高中生物選修一《生物技術實踐》課后題答案和提示.doc

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專題1 傳統發(fā)酵技術的應用 課題1 果酒和果醋的制作 實驗案例 制作葡萄酒和葡萄醋 建議將實驗安排在秋季的9月或10月進行。在這段時間內進行實驗，有如下優(yōu)點：（1）正值收獲季節(jié)，葡萄的價格便宜，品種多樣；（2）此時葡萄上的酵母菌數量多且生活力強，發(fā)酵釀酒的效果好；（3）溫度適宜，發(fā)酵現象非常明顯。實驗的具體操作步驟如下。 1.對發(fā)酵瓶、紗布、榨汁機、盛葡萄汁的器皿等實驗用具進行清洗并消毒。先用溫水反復沖洗幾次,再用體積分數為75%的酒精擦拭消毒，晾干待用。 2. 取葡萄500 g，去除枝梗和腐爛的子粒。 3. 用清水沖洗葡萄1～2遍除去污物，注意不要反復多次沖洗。 4. 用榨汁機榨取葡萄汁后，將其裝入發(fā)酵瓶中（裝置參見教材圖1-4b），或將葡萄打成漿后，用潔凈的紗布過濾至發(fā)酵瓶中，蓋好瓶蓋。如果沒有合適的發(fā)酵裝置，可以用500 mL的塑料瓶替代，但注入的果汁量不要超過塑料瓶總體積的2/3。 5. 將發(fā)酵瓶置于適宜的溫度下發(fā)酵。 6. 由于發(fā)酵旺盛期CO2的產量非常大，因此需要及時排氣，防止發(fā)酵瓶爆裂。如果使用簡易的發(fā)酵裝置，如瓶子（最好選用塑料瓶），每天要擰松瓶蓋2～4次，進行排氣。 7. 10 d以后，可以開始進行取樣檢驗工作。例如，可以檢驗酒味、酒精的含量、進行酵母菌的鏡檢等工作。 8. 當果酒制成以后，可以在發(fā)酵液中加入醋酸菌或醋曲，然后將裝置轉移至30～35 ℃的條件下發(fā)酵，適時向發(fā)酵液中充氣。如果找不到醋酸菌菌種或醋曲，可嘗試自然接種，但效果不是很好。如果沒有充氣裝置，可以將瓶蓋打開，在瓶口蓋上紗布，以減少空氣中塵土等的污染。 課題成果評價 （一）果酒的制作是否成功 發(fā)酵后取樣，通過嗅味和品嘗進行初步鑒定。此外，還可用顯微鏡觀察酵母菌，并用重鉻酸鉀檢驗酒精的存在。如果實驗結果不理想，請學生分析失敗原因，然后重新制作。 （二）果醋的制作是否成功 首先通過觀察菌膜的形成、嗅味和品嘗進行初步鑒定，再通過檢測和比較醋酸發(fā)酵前后的pH作進一步的鑒定。此外，還可以通過在顯微鏡下觀察發(fā)酵液中是否有醋酸菌，并統計其數量作進一步鑒定。 答案和提示 （一）旁欄思考題 1.你認為應該先沖洗葡萄還是先除去枝梗？為什么？ 答：應該先沖洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗時引起葡萄破損，增加被雜菌污染的機會。 2.你認為應該從哪些方面防止發(fā)酵液被污染？ 提示：需要從發(fā)酵制作的過程進行全面的考慮。例如，榨汁機、發(fā)酵裝置要清洗干凈；每次排氣時只需擰松瓶蓋、不要完全揭開瓶蓋等。 3.制葡萄酒時，為什么要將溫度控制在18～25 ℃？制葡萄醋時，為什么要將溫度控制在30～35 ℃？ 答：溫度是酵母菌生長和發(fā)酵的重要條件。20 ℃左右最適合酵母菌繁殖。因此需要將溫度控制在其最適溫度范圍內。而醋酸菌是嗜溫菌，最適生長溫度為30～35 ℃，因此要將溫度控制在30～35 ℃。 4.制葡萄醋時，為什么要適時通過充氣口充氣？ 答：醋酸菌是好氧菌，在將酒精變?yōu)榇姿釙r需要氧的參與，因此要適時向發(fā)酵液中充氣。 （二）［資料］發(fā)酵裝置的設計討論題 請分析此裝置中的充氣口、排氣口和出料口分別有哪些作用。為什么排氣口要通過一個長而彎曲的膠管與瓶身連接？結合果酒、果醋的制作原理，你認為應該如何使用這個發(fā)酵裝置？ 答：充氣口是在醋酸發(fā)酵時連接充氣泵進行充氣用的；排氣口是在酒精發(fā)酵時用來排出CO2的；出料口是用來取樣的。排氣口要通過一個長而彎曲的膠管與瓶身連接，其目的是防止空氣中微生物的污染，其作用類似巴斯德的鵝頸瓶。使用該裝置制酒時，應該關閉充氣口；制醋時，應將充氣口連接氣泵，輸入氧氣。 （三）練習 2.提示：大規(guī)模生產時需要進行更為全面周詳的考慮，如原料的來源與選擇、菌種的培育與選擇、發(fā)酵的設備、發(fā)酵條件的自動化控制，以及如何嚴格控制雜菌污染；等等。此外，無論是葡萄酒或葡萄醋，實驗時所檢測的發(fā)酵液，并非商品意義上的產品。在實際生產中還需沉淀過濾、滅菌裝瓶等獲得成品酒或醋。葡萄酒還需在一定設施和條件下（如橡木桶和地窖）進行后續(xù)發(fā)酵，以獲得特定的風味和色澤。 3.提示：需考慮廠房、設備投資、原材料采購、工人人數及工資、產品種類、生產周期、銷售渠道、利潤等問題。 課題2 腐乳的制作 實驗案例 制作腐乳 實驗的具體操作步驟如下。 1.將豆腐切成3cm3cm1cm的若干塊。所用豆腐的含水量為70％左右，水分過多則腐乳不易成形。水分測定方法如下。 精確稱取經研缽研磨成糊狀的樣品5～10 g (精確到0.02mg )，置于已知重量的蒸發(fā)皿中，均勻攤平后，在100～105 ℃電熱干燥箱內干燥4 h，取出后置于干燥器內冷卻至室溫后稱重，然后再烘30 min，直至所稱重量不變?yōu)橹埂? 樣品水分含量（%）計算公式如下。 (烘干前容器和樣品質量-烘干后容器和樣品質量)/烘干前樣品質量 2.將豆腐塊平放在鋪有干粽葉的盤內，粽葉可以提供菌種，并能起到保溫的作用。每塊豆腐等距離排放，周圍留有一定的空隙。豆腐上面再鋪上干凈的粽葉。氣候干燥時，將平盤用保鮮膜包裹，但不要封嚴，以免濕度太高，不利于毛霉的生長。 3.將平盤放入溫度保持在15～18 ℃的地方。毛霉逐漸生長，大約5 d后豆腐表面叢生著直立菌絲。 4.當毛霉生長旺盛，并呈淡黃色時，去除包裹平盤的保鮮膜以及鋪在上面的粽葉，使豆腐塊的熱量和水分能夠迅速散失，同時散去霉味。這一過程一般持續(xù)36 h以上。 5.當豆腐涼透后，將豆腐間連接在一起的菌絲拉斷，并整齊排列在容器內，準備腌制。 6.長滿毛霉的豆腐塊（以下稱毛坯）與鹽的質量分數比為5∶1。將培養(yǎng)毛坯時靠近平盤沒長直立菌絲的一面統一朝向玻璃瓶邊，將毛坯分層盤立擺放在容器中。分層加鹽，并隨層加高而增加鹽量，在瓶口表面鋪鹽厚些，以防止雜菌從瓶口進入。約腌制8 d。 7.將黃酒、米酒和糖，按口味不同而配以各種香辛料（如胡椒、花椒、八角茴香、桂皮、姜、辣椒等）混合制成鹵湯。鹵湯酒精含量控制在12％左右為宜［注］。 ［注］酒精含量的高低與腐乳后期發(fā)酵時間的長短有很大關系。酒精含量越高，對蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延長；酒精含量過低，蛋白酶的活性高，加快蛋白質的水解，雜菌繁殖快，豆腐易腐敗，難以成塊。 8.將廣口玻璃瓶刷干凈后，用高壓鍋在100 ℃蒸汽滅菌30 min。將腐乳咸坯擺入瓶中，加入鹵湯和輔料后，將瓶口用酒精燈加熱滅菌，用膠條密封。在常溫情況下，一般六個月可以成熟。 課題成果評價 （一）是否完成腐乳的制作 學生是否完成腐乳的制作依據是：能夠合理地選擇實驗材料與用具；前期發(fā)酵后豆腐的表面長有菌絲，后期發(fā)酵制作基本沒有雜菌的污染。 （二）腐乳質量的評價 制作成功的腐乳應該具有以下特點：色澤基本一致、味道鮮美、咸淡適口、無異味、塊形整齊、厚薄均勻、質地細膩、無雜質。 （三） 能否總結不同條件對腐乳風味和質量的影響。 學生能從鹽、酒的用量、發(fā)酵的溫度、發(fā)酵時間的長短，以及香辛料等因素中的某一因素來說明其對腐乳風味或質量的影響。 答案和提示 （一）旁欄思考題 1.你能利用所學的生物學知識，解釋豆腐長白毛是怎么一回事？ 答：豆腐上生長的白毛是毛霉的白色菌絲。嚴格地說是直立菌絲，在豆腐中還有匍匐菌絲。 2.王致和為什么要撒許多鹽，將長毛的豆腐腌起來？ 答：鹽能防止雜菌污染，避免豆腐腐敗。 3.我們平常吃的豆腐，哪種適合用來做腐乳？ 答：含水量為70%左右的豆腐適于作腐乳。用含水量過高的豆腐制腐乳，不易成形。 4.吃腐乳時，你會發(fā)現腐乳外部有一層致密的“皮”。這層“皮”是怎樣形成的呢？它對人體有害嗎？它的作用是什么？ 答：“皮”是前期發(fā)酵時在豆腐表面上生長的菌絲（匍匐菌絲），它能形成腐乳的“體”，使腐乳成形?！捌ぁ睂θ梭w無害。 （二）練習 1.答：越接近瓶口，雜菌污染的可能性越大，因此要隨著豆腐層的加高增加鹽的用量，在接近瓶口的表面，鹽要鋪厚一些，以有效防止雜菌污染。 課題3 制作泡菜并檢測亞硝酸鹽含量 課題成果評價 （一）泡菜腌制的質量如何 可以根據泡菜的色澤和風味進行初步的評定，還可以在顯微鏡下觀察乳酸菌形態(tài)，比較不同時期泡菜壇中乳酸菌的含量。 （二）亞硝酸鹽含量的測定 配制的亞硝酸鹽標準使用液與樣品液顯色后，目測比色效果如何，是否與標準液的濃度相吻合。如果不吻合，還應在已知濃度范圍內，改變濃度梯度，進一步配制標準使用液。 （三）是否進行了及時細致的觀察與記錄 在實驗進行過程中，應及時對泡菜中亞硝酸鹽含量進行鑒定，比較不同時期亞硝酸鹽含量的變化及其對泡菜質量的影響。 答案和提示 （一）旁欄思考題 1.為什么含有抗生素的牛奶不能發(fā)酵成酸奶？ 答：酸奶的制作依靠的是乳酸菌的發(fā)酵作用?？股啬軌驓⑺阑蛞种迫樗峋纳L，因此含有抗生素的牛奶不能發(fā)酵成酸奶。 2.為什么日常生活中要多吃新鮮蔬菜，不吃存放時間過長、變質的蔬菜？ 答：有些蔬菜，如小白菜和蘿卜等，含有豐富的硝酸鹽。當這些蔬菜放置過久發(fā)生變質（發(fā)黃、腐爛）或者煮熟后存放太久時，蔬菜中的硝酸鹽會被微生物還原成亞硝酸鹽，危害人體健康。 3.為什么泡菜壇內有時會長一層白膜？你認為這層白膜是怎么形成的？ 答：形成白膜是由于產膜酵母的繁殖。酵母菌是兼性厭氧微生物，泡菜發(fā)酵液營養(yǎng)豐富，其表面氧氣含量也很豐富，適合酵母菌繁殖。 （二）練習 2.答：果酒的制作主要利用的是酵母菌的酒精發(fā)酵，果醋的制作利用的是醋酸菌將酒精轉變?yōu)榇姿岬拇x，腐乳的制作利用的主要是毛霉分泌的蛋白酶等酶類，泡菜的制作利用的是乳酸菌的乳酸發(fā)酵。 傳統發(fā)酵技術都巧妙地利用了天然菌種，都為特定的菌種提供了良好的生存條件，最終的發(fā)酵產物不是單一的組分，而是成分復雜的混合物。 專題2 微生物的培養(yǎng)與應用 課題1 微生物的實驗室培養(yǎng) 課題成果評價 （一）培養(yǎng)基的制作是否合格 如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2 d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。 （二）接種操作是否符合無菌要求 如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達到要求，需要分析原因，再次練習。 （三）是否進行了及時細致的觀察與記錄 培養(yǎng)12 h與24 h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同，及時觀察記錄的同學會發(fā)現這一點，并能觀察到其他一些細微的變化。這一步的要求主要是培養(yǎng)學生良好的科學態(tài)度與習慣。 答案和提示 （一）旁欄思考題 1.無菌技術除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？ 答：無菌技術還能有效避免操作者自身被微生物感染。 2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。 （1） 培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿 （2） 玻棒、試管、燒瓶和吸管 （3） 實驗操作者的雙手 答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。 （二）倒平板操作的討論 1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 ℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？ 提示：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。 2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？ 答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。 3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？ 答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。 4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？ 答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。 （三）平板劃線操作的討論 1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？ 答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數的增加，使每次劃線時菌種的數目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。 2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？ 答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。 3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？ 答：劃線后，線條末端細菌的數目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數目隨著劃線次數的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。 （四）涂布平板操作的討論 涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。結合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應如何進行無菌操作？ 提示：應從操作的各個細節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍；等等。 （五）練習 1.提示：可以從微生物生長需要哪些條件的角度來思考。例如，微生物的生長需要水、空氣、適宜的溫度，食品保存可以通過保持干燥、真空的條件，以及冷藏等方法來阻止微生物的生長。 2.提示：可以從這三種培養(yǎng)技術的原理、操作步驟等方面分別進行總結歸納。例如，這三種培養(yǎng)技術都需要為培養(yǎng)物提供充足的營養(yǎng)，但無土栽培技術的操作并不需要保證無菌的條件，而其他兩種技術都要求嚴格的無菌條件。 3.提示：這是一道開放性的問題，答案并不惟一，重點在于鼓勵學生積極參與，從不同的角度思考問題。例如，正是由于證明了微生物不是自發(fā)產生的，微生物學才可能發(fā)展成為一門獨立的學科；巴斯德實驗中用到的加熱滅菌的方法導致了有效的滅菌方法的出現，而這一滅菌原理也適用于食品的保存等。 課題2 土壤中分解尿素的細菌的分離與計數 實驗案例 土壤中某樣品細菌的分離與計數 實驗的具體操作步驟如下。 1.土壤取樣 從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3 cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。 2.制備培養(yǎng)基 準備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基將菌液稀釋相同的倍數，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數目應明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對照，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。由于初次實驗，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個較為寬泛的范圍：稀釋倍數為103～107。每個稀釋度下需要3個選擇培養(yǎng)基，1個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，因此共需要15個選擇培養(yǎng)基，5個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。此外，還需要準備8個滅菌的試管和1個滅菌的移液管。 3.微生物的培養(yǎng)與觀察 參考課本中圖2-7的實驗流程示意圖，將10 g土樣加入盛有90 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中（錐形瓶體積為250 mL），充分搖勻，吸取上清液1 mL，轉移至盛有9 mL的生理鹽水的無菌大試管中，依次等比稀釋至107稀釋度，并按照由107～103稀釋度的順序分別吸取0.1 mL進行平板涂布操作。按照濃度從低到高的順序涂布平板，不必更換移液管。 將涂布好的培養(yǎng)皿放在30 ℃溫度下培養(yǎng)。隨著培養(yǎng)時間的延長，會有不同的菌落產生。比較牛肉膏培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基中菌落的數量、形態(tài)等，并做好記錄。 挑選選擇培養(yǎng)基中不同形態(tài)的菌落接入含酚紅培養(yǎng)基的斜面中，觀察能否產生如課本中圖2-10的顏色反應。 4.細菌的計數 當菌落數目穩(wěn)定時，選取菌落數在30～300的平板進行計數。在同一稀釋度下，至少對3個平板進行重復計數，然后求出平均值，并根據平板所對應的稀釋度計算出樣品中細菌的數目。 課題成果評價 （一）培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落 對照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數目明顯大于選擇培養(yǎng)基的數目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。 （二）樣品的稀釋操作是否成功 如果得到了2個或2個以上菌落數目在30～300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數。 （三）重復組的結果是否一致 如果學生選取的是同一種土樣，統計的結果應該接近。如果結果相差太遠，教師需要引導學生一起分析產生差異的原因。 答案和提示 （一）旁欄思考題 1.想一想，如何從平板上的菌落數推測出每克樣品中的菌落數？ 答：統計某一稀釋度下平板上的菌落數，最好能統計3個平板，計算出平板菌落數的平均值，然后按課本旁欄的公式進行計算。 2.為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數量，選用的稀釋范圍相同嗎？ 答：這是因為土壤中各類微生物的數量（單位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細菌數約為2 185萬，放線菌數約為477萬，霉菌數約為23.1萬。因此，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進行分離，同時還應當有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。 （二）練習 2.提示：反芻動物的瘤胃中含有大量的微生物，其中也包括分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多為厭氧菌，接觸空氣后會死亡，因此分離其中能分解尿素的微生物除了需要準備選擇培養(yǎng)基外，還應參照厭氧菌的培養(yǎng)方法進行實驗設計。 課題3 分解纖維素的微生物的分離 實驗案例 土壤中纖維素分解菌的分離 實驗的具體操作步驟如下。 1.土樣采集 土樣采集的方法與本專題課題2類似。土樣的采集要選擇富含纖維素的環(huán)境，這是因為在纖維素含量豐富的環(huán)境，通常會聚集較多的分解纖維素的微生物。如果找不到合適的環(huán)境，可以將濾紙埋在土壤中，過一個月左右也會有能分解纖維素的微生物生長。 2.選擇培養(yǎng) 選擇培養(yǎng)需要的儀器有：250 mL錐形瓶、無菌稱量瓶、藥匙、1 mL和10 mL的移液管、天平、搖床、溫度計等。 培養(yǎng)基的制備參照課本旁欄中的比例配制。在250 mL錐形瓶中裝入30 mL培養(yǎng)基，用8層紗布做成瓶塞，將瓶口塞緊，再在瓶塞外包裹兩層包裝紙（或報紙），用線繩扎緊，在121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。 選擇培養(yǎng)的操作：稱取土樣20 g，在無菌條件下加入裝有30 mL培養(yǎng)基的搖瓶中。將搖瓶置于搖床上，在30 ℃下振蕩培養(yǎng)1～2 d，至培養(yǎng)基變混濁。此時可以吸取0.1 mL培養(yǎng)液進行梯度稀釋和涂布平板，也可以按課本中所述，重復選擇培養(yǎng)的步驟一次，然后再進行梯度稀釋和涂布平板。 3.剛果紅染色法分離 纖維素分解菌這一步所需要的儀器有：無菌培養(yǎng)皿、涂布器、1 mL移液管，裝有9mL無菌水的20 mL大試管，溫箱等。 培養(yǎng)基的制備參照課本旁欄中的比例配制。在500 mL三角瓶中裝入200 mL培養(yǎng)基，在121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。 倒平板操作：將滅菌后的固體培養(yǎng)基熔化，按無菌操作的要求，在無菌的培養(yǎng)皿中倒入15～20 mL培養(yǎng)基，凝固后待用。 制備菌懸液：按照本專題課題1的稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進行等比稀釋，稀釋最大倍數至106。 涂布平板：將稀釋度為104～106的菌懸液各取0.1 mL，滴加在平板培養(yǎng)基上，用涂布器將菌液涂布均勻，在30 ℃倒置培養(yǎng)，至菌落長出。每個稀釋度下需涂布3個平板，并注意設置對照。剛果紅染色的具體操作步驟參照課本［資料三］。 課題成果評價 （一）培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落：對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。如果觀察到產生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。 （二）分離的結果是否一致：由于在土壤中細菌的數量遠遠高于真菌和放線菌的數量，因此最容易分離得到的是細菌。但由于所取土樣的環(huán)境不同，學生也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結果。 答案和提示 （一）旁欄思考題 1.本實驗的流程與課題2中的實驗流程有哪些異同？ 答：本實驗流程與課題2的流程的區(qū)別如下。課題2是將土樣制成的菌懸液直接涂布在以尿素為惟一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離得到菌落。本課題通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致。 2.為什么要在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌？ 答：由于生物與環(huán)境的相互依存關系，在富含纖維素的環(huán)境中，纖維素分解菌的含量相對提高，因此從這種土樣中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。 3.將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認為濾紙應該埋進土壤多深？ 答：將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對聚集，實際上是人工設置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應將紙埋于深約10 cm左右腐殖土壤中。 4.想一想，這兩種方法各有哪些優(yōu)點與不足？你打算選用哪一種方法？ 提示：參看本課題參考資料的內容。 5.為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需的微生物？ 答：在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠適應這種營養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應這種營養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用。 （二）練習 2.答：流程圖表示如下。 土壤取樣→選擇培養(yǎng)（此步是否需要，應根據樣品中目的菌株數量的多少來確定）→梯度稀釋→將菌懸液涂布到有特定選擇作用的培養(yǎng)基上→挑選單菌落→發(fā)酵培養(yǎng) 專題3 植物的組織培養(yǎng)技術 課題1 菊花的組織培養(yǎng) 課題成果評價 （一）對接種操作中污染情況的分析 接種3～4 d后，在接種操作中被雜菌污染的培養(yǎng)物會表現出被污染的現象。請學生適時統計污染率，分析接種操作是否符合無菌要求。 （二）是否完成了對植物組織的脫分化和再分化 觀察實驗結果，看看是否培養(yǎng)出了愈傷組織，記錄多長時間長出愈傷組織。統計更換培養(yǎng)基后愈傷組織進一步分化成根和芽的比例和時間。 （三）是否進行了統計、對照與記錄 做好統計和對照，填好結果記錄表，培養(yǎng)嚴謹的科學態(tài)度。從實驗的第一步開始就要求學生做好實驗記錄，可以讓學生分組配制不同培養(yǎng)基，如誘導愈傷或直接分化叢芽的培養(yǎng)基，然后做不同配方的比較。 （四）生根苗的移栽是否合格 生根苗移栽技術的關鍵是既要充分清洗根系表面的培養(yǎng)基，又不能傷及根系。一般使用無土栽培的辦法。培養(yǎng)基質要提前消毒，可以向培養(yǎng)基質噴灑質量分數為5%的高錳酸鉀，并用塑料薄膜覆蓋12 h。掀開塑料薄膜后24 h才能移栽。新移栽的組培苗要在溫室過渡幾天，等壯苗后再定植大田或進行盆栽。學生可以在課后統計自己移栽的成活率，看看移栽是否合格。 答案和提示 （一）旁欄思考題 1.你能說出各種營養(yǎng)物質的作用嗎？同專題2中微生物培養(yǎng)基的配方相比，MS培養(yǎng)基的配方有哪些明顯的不同？ 答：微量元素和大量元素提供植物細胞生活所必需的無機鹽；蔗糖提供碳源，同時能夠維持細胞的滲透壓；甘氨酸、維生素等物質主要是為了滿足離體植物細胞在正常代謝途徑受到一定影響后所產生的特殊營養(yǎng)需求。微生物培養(yǎng)基以有機營養(yǎng)為主。與微生物的培養(yǎng)不同，MS培養(yǎng)基則需提供大量無機營養(yǎng)，無機鹽混合物包括植物生長必須的大量元素和微量元素兩大類。 2.你打算做幾組重復？你打算設置對照實驗嗎？ 答：教師可以安排學生分組，做不同的材料或配方，最后分別匯報成果。但每種材料或配方至少要做一組以上的重復。設置對照實驗可以取用一個經過滅菌的裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，與接種操作后的錐形瓶一同培養(yǎng)，用以說明培養(yǎng)基制作合格，沒有被雜菌污染。 （二）練習 1.答：植物組織培養(yǎng)所利用的植物材料體積小、抗性差，對培養(yǎng)條件的要求較高。用于植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基同樣適合于某些微生物的生長，如一些細菌、真菌等的生長。而培養(yǎng)物一旦受到微生物的污染，就會導致實驗前功盡棄，因此要進行嚴格的無菌操作。 2.答：外植體的生理狀態(tài)是成功進行組織培養(yǎng)的重要條件之一。生長旺盛的嫩枝生理狀況好，容易誘導脫分化和再分化。 課題2 月季的花藥培養(yǎng) 課題成果評價 （一）選材是否恰當 選材是否成功是花藥培養(yǎng)成功的關鍵。學生應學會通過顯微鏡觀察處于適宜發(fā)育期的花粉。 （二）無菌技術是否過關 如果出現了污染現象，說明某些操作步驟，如培養(yǎng)基滅菌、花蕾消毒或接種等有問題。 （三）接種是否成功 如果接種的花藥長出愈傷組織或釋放出胚狀體，花藥培養(yǎng)的第一步就成功了。要適時轉換培養(yǎng)基，以便愈傷組織或胚狀體進一步分化成再生植株。 答案和提示 （一）旁欄思考題 為什么花瓣松動會給材料的消毒帶來困難？ 答：花瓣松動后，微生物就可能侵入到花藥，給材料的消毒帶來困難。 （二）練習 1.答：F2代紫色甜玉米的基因型組成可能為Aasusu或AAsusu。如果運用常規(guī)育種方法，將F2代中的紫色甜玉米與白色甜玉米（aasusu）進行測交，可以選擇出基因型為AAsusu純種紫色甜玉米。但這種方法比較繁瑣，耗時也較長，需要至少三年的選種和育種時間。如果利用花藥培養(yǎng)的技術，在F1代產生的花粉中就可能有Asu的組合，再將花粉植株進行染色體加倍，就可以直接得到紫色甜玉米的純合體（AAsusu）。這種方法可以大大縮短育種周期。 2.答：植物組織培養(yǎng)技術與花藥培養(yǎng)技術的相同之處是：培養(yǎng)基配制方法、無菌技術及接種操作等基本相同。兩者的不同之處在于：花藥培養(yǎng)的選材非常重要，需事先摸索時期適宜的花蕾；花藥裂開后釋放出的愈傷組織或胚狀體也要及時更換培養(yǎng)基；花藥培養(yǎng)對培養(yǎng)基配方的要求更為嚴格。這些都使花藥培養(yǎng)的難度大為增加。 專題4 酶的研究與應用 課題1 果膠酶在果汁生產中的作用 課題成果評價 本課題評價的重點應放在對學生探究報告的評價上。報告的主要內容應該包括：根據實驗數據繪制出的溫度和pH對果膠酶活性影響的曲線圖；不同果膠酶用量對出汁量影響的曲線圖（在濃度和體積相同的條件下）；并最終得到果膠酶最適溫度、pH以及果膠酶的最適用量。 答案和提示 （一）旁欄思考題 1．為什么在混合蘋果泥和果膠酶之前，要將果泥和果膠酶分裝在不同的試管中恒溫處理？ 提示：將果泥和果膠酶分裝在不同的試管中恒溫處理，可以保證底物和酶在混合時的溫度是相同的，避免了果泥和果膠酶混合時影響混合物的溫度，從而影響果膠酶活性的問題。 2．在探究溫度或pH的影響時，是否需要設置對照？如果需要，又應該如何設置？為什么？ 提示：需要設置對照實驗，不同的溫度梯度之間或不同的pH梯度之間就可以作為對照，這種對照稱為相互對照。 3．A同學將哪個因素作為變量，控制哪些因素不變？為什么要作這樣的處理？B同學呢？ 提示：A同學將溫度或pH作為變量，控制不變的量有蘋果泥的用量、果膠酶的用量、反應的時間和過濾的時間等。只有在實驗中保證一個自變量，實驗結果才能說明問題。B同學對于變量的處理應該與A同學相同，只是觀察因變量的角度不同。 4．想一想，為什么能夠通過測定濾出的蘋果汁的體積大小來判斷果膠酶活性的高低？ 提示：果膠酶將果膠分解為小分子物質，小分子物質可以通過濾紙，因此蘋果汁的體積大小反應了果膠酶的催化分解果膠的能力。在不同的溫度和pH下，果膠酶的活性越大，蘋果汁的體積就越大。 5．當探究溫度對果膠酶活性的影響時，哪個因素是變量，哪些因素應該保持不變？ 提示：溫度是變量，應控制果泥量、果膠酶的濃度和用量、水浴時間和混合物的pH等所有其他條件不變。只有這樣才能保證只有溫度一個變量對果膠酶的活性產生影響。 （二）練習 答：大規(guī)模生產與實驗室制備的主要不同點是： 1.有兩次瞬間高溫滅菌； 2.酶處理的時間相對較長； 3.有離心分離步驟和濃縮步驟。 課題2 探討加酶洗衣粉的洗滌效果 實驗方案的設計 實驗材料：添加了復合酶的洗衣粉，大小相同的白棉布4塊（在上面分別滴加4滴同種的植物油，放置至干燥）。 水溫、水質及水量：水溫的溫度梯度為5 ℃、15 ℃、25 ℃和35 ℃（其中5 ℃可以通過冰箱冷藏室來控制，其他溫度可以通過水浴控制）；水質為自來水；水量為500 mL。 實驗儀器：1 000 mL的燒杯、玻璃棒等。 子課題二不同種類的洗衣粉對同一污漬或不同污漬洗滌效果的比較 比較子課題一與子課題二：在子課題一中，水溫是變量，其他因素在實驗中保持不變；而在子課題二中，水溫則應保持不變。在實施子課題二時，通常應采用當地的常溫，如果是冬季水溫過低，就應采用水浴的方法，使溫度達到25 ℃～35 ℃。 市場中的洗衣粉有多種類型，應選擇不同種類的加酶洗衣粉和普通洗衣粉。污物的選擇也應該多樣化，只有這樣才具有實踐指導意義。表4-2的選擇供參考，表中的“√”號表示可以進行實驗。此外，學生也可以針對污漬相同、布料（如化纖或棉布）的不同情況，探究不同種類洗衣粉的洗滌效果。 不同種類的洗衣粉對同一污漬或不同污漬洗滌效果的列表比較 污染物 蛋白酶洗衣粉 復合酶洗衣粉 普通洗衣粉 油漬 √ √ 血漬 √ √ √ 奶漬 √ √ √ 果汁漬 √ √ √ 課題成果評價 本課題的評價可以分為三個方面：一是設計的實驗方案是否思路清晰、科學性和操作性強；二是實驗報告是否全面，是否涵蓋了本課題所要求達到的目標；三是能否根據自己的探究成果，結合生活中的實際情況，設計一份宣傳板報或有關加酶洗衣粉的使用說明材料，供家人或本校的教職員工參考。學生完成課題后，應該得出以下三方面的結論。 1．加酶洗衣粉與普通洗衣粉洗滌效果的比較分析。 2．各種不同品牌的加酶洗衣粉對油漬、血漬和奶漬等污物的不同的洗滌效果分析。 3．使用加酶洗衣粉時應注意的一些事項。 答案和提示 （一）旁欄思考題 1．查閱資料，看看普通洗衣粉中包含哪些化學成分？ 提示：普通洗衣粉中通常包含有：表面活性劑、水軟化劑、堿劑、漂白劑等成分，有的洗衣粉中還含有增白劑、香精和色素，以及填充劑等。 2．在本課題中你打算使用什么方法和標準判斷洗滌效果？ 提示：可在洗滌后比較污物的殘留狀況，如：已消失、顏色變淺、面積縮小等，最好能進行定量的比較。 （二）練習 1.答：列表比較如下。 普通洗衣粉 加酶洗衣粉 相同點 表面活性劑可以產生泡沫，可以將油脂分子分散開；水軟化劑可以分散污垢；等等。 不同點 酶可以將大分子有機物分解為小分子有機物，小分子有機物易于溶于水，從而與纖維分開。 2.答：不合適。因為絲綢的主要成分是蛋白質，它會被加酶洗衣粉中的蛋白酶分解，損壞衣物。 課題3 酵母細胞的固定化 課題成果評價 （一）觀察凝膠珠的顏色和形狀 如果制作的凝膠珠顏色過淺、呈白色，說明海藻酸鈉的濃度偏低，固定的酵母細胞數目較少；如果形成的凝膠珠不是圓形或橢圓形，則說明海藻酸鈉的濃度偏高，制作失敗，需要再作嘗試。 （二）觀察發(fā)酵的葡萄糖溶液 利用固定的酵母細胞發(fā)酵產生酒精，可以看到產生了很多氣泡，同時會聞到酒味。 教師不僅要對學生制作的固定化酵母細胞進行評價，還要對學生的操作過程進行評價。此外，對酵母細胞固定化原理和實驗操作方法的理解，也應是評價的有機組成部分。 答案和提示 練習 1.答：直接使用酶、固定化酶和固定化細胞催化的優(yōu)缺點如下表所示。 類型 優(yōu)點 不足 直接使用酶 催化效率高，低耗能、低污染等。 對環(huán)境條件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很難回收，不能被再次利用，提高了生產成本；反應后酶會混在產物中，可能影響產品質量。 固定化酶 酶既能與反應物接觸，又能與產物分離，同時，固定在載體上的酶還可以被反復利用。 一種酶只能催化一種化學反應，而在生產實踐中，很多產物的形成都通過一系列的酶促反應才能得到的。 固定化細胞 成本低，操作更容易。 固定后的酶或細胞與反應物不容易接近，可能導致反應效果下降等。 3.提示：可以從酶的結構的多樣性，對理化條件的敏感程度等角度思考。 專題5 DNA和蛋白質技術 課題1 DNA的粗提取與鑒定 實驗案例 案例一 以雞血為實驗材料進行DNA的粗提取 課前準備 本實驗用雞血細胞做實驗材料有兩個原因。一是因為雞血細胞核的DNA含量豐富，材料易得；二是雞血細胞極易吸水脹破，而用動物肝臟細胞作實驗材料常常需要勻漿和離心，對設備要求較高，操作繁瑣，歷時較長。 教師可以到市場售活雞處索取雞血，所帶燒杯中必須提前放入抗凝劑檸檬酸鈉溶液。具體制備方法如下。取質量濃度為0.1 g/mL的檸檬酸鈉溶液100 mL，置于500 mL燒杯中，注入新鮮的雞血（約180 mL），同時用玻璃棒攪拌，使血液與檸檬酸鈉溶液充分混合，以免血液凝結。將燒杯中的血液置于冰箱內，靜置1 d，使血細胞自行沉淀。有條件的學校也可以將血液倒入離心管內進行離心，用2 000 r/min或3 000 r/min的轉速，離心2 min，使血細胞沉淀于離心管底部，這樣可以使血細胞沉淀更完全。用吸管除去上部的澄清液，就可以得到雞血細胞液。值得注意的是雞血細胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取過程中為了減少DNA的損失，最好使用塑料的燒杯和試管盛放雞血細胞液。 提取DNA的具體步驟 1.破碎細胞，釋放DNA 雞血細胞中的DNA與核蛋白結合，位于雞血細胞的細胞核中，正常情況下是不會釋放出來的。為了使DNA從細胞核中釋放出來，需要向雞血細胞液中加入蒸餾水，并且攪拌，從而使血細胞膜和核膜脹破。用玻璃棒攪拌可以加速細胞的破裂。注意應沿一個方向快速攪拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA。一般5～10 mL的雞血細胞液加入20 mL蒸餾水攪拌5 min。釋放出來的大量DNA和RNA往往與蛋白質結合在一起，應用3～4層紗布進行過濾，除去一些顆粒較大的雜質。 2．溶解細胞核內的DNA 在濃度較高的NaCl溶液中核蛋白容易解聚，游離出的DNA溶解在溶液中。在溶液中加入兩倍體積的濃度為2 mol/L的NaCl溶液，攪拌1 min。注意應沿一個方向攪拌，使DNA充分溶解。 3．DNA的析出 將溶液中的DNA與其他雜質分離，這一步驟是實驗成敗的關鍵。教材中列舉了提取DNA的三種方案，本案例選取方案一。加蒸餾水降低NaCl溶液濃度，使DNA析出。實驗中應該緩慢貼壁加入蒸餾水，并輕輕地沿一個方向不停地均勻攪拌，以利于DNA分子的附著和纏繞。同時應注意控制加水量，使NaCl溶液的終濃度為0.1～0.2 mol/L。加水過程一般分三次進行，當總加水量為300 mL左右時，DNA已基本析出。加水太多、溶液過稀，會使DNA分子又重新溶解。 用3～4層紗布對DNA稀釋液進行過濾，濾去蛋白質，收集DNA的黏稠物。如果采用離心法，效果更好。用4 000 r/min轉速的離心機，離心15 min，除去上清液(含有蛋白質)，留下的沉淀物中含有DNA。此時注意觀察DNA黏稠物的顏色。 4.DNA的初步純化 如果提取的DNA量不夠多且其中含有較多雜質，或者加入溶液和攪拌等操作過程不規(guī)范，都會導致實驗現象不明顯，常常使制取的DNA粗制品不能顯示出DNA的本色──白色。為了增進實驗效果，需要對DNA粗制品進行簡單的提純，下面的方案可供參考。 將DNA黏稠物再溶解，繼續(xù)用2 mol/L的NaCl溶液20 mL溶解DNA黏稠物，仍舊沿一個方向不停攪拌3 min，使DNA充分溶解，以免損失。用3～4層紗布進行過濾（或離心），濾去雜質，收集含有DNA的濾液。向濾液中貼壁緩慢加入50 mL預冷的體積分數為95％的乙醇，并用玻璃棒朝一個方向緩慢、均勻地攪拌，溶液中會出現DNA絲狀物。 實驗一般要求采用預冷的95％的乙醇，但對比結果顯示，常溫下的乙醇溶液也可產生明顯效果。從理論上分析，預冷的乙醇溶液具有以下優(yōu)點。一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降低分子運動，易于形成沉淀析出；三是低溫有利于增加DNA分子柔韌性，減少斷裂。此時懸浮于溶液中的DNA絲狀物相對含雜質較少，如果出現的絲狀物較少，可以將此混合液再放入冰箱中冷卻幾分鐘。濃縮后的DNA絲狀物，可以用緩緩旋轉玻璃棒的方法卷起(因為玻璃棒有吸附DNA的作用)。如果DNA絲狀物較少，不易吸附在玻璃棒上，也可以用筷子等表面粗糙的用具來幫助DNA分子纏繞。 DNA的純化還有許多其他方法。例如，添加質量分數為25％的十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液，使蛋白質變性后與DNA分開。隨后，加入氯仿—異丙醇混合液（體積比為24∶1），通過離心將蛋白質及其他雜質除去,取上清液?？芍貜蜕鲜霾僮鲙状危敝辽锨逡鹤兂赏该鞯酿こ硪后w。此外苯酚可以迅速使蛋白質變性，抑制核酸酶的活性。利用苯酚處理后，離心分層，DNA溶于上層水相，蛋白質變性存在于酚層中，這時可用分液漏斗或吸管等儀器將二者分開。教師可以根據學校的條件讓學生自己設計實驗方案，比較實驗結果。 5．DNA的鑒定 二苯胺法二苯胺試劑的配制及鑒定DNA的方法參見教科書。需要注意的是，二苯胺試劑在冰箱內可保存6個月，使用前需搖勻。 紫外燈照射法用蒸餾水配制質量分數為0.05%的溴化乙錠(EB)溶液，將玻璃棒上纏繞的白色絮狀物抹到蠟紙上，再滴1滴EB溶液染色。將蠟紙放在紫外燈(260 nm)下照射(暗室中)，可呈現橙紅色的螢光(DNA的紫外吸收高峰在260 nm處)。 電泳法此方法適合鑒定純度較高的DNA。有條件的學?？梢詤⒖急緦ｎ}課題2的實驗案例和參考資料部分。 案例二 以菜花為實驗材料進行DNA的粗提取 課前準備 將新鮮菜花和體積分數為95％的乙醇溶液放入冰箱冷凍室24 h。 提取DNA的具體步驟 1.取材 稱取30 g菜花，去梗取花，切碎。 2.研磨 將碎菜花放入研缽中，倒入10 mL研磨液，充分研磨10 min。 研磨液的配制方法如下。將10.1 g Tris加入到50 mL蒸餾水中，使其溶解，然后，用2 moL/L的HCl溶液調節(jié)pH至8.0，再加入8.76 g NaCl 、37.2 g EDTA 、20 g SDS。待上述藥品全部溶解后，再用蒸餾水定容至1 000 mL。 教材中建議采用洗發(fā)香波、洗滌劑等一些去污劑，使植物細胞膜破碎，釋放DNA。學生可以設置對照實驗，比較哪一種方法可以提取到純度更高的DNA。一般實驗室提取高純度的DNA都采用一種陽離子去污劑──十六烷三甲基溴化銨分離緩沖液，使細胞膜破碎，同時將DNA與植物中多糖等雜質分開，再用氯仿—異丙醇混合液（體積比為24∶1）抽提去除雜質蛋白，得到高純度的DNA。 3.過濾 在漏斗中墊上尼龍紗布，將菜花研磨液過濾到燒杯中(有條件的學?？蓪V液倒入塑料離心管中進行離心，用1000 r/min的轉速，離心2～5 min，取上清液放入燒杯中)。在4 ℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。 4.沉淀 將一倍體積的上清液倒入兩倍體積的體積分數為95％的預冷乙醇溶液中，并用玻璃棒緩緩、輕輕地攪拌溶液(玻璃棒不要直插到燒杯底部)。沉淀3～5 min后，可見白色的DNA絮狀物出現。用玻璃棒緩緩旋轉，將絮狀物纏繞在玻璃棒上。 課題成果評價 （一）是否提取出了DNA 觀察你提取的DNA顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質較多；二苯胺鑒定出現藍色說明實驗基本成功，如果不呈現藍色，可能所提取的DNA含量低，或是實驗操作中出現錯誤，需要重新制備。 （二）分析DNA中的雜質 本實驗提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質。 （三）不同實驗方法的比較 對于不同的實驗方法，本課題可以采用分組的方法進行研究。首先選取不同的實驗材料，其次同種材料還可以采用不同方法，從多方面比較實驗結果，如DNA的純度、DNA的顏色、二苯胺顯色的深淺等，看看哪種實驗材料、哪種提取方法的效果更好。 答案和提示 （一）旁欄思考題 1．為什么加入蒸餾水能使雞血細胞破裂？ 答：蒸餾水對于雞血細胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進入血細胞內，使血細胞脹裂，再加上攪拌的機械作用，就加速了雞血細胞的破裂(細胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA。 2．加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？ 答：洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細胞膜，有利于DNA的釋放；食鹽的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。 3．如果研磨不充分，會對實驗結果產生怎樣的影響？ 答：研磨不充分會使細胞核內的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實驗結果，導致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍色等。 4．此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細胞成分？ 答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質。 5．為什么反復地溶解與析出DNA，能夠去除雜質？ 答：用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質。因此，通過反復溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質。 6．方案二與方案三的原理有什么不同？ 答：方案二是利用蛋白酶分解雜質蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質分開；方案三利用的是DNA和蛋白質對高溫耐受性的不同，從而使蛋白質變性，與DNA分離。 （二）練習 1．答：提取DNA的第一步是材料的選取，其目的是一定要選取DNA含量較高的生物材料，否則會由于實驗過程中或多或少的損失而造成檢測的困難；第二步是DNA的釋放和溶解，這一步是實驗成功與否的關鍵，要盡可能使細胞內的DNA全部溶解；第三步是DNA的純化，即根據DNA的溶解特性、對酶及高溫的耐受性的不同等特性，最大限度地將DNA與雜質分開；最后一步是對DNA進行鑒定，這是對整個實驗的結果的檢測。 2．答：提取蛋白質比提取DNA的難度大。這是因為，與DNA相比，蛋白質對溫度、鹽濃度、pH等條件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白質的空間結構多種多樣，理化性質各不相同，使得蛋白質的提取沒有一種統一的方法，只能根據特定蛋白質的特性摸索提取的條件，設計特定的方法。 課題2 多聚酶鏈式反應擴增DNA片段 實驗案例 PCR擴增雙歧桿菌編碼16SrRNA的DNA片段 1.雙歧桿菌的培養(yǎng)。本實驗用雙歧桿菌作為實驗材料，需要在實驗前一天培養(yǎng)雙歧桿菌。雙歧桿菌的培養(yǎng)基配方如下。 大豆蛋白胨5.0 g 胰胨5.0 g 酵母提取物10 g 葡萄糖10 g 微量鹽溶液40 mL 半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g 0.1%（0.1 g/100 mL）刃天青 1 mL 將上述物質溶解后，用蒸餾水定容至1 000 mL，調節(jié)pH至7.0。 其中，微量鹽溶液的配方如下。 CaCl2 0.2 g MgSO47H2O 0.48 g K2HPO4 1 g KH2PO4 1 g NaHCO3 10 g NaCl 2 g 培養(yǎng)雙歧桿菌24 h后，將菌液進行離心，雙歧桿菌將沉淀在試管底部。 2．PCR操作。往雙歧桿菌的沉淀中加入0.2 mL裂解液（裂解液配方為50 mmol/ L 的Tris-HCl , 0.5 %的Tween 20, 1 mg/ mL的蛋白酶K，pH為8.0），使細胞裂解，釋放出DNA。將裂解液在55 ℃溫度下加熱孵育3 h后，再在95 ℃溫度下加熱10 min，然后立即放入冰水中冷卻。冷卻后離心，將10 μL上清液轉移到0.5 mL的離心管中，然后依次加入10倍濃縮的擴增緩沖液5 μL、25 mmol/ L 的MgCl2溶液3 μL，20 mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液1 μL，Taq DNA聚合酶1 μL(2U/μL)，蒸餾水29 μL，兩種引物(25 μmol/ L) 各0.5 μL?；靹蚝蟀唇炭茣砀裰械臄祿O定PCR程序，進行反應。 需要說明的是，進行本實驗可以直接購買試劑盒，試劑盒的價格比單獨購買試劑的價格要低，并且包括了PCR所需的所有試劑。但是，試劑盒上往往只標出了試劑號，而沒有標明試劑的名稱，因此購買時要進行詳細的咨詢。如果單獨購買試劑，PCR所需的引物必須委托相關的試劑公司來合成，合成后必須低溫保存，否則引物容易發(fā)生降解。本實驗所用引物的堿基序列如下。 引物I 5′GGATTCTGGCTCAGGATGAACGG 3′ 引物II 5′CCGGGTGCTICCCACTTTCATGG 3′( I 代表堿基次黃嘌呤, 它可以與A、G、C、T中的任何1個堿基配對)。 3．PCR產物的檢測。產物的檢測除了可以采用教科書中提供的方法外，還可以采用瓊脂糖凝膠電泳的方法。瓊脂糖凝膠電泳的有關介紹可參見本專題中課題3《血紅蛋白的提取和分離》以及本課題的參考資料，具體操作步驟如下。 （1）用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈，放在水平桌面上，并架好梳子。 （2）配制濃度為1%（1 g/100 mL）的瓊脂糖凝膠。在錐形瓶中，稱取一定量的瓊脂糖粉，加入適量蒸餾水，在微波爐內加熱，使瓊脂糖粉熔化，然后冷卻至60 ℃，倒入電泳槽中，待其凝固。 （3）配制0.5倍的TBE電泳緩沖液100 mL。配制方法見本課題的參考資料部分。 （4）向電泳槽中緩緩倒入配制好的電泳緩沖液，以沒過膠面2 mm為宜。小心移去梳子，注意不要破壞加樣孔。如果樣品孔內有氣泡，應設法除去。 （5）在DNA樣品中加入相當于樣品0.2倍體積的載樣緩沖液（載樣緩沖液的成分參見本課題中參考資料），混勻后，加入樣品孔內。 （6）接通電源。一般紅色代表正極，黑色代表負極。DNA樣品是由負極向正極移動，因此要保證靠近加樣孔一端的電極為負極。電壓為1～50 V/cm(長度以兩個電極之間的距離計算)。 （7）當指示劑移動到凝膠邊緣時，斷開電源，終止電泳。一般200～400個核苷酸長度的PCR產物，在50 V電壓下，電泳20～40 min即可。 （8）將凝膠放入溴化乙錠溶液中染色后，在紫外儀上觀察電泳帶及其位置，判斷擴增產物的情況。 課題成果評價 DNA片段的擴增是否成功 檢測DNA片段的擴增情況，既可以采用教科書中提供的方法，也可以采用教師用書中實驗案例提供的方法。對于教科書中的方法，可以通過計算DNA含量來評價擴增的效果；對于電泳檢測的方法，可以通過在紫外線下直接觀察DNA帶的分布及粗細程度來評價擴增的效果。如果擴增不成功，則要分析失敗原因?？赡艿脑蛴校郝┘恿薖CR的反應成分，各反應成分的用量不當，PCR程序設置不當等。 答案和提示 練習 1.提示：繪圖可參考教科書中圖5-9。PCR反應中的目的片段一般以2n的方式積累，其中n為反應循環(huán)次數。一個DNA片段在30次循環(huán)后反應物中大約有10億個這樣的片段（2n=230=1 073 741 824)。 2.提示：PCR引物是根據需要擴增的目標DNA的堿基序列來設計的。引物的設計需要豐富的分子生物學實驗經驗，感興趣的學生可以參考《分子克隆實驗指南》（見本專題參考書目），書中有詳盡的論述。 課題3 血紅蛋白的提取和分離 課題成果評價 （一）是否完成對血液樣品的處理 觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教科書圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。 （二）凝膠色譜柱的裝填是否成功。 由于凝膠是一種半透明的介質，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質，例如藍色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。 （三）血紅蛋白的分離是否成功 如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關。 答案和提示 （一）旁欄思考題 你能從凝膠色譜的分離原理分析為什么凝膠的裝填要緊密、均勻嗎？ 答：凝膠實際上是一些微