其 他 脊 椎 動(dòng) 物 的 血 液 來分 離 血 紅 蛋 白 。 一 個(gè) 亞 鐵 血 紅 素 基 團(tuán)一 分 子 氧 或 一 分 子 二 氧 化 碳血 紅 素(1)紅 細(xì) 胞 的 洗 滌 雜 質(zhì) 蛋 白低 速 短 時(shí) 間 黃 色 血 漿暗 紅 色 燒 杯 再加入用 （ ） 的 （ ）即 質(zhì) 量 分 數(shù) 為 0.9 的 氯 化 鈉 溶 液 洗 滌 低 速 離 心 （ 低 速 短 時(shí) 間 ） 重 復(fù) 上 述 步 驟 （ ） 次 ， 直 至 上 清 液中 已 沒 有 （ ） ， 表 明 洗 滌 干 凈 。 利于 后 續(xù) 血 紅 蛋 白 的 分 離 純 化 ， 不 可 洗 滌次 數(shù) 過 少 。 五 倍 體 積 生 理 鹽 水三黃 色 （ 2） 血 紅 蛋 白 的 釋 放 加 （ ） 到 （ ） 體 積 ，再 加 40 體 積 的 （ ） （ 溶 解 細(xì) 胞膜 ） ， 置 于 （ ） 上 充 分 攪 拌10分 鐘 （ 加 速 細(xì) 胞 破 裂 ） , 細(xì) 胞 破 裂 釋 放 出血 紅 蛋 白 .(3)分 離 血 紅 蛋 白 溶 液 ： 將 攪 拌 好 混 合 液 轉(zhuǎn)移 到 離 心 管 內(nèi) ， 以 2000r/min的 速 度 離 心 10 min ， 試 管 中 的 溶 液 分 為 4層 :原 血 液甲 苯磁 力 攪 拌 器蒸 餾 水目 的 ： 使 紅 細(xì) 胞 破 裂 ， 血 紅 蛋 白 釋 放 第 1層 （ 最 上 層 ） ： （ ） 甲 苯 層第 2層 （ 中 上 層 ） ： （ ） 的 沉 淀 層 ， （ ） 色 薄 層 固 體第 3層 （ 中 下 層 ） ： （ ） 的 水 溶 液 層 （ ） 的 液 體 第 4層 （ 最 下 層 ） ： 其 它 雜 質(zhì) （ ） 的 沉 淀 層無 色 透 明脂 溶 性 物 質(zhì)白血 紅 蛋 白紅 色 透 明 暗 紅 色 用 濾 紙 過 濾 ，除 去 脂 溶 性 沉淀 層 ， 于 分 液漏 斗 中 靜 置 片刻 后 ， 分 出 下層 的 紅 色 透 明液 體 。 原 理 ： 課 本 圖 解 ， 思 考 ？取 ( )ml的 血 紅 蛋 白 溶 液 裝 入 （ ）中 ， 將 透 析 袋 放 入 盛 有 300ml的 物 質(zhì) 的 量濃 度 為 20mmol/L的 （ ） 中 ，pH 為 （ ） ， 透 析 12小 時(shí) ， 目 的 是（ ） 或 用于 更 換 樣 品 中 的 （ ） 。 透 析 袋 一般 用 硝 酸 纖 維 素 制 成 ， 又 稱 玻 璃 紙 。除 去 樣 品 中 分 子 量 較 小 的 雜 質(zhì)透 析 袋磷 酸 緩 沖 液7.0 緩 沖 液2 粗 提 取 透 析1目 的 ： a.除 去 樣 品 中 相 對(duì) 分 子 質(zhì) 量 較 小 的雜 質(zhì) b用 于 更 換 樣 品 的 緩 沖 液 3.純 化 凝 膠 色 譜 制 作1） 凝 膠 色 譜 柱 的 制 作 取 長(zhǎng) 40厘 米 ， 內(nèi) 徑 1.6厘 米 的 玻 璃管 ， 兩 端 需 用 砂 紙 磨 平 。 底 塞 的 制 作 ： 打 孔 挖 出 凹 穴 安 裝 移 液 管 頭 部 覆 蓋 尼 龍 網(wǎng) ， 再 用 100目 尼 龍 紗 包 好 。 a、 選 擇 合 適 的 的 橡 皮 塞 ，中 間 打 孔 ； b、 在 橡 皮 塞 頂 部 切 出 鍋 底 狀 的（ ） ， 在 0.5ml的 （ ） 頭 部切 下 （ ） 長(zhǎng) 的 一 段 ， 插 入 橡 皮 塞 孔 內(nèi) ，上 部 不 得 超 過 橡 皮 塞 的 凹 穴 底 面 。凹 穴 移 液 管5cm 底 塞 中 插 入 的 玻 璃 管 的 上 部 不 得 超 出 橡 皮塞 的 凹 穴 底 面 ， 否 則 難 以 鋪 實(shí) 尼 龍 網(wǎng) ， 還會(huì) 導(dǎo) 致 液 體 殘 留 ， 蛋 白 質(zhì) 分 離 不 徹 底 。注 意c.剪 尼 龍 網(wǎng) 小 圓 片 覆 蓋 在 （ ）上 ， 用 （ ） 的 尼 龍 紗 將 橡 皮 塞（ ） 包 好 ， 插 到 玻 璃 管 一 端 。d、 色 譜 柱 下 端 用 移 液 頭 部 做 （ ） ，連 接 一 細(xì) 的 （ ） ， 并 用 螺 旋 夾 控制 尼 龍 管 的 （ ） ， 另 一 端 放入 收 集 （ ） 的 收 集 器 內(nèi)橡 皮 塞 的 凹 面100目上 部 出 口 部 位尼 龍 管打 開 與 關(guān) 閉色 譜 流 出 液 安 裝 其 他 附 屬 結(jié) 構(gòu) 。頂 塞 的 制 作 ：插 入 安 裝 了 玻 璃 管 的 橡 皮 塞組 裝 ： 將 上 述 三 者 按 相 應(yīng) 位 置 組 裝 成 一個(gè) 整 體。 2） 凝 膠 色 譜 柱 填 料 的 處 理（ 1） 凝 膠 的 選 擇 ：（ ） （ G-75） “ G”表 示 凝 膠 的 交 聯(lián) 程 度 ， 膨 脹 程 度 及 分 離 范 圍 。 75表 示 凝 膠 的 得 水 值 ， 即 每 克 凝 膠 膨 脹 時(shí) 吸 水 7.5克 。（ 2） 方 法 ： 配 置 凝 膠 懸 浮 液 ： 計(jì) 算 并 稱 取 一 定 量的 凝 膠 浸 泡 于 （ ） 中 充 分 溶 脹 后 ，配 成 （ ） 。蒸 餾 水凝 膠 懸 浮 液交 聯(lián) 葡 聚 糖 凝 膠 固 定 ： 將 色 譜 柱 處 置 固 定 在 支 架 上裝 填 ： 將 （ ） 一 次 性 的 緩 慢倒 入 （ ） 內(nèi) ， 裝 填 時(shí) 輕 輕 敲 動(dòng) 色譜 柱 ， 使 凝 膠 填 裝 均 勻 。（ 3） 凝 膠 色 譜 柱 的 裝 填 方 法凝 膠 懸 浮 液色 譜 柱注 意 ： 凝 膠 裝 填 時(shí) 盡 量 緊 密 ， 以 降 低 凝 膠顆 粒 之 間 的 空 隙 。 裝 填 凝 膠 柱 時(shí) 不 能 有 氣泡 存 在 ： 因 為 氣 泡 會(huì) 攪 亂 洗 脫 液 中 蛋 白 質(zhì)的 洗 脫 次 序 ， 降 低 分 離 效 果 。 洗 滌 平 衡 裝 填 完 畢 后 ， 立 即 用 緩 沖 液 洗 脫 瓶 ， 在 ( )高 的 操 作 壓 下 ， 用 300ml的 20mmol/l的 磷 酸 緩 沖液 （ pH為 7.0） 充 分 （ ） 12小 時(shí) 。 洗 滌 平 衡注 意 液 面 不 要 低 于 凝 膠 表 面 ， 否 則 可 能 有氣 泡 混 入 ， 影 響 液 體 在 柱 內(nèi) 的 流 動(dòng) 與 最 終生 物 大 分 子 物 質(zhì) 的 分 離 效 果 。 不 能 發(fā) 生 洗脫 液 流 干 ， 露 出 凝 膠 顆 粒 的 現(xiàn) 象 ， 否 則 重新 填 裝 。 50cm 3） 樣 品 加 入 與 洗 脫加 樣 前 打 開 下 端 出 口 ， 使 柱 內(nèi) 凝膠 面 上 的 （ ） 緩慢 下 降 到 與 （ ）平 齊 ， 關(guān) 閉 出 口緩 沖 液凝 膠 面 加 透 析 樣 品 調(diào) 整 緩 沖 液 面 ： 與 凝 膠 面 平 齊 滴 加 透 析 樣 品 ： 用 （ ） 將 1ml（ ）的 樣 品 加 到 色 譜 柱 的 （ ） 樣 品 滲 入 凝 膠 床 ： （ ） 洗 脫 ： 打 開 下 端 ， 用 磷 酸 緩 沖 液 洗 脫 收 集 ： 待 （ ） 接 近 色 譜 柱 底端 時(shí) ， 用 試 管 收 集 流 出 液 ， 每 （ ）收 集 一 試 管 連 續(xù) 收 集注 意 正 確 的 加 樣 操 作 ： 不 要 觸 及 破 壞 凝 膠 面 貼 壁 加 樣 使 吸 管 管 口 沿 管 壁 環(huán) 繞 移 動(dòng)吸 管 透 析 液頂 端樣 品 完 全 進(jìn) 凝 膠 層5ml紅 色 的 蛋 白 質(zhì) 血 紅 蛋 白 是 有 色 蛋 白 ， 因 此 在 凝 膠 色 譜分 離 時(shí) 可 以 通 過 觀 察 顏 色 來 判 斷 什 么 時(shí)候 應(yīng) 該 收 集 洗 脫 液 。 這 使 血 紅 蛋 白 的 分離 過 程 非 常 直 觀 ， 大 大 簡(jiǎn) 化 了 實(shí) 驗(yàn) 操 作 。 思 考 血 紅 蛋 白 提 取 和 分 離 的 程 序 可 分 為 四 大 步 ，包 括 ： 樣 品 處 理 、 粗 分 離 、 純 化 和 純 度 鑒 定 。首 先 通 過 洗 滌 紅 細(xì) 胞 、 血 紅 蛋 白 的 釋 放 、 離心 等 操 作 收 集 到 血 紅 蛋 白 溶 液 ， 即 樣 品 的 處理 ； 再 經(jīng) 過 透 析 去 除 分 子 量 較 小 的 雜 質(zhì) ， 即（ ） ； 然 后 通 過 凝 膠 色 譜 法將 相 對(duì) 分 子 質(zhì) 量 較 大 雜 質(zhì) 蛋 白 除 去 ， 即 樣 品的 （ ） ； 最 后 經(jīng) 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳進(jìn) 行 （ ） 。思 考樣 品 的 粗 分 離純 化純 度 鑒 定 4.純 度 鑒 定 SDS 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳判 斷 （ ） 的 蛋 白 質(zhì) 是 否 達(dá) 到 要 求 ，需 要 進(jìn) 行 蛋 白 質(zhì) 的 鑒 定 。純 化 3.SDS聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 鑒 定 血 紅蛋 白 純 度 (選 做 )血紅蛋白的取和分離 凝 膠 色 譜 法 原 理 分 離 過 程凝 膠 電 泳 法緩 沖 溶 液 組 成 作 用蛋 白 質(zhì) 的提 取 分 離 樣 品 處 理 粗 分 離 純 化純 度 鑒 定血紅蛋白的提取和離 蛋 白 質(zhì) 分 子 的 差 異 性蛋 白 質(zhì) 分 子 的 差 異 性凝 膠 色 譜 法 原 理 分 離 過 程凝 膠 電 泳 法凝 膠 色 譜 法 原 理 分 離 過 程凝 膠 電 泳 法緩 沖 溶 液 組 成 作 用緩 沖 溶 液 組 成 作 用蛋 白 質(zhì) 的提 取 分 離 樣 品 處 理 粗 分 離純 化純 度 鑒 定蛋 白 質(zhì) 的提 取 分 離 樣 品 處 理 粗 分 離純 化純 度 鑒 定 3.SDS聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 鑒 定 血 紅蛋 白 純 度 (選 做 )（ 1） 試 劑 的 配 制丙 烯 酰 胺 和 N, N-甲 叉 雙 丙 烯 酰 胺 用 去 離子 水 配 制 29%（ 29 g/100 mL， 下 同 ） 的 丙 烯 酰胺 和 1%的 N, N-甲 叉 雙 丙 烯 酰 胺 的 貯 存 液十 二 烷 基 硫 酸 鈉 （ SDS） 用 去 離 子 水 配 成10%的 貯 存 液 ， 于 室 溫 保 存 。 用 于 制 備 分 離 膠 和 濃 縮 膠 的 Tris緩 沖 液 TEMED ： 作 用 通 過 催 化 過 硫 酸 銨 形 成 自 由基 而 加 速 丙 烯 酰 胺 與 雙 丙 烯 酰 胺 的 聚 合 。 用 去 離 子 水 配 制 10% 過 硫 酸 銨 ： 作 用 提 供 驅(qū)動(dòng) 丙 烯 酰 胺 和 雙 丙 烯 酰 胺 聚 合 所 必 需 的 自 由基 。 此 溶 液 須 配 制 新 鮮 液 。Tris甘 氨 酸 電 泳 緩 沖 液 25 mmol/L Tris，250 mmol/L 甘 氨 酸 (pH 8.3)， 0.1%的 SDS。 樣 品 處 理 液 50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)， 100 mmol/L DTT(巰 基 蘇 糖 醇 )或 用 5%的 巰 基 乙 醇 ， 2%的 SDS， 0.1%的 溴 酚 藍(lán) ， 10%的 甘 油 。 染 色 液 0.1%的 考 馬 斯 亮 藍(lán) R250， 40%的 甲醇 ， 10%的 冰 醋 酸 脫 色 液 10%的 甲 醇 和 10%的 冰 醋 酸 。 由 于 制 備 凝 膠 的 丙 烯 酰 胺 和 雙 丙 烯 酰 胺 具 有很 強(qiáng) 的 神 經(jīng) 毒 性 ， 并 且 容 易 被 皮 膚 吸 收 ， 因此 操 作 必 須 在 通 風(fēng) 櫥 內(nèi) 或 通 風(fēng) 處 進(jìn) 行 。TEMED和 過 硫 酸 胺 對(duì) 黏 膜 和 上 呼 吸 道 組 織 、眼 睛 、 皮 膚 等 有 很 大 的 破 壞 作 用 ， 吞 服 可 致命 。 因 此 在 進(jìn) 行 電 泳 操 作 時(shí) 一 定 按 照 實(shí) 驗(yàn) 要求 和 步 驟 完 成 。 操 作 時(shí) 要 戴 好 一 次 性 手 套 。 SDS-聚 丙 烯 酰 胺 分 離 膠 制 備1)根 據(jù) 廠 家 說 明 書 安 裝 電 泳 用 的 玻 璃 板2） SDS聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 制 備用 去 離 子 水 4.6 mL， 30%的 丙 烯 酰 胺 2.7 mL，1.5mol、 pH 8.8的 Tris緩 沖 液 2.5 mL， 10%的SDS 0.1 mL， 10%的 過 硫 酸 胺 0.1 mL， TEMED 0.006mL， 混 合 均 勻 ， 迅 速 灌 注 在 兩 玻 璃 板 的間 隙 中 間 ， 要 留 出 灌 注 濃 縮 膠 所 需 空 間 (梳 子的 齒 長(zhǎng) 再 加 0.5 cm)， 再 在 膠 液 面 上 小 心 注 入一 層 水 （ 約 高 23 mm） ， 以 阻 止 氧 氣 進(jìn) 入 凝膠 溶 液 。（ 2） 電 泳 方 法 步 驟 配 制 SDS聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 濃 縮 膠 溶 液 。用 去 離 子 水 2.7 mL， 30%的 丙 烯 酰 胺 0.67 mL，1.0 mol、 pH 6.8的 Tris緩 沖 液 0.5 mL， 10%的SDS0.041 mL， 10%的 過 硫 酸 胺 0.04 mL， TEMED 0.004 mL， 混 合 均 勻 ， 直 接 灌 注 在 聚 合 的 分 離 膠上 ， 并 立 即 在 濃 縮 膠 溶 液 中 插 入 干 凈 的 梳 子 。 整個(gè) 操 作 過 程 應(yīng) 注 意 避 免 氣 泡 的 產(chǎn) 生 。 然 后 再 補(bǔ) 加濃 縮 膠 溶 液 ， 使 其 充 滿 梳 子 之 間 的 空 隙 ， 將 凝 膠垂 直 放 置 于 室 溫 下 聚 合 。 分 離 膠 聚 合 完 全 后 （ 約 30 min） ， 傾 出 覆 蓋水 層 ， 再 用 濾 紙 吸 凈 殘 留 水 。3） 樣 品 處 理 5)加 樣在 電 泳 樣 品 中 按 1 1體 積 比 加 入 樣 品 處 理 液 ，在 100 溫 度 下 加 熱 3 min， 以 使 蛋 白 質(zhì) 變 性 。 按 順 序 加 樣 ， 加 樣 量 通 常 為 1025 L。 樣品 可 以 多 加 幾 個(gè) ， 例 如 ， 血 漿 樣 品 紅 細(xì) 胞 破 碎 后(即 進(jìn) 行 凝 膠 色 譜 分 離 之 前 )的 樣 品 和 凝 膠 色 譜 分離 之 后 的 樣 品4） 濃 縮 膠 聚 合 完 全 后 （ 30 min） ， 小 心 移 出 梳子 。 把 凝 膠 固 定 于 電 泳 裝 置 上 ， 上 下 槽 各 加 入Tris甘 氨 酸 電 泳 緩 沖 液 。 必 須 設(shè) 法 排 出 凝 膠 底部 兩 玻 璃 板 之 間 的 氣 泡 。 7） 剝 膠 從 電 泳 裝 置 上 卸 下 玻 璃 板 ， 用 刮 刀 撬 開 玻璃 板 。 將 緊 靠 最 左 邊 一 孔 （ 第 一 槽 ） 凝 膠 下部 切 去 一 角 ， 以 標(biāo) 注 凝 膠 的 方 位 。8） 染 色 將 電 泳 凝 膠 片 放 在 考 馬 斯 亮 藍(lán) 染 色 液 中 染色 1-2 h。6)電 泳 將 電 泳 裝 置 與 電 源 相 接 ， 凝 膠 上 所 加 電 壓 為 8 V/cm。 當(dāng) 染 料 前 沿 進(jìn) 入 分 離 膠 后 ， 把 電 壓 提 高到 15 V/cm， 繼 續(xù) 電 泳 直 至 溴 酚 藍(lán) 到 達(dá) 分 離 膠底 部 上 方 約 1 cm處 ， 關(guān) 閉 電 源 。 10)觀 察 結(jié) 果 ：9)脫 色 ：染 色 完 畢 ， 傾 出 染 色 液 ,換 脫 色 液 脫 色3-10 h， 其 間 需 多 次 更 換 脫 色 液 至 背 景清 楚 。 觀 察 你 處 理 的 血 液 樣 品 離 心 后 是 否 分 層（ 見 教 科 書 圖 5-18） ， 如 果 分 層 不 明 顯 ，可 能 是 洗 滌 次 數(shù) 少 、 未 能 除 去 血 漿 蛋 白的 原 因 。 此 外 ， 離 心 速 度 過 高 和 時(shí) 間 過長(zhǎng) ， 會(huì) 使 白 細(xì) 胞 和 淋 巴 細(xì) 胞 一 同 沉 淀 ，也 得 不 到 純 凈 的 紅 細(xì) 胞 ， 影 響 后 續(xù) 血 紅蛋 白 的 提 取 純 度 。三 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 分 析 與 評(píng) 價(jià) 由 于 凝 膠 是 一 種 半 透 明 的 介 質(zhì) ， 因 此 可以 在 凝 膠 柱 旁 放 一 支 與 凝 膠 柱 垂 直 的 日光 燈 ， 檢 查 凝 膠 是 否 裝 填 得 均 勻 。 此 外 ，還 可 以 加 入 大 分 子 的 有 色 物 質(zhì) ， 例 如 藍(lán)色 葡 聚 糖 2000或 紅 色 葡 聚 糖 ， 觀 察 色帶 移 動(dòng) 的 情 況 。 如 果 色 帶 均 勻 、 狹 窄 、平 整 ， 說 明 凝 膠 色 譜 柱 的 性 能 良 好 。 如果 色 譜 柱 出 現(xiàn) 紋 路 或 是 氣 泡 ， 輕 輕 敲 打柱 體 以 消 除 氣 泡 ， 消 除 不 了 時(shí) 要 重 新 裝柱 。 如 果 凝 膠 色 譜 柱 裝 填 得 很 成 功 、 分 離 操 作 也正 確 的 話 ， 能 清 楚 地 看 到 血 紅 蛋 白 的 紅 色 區(qū)帶 均 勻 、 狹 窄 、 平 整 ， 隨 著 洗 脫 液 緩 慢 流 出 ；如 果 紅 色 區(qū) 帶 歪 曲 、 散 亂 、 變 寬 ， 說 明 分 離的 效 果 不 好 ， 這 與 凝 膠 色 譜 柱 的 裝 填 有 關(guān) 。 討 論 ： 如 何 測(cè) 定 蛋 白 質(zhì) 的 分 子 量 ？使 用 SDS聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 測(cè) 定 蛋 白質(zhì) 的 分 子 量 時(shí) ， 可 選 用 一 組 已 知 分 子 量 的標(biāo) 準(zhǔn) 蛋 白 同 時(shí) 進(jìn) 行 電 泳 ， 根 據(jù) 已 知 分 子 量的 標(biāo) 準(zhǔn) 蛋 白 的 電 泳 區(qū) 帶 位 置 ， 用 電 泳 遷 移率 和 分 子 量 的 對(duì) 數(shù) 作 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 ， 可 以 測(cè) 定未 知 蛋 白 質(zhì) 的 分 子 量 。 市 場(chǎng) 上 有 高 分 子 量 、次 高 分 子 量 及 低 分 子 量 的 標(biāo) 準(zhǔn) 蛋 白 試 劑 出售