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2012年度碩士論文答辯,論文題目：腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像學位申請人：羅冬梅專業(yè)名稱：光學研究方向：生物組織的二次諧波成像所在院系：生物光子學研究院導(dǎo)師姓名和職稱：金鷹副教授2012.06.04,contents,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,SHG于1961年首次被Franken發(fā)現(xiàn)：當兩個具有相同基頻的光子同時與具有非對稱結(jié)構(gòu)的樣品相互作用時，散射產(chǎn)生恰好雙倍于激發(fā)頻率的二次諧波光信號（半波長，雙倍能量）。,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,研究背景和內(nèi)容,實驗原理、裝置和流程,DNA樣品的SHG成像結(jié)果,討論,總結(jié)和展望,SHG成像特點對生物組織無光損傷和光致毒。SHG具有高度的方向性。無需外源性標定物即可實現(xiàn)成像。SHG顯微成像不受前向發(fā)射性質(zhì)的限制，可以與其它顯微成像裝置聯(lián)合成像，如TPEF、OCT等聯(lián)合使用，進行成像比較，實現(xiàn)信號互補。,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,SHG在生物學領(lǐng)域的應(yīng)用,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,研究內(nèi)容：利用TPEF/SHG光譜學成像技術(shù)對不同DNA樣品進行檢測，來獲取DNA樣品（基因組DNA溶液、細胞核提取物以及培養(yǎng)細胞的細胞核）的SHG信號并進行高解析度成像。在實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上通過對培養(yǎng)細胞添加少量的乙醇（體積比小于5%）可以得到SHG信號。在此基礎(chǔ)上，探討乙醇對DNA構(gòu)象的影響。,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,介質(zhì)在強激光作用下，電極化強度與入射輻射的場強E之間的關(guān)系可以表示為：P=(1)E+(2)E2+(3)E3(1)是介質(zhì)的一階線性極化率；(2)和(3)分別表示介質(zhì)的二階、三階非線性極化率；(2)E2正是二次諧波和雙光子熒光激發(fā)等二階非線性光學產(chǎn)生的根源。SHG的產(chǎn)生與介質(zhì)的二階非線性極化率的存在率有關(guān)，(2)不為零。(2)與材料本身的特性有關(guān)，它反映了分子的中心對稱性、介質(zhì)分子排列和取向等細微結(jié)構(gòu)。,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,研究背景和內(nèi)容,實驗原理、裝置和流程,DNA樣品的SHG成像結(jié)果,討論,總結(jié)和展望,二次諧波的產(chǎn)生條件：（1）非中心對稱結(jié)構(gòu)（2）相位匹配,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,相位匹配傳播中的基波和不斷產(chǎn)生的倍頻極化波之間保持相位一致，相互干涉，當相位完全匹配時產(chǎn)生的二次諧波輸出功率最大。實際上就是要求入射光與二次諧波倍頻光在介質(zhì)中的折射率相等（即傳播速度相同）。,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,鈦寶石飛秒激光器發(fā)出的超短脈沖激光通過聲光調(diào)制器后到達雙光子激光掃描顯微鏡作為激發(fā)光，經(jīng)過主二向色性光束分束器由油浸物鏡聚焦到樣品上，樣品在基頻光激發(fā)下產(chǎn)生背向二次諧波再經(jīng)油浸物鏡收集，經(jīng)過紅外光束濾色片濾除漫反射的基頻光后將激發(fā)光輸送到META探測，由探測器探測后轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘杺鬏斨劣嬎銠C。,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,人肝癌細胞系BEL-7420購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。,細胞傳代培養(yǎng),基因組DNA、細胞核的提取,SHG成像,培養(yǎng)腫瘤細胞提前一天接種于共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,基因組DNA溶液的發(fā)射光譜,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,研究背景和內(nèi)容,實驗原理、流程和裝置,DNA樣品的SHG成像結(jié)果,討論,總結(jié)和展望,細胞核提取物的成像與光譜,基因組DNA溶液的發(fā)射光譜,細胞核提取物的發(fā)射光譜,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,培養(yǎng)細胞的SHG/TPEF成像,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,結(jié)論：基因組DNA和細胞核提取物DNA均能產(chǎn)生SHG信號，且細胞核提取物的SHG/TPEF信噪比明顯高于基因組DNA的SHG/TPEF信號。常規(guī)狀態(tài)下幾乎觀測不到來自培養(yǎng)細胞的細胞核核區(qū)的SHG信號。通過在培養(yǎng)基中添加少量無水乙醇（體積比小于5%），可以在培養(yǎng)細胞的細胞核區(qū)域檢測到SHG信號。,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,DNA產(chǎn)生二次諧波的原因：（1）DNA由核苷酸分子構(gòu)成，核苷酸是手性分子，滿足非中心對稱結(jié)構(gòu)；（2）DNA的反向平行的雙螺旋結(jié)構(gòu)在一定的電場激發(fā)下，能夠?qū)崿F(xiàn)相位匹配，滿足產(chǎn)生SHG的產(chǎn)生條件。,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,研究背景和內(nèi)容,實驗原理、流程和裝置,DNA樣品的SHG成像結(jié)果,討論,總結(jié)和展望,在真核細胞中，DNA以非常致密的形式存在于細胞核中；基因組DNA是以線性雙鏈的形態(tài)的存在于溶液中，DNA致密程度遠低于細胞核DNA。,基因組DNA的SHG/TPEF信噪比低于細胞核DNA的原因：,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,在細胞中DNA主要以B型構(gòu)象存在，也包括Z型和A型構(gòu)象。,乙醇誘導(dǎo)DNA構(gòu)象發(fā)生改變對于添加酒精后培養(yǎng)細胞中出現(xiàn)SHG信號，我們推測是由于乙醇的加入改變了培養(yǎng)細胞DNA的分子構(gòu)象，導(dǎo)致DNA的某些光學特性發(fā)生了變化，從而引起SHG的產(chǎn)生。,DNA構(gòu)象影響因素：（1）溶劑極性；（2）介電常數(shù)；（3）粘度；（4）離子濃度,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,當加入乙醇到DNA溶液中，使得溶液中水活性降低，致使結(jié)合到DNA上的水分子數(shù)減少，原來被水分子支撐而伸展的DNA溝槽收縮，大溝槽變得更窄更深，小溝槽變得更寬更淺，使得DNA整體外形變得更短，從而導(dǎo)致DNA構(gòu)象由B型向A型轉(zhuǎn)變，這種轉(zhuǎn)變將改變雙螺旋結(jié)構(gòu)中大溝槽和小溝槽的氫鍵類型。,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,DNA隨著乙醇濃度的增大穩(wěn)定性會降低，推測當加入乙醇到培養(yǎng)的細胞中，乙醇小分子會通過核孔進入到細胞核內(nèi)，致使DNA的穩(wěn)定性降低從而使DNA與蛋白質(zhì)的結(jié)合松散，使雙鏈處于較松散的狀態(tài)，有利于DNA與RNA結(jié)合致使構(gòu)象發(fā)生改變。,松散狀態(tài)的DNA,DNA與RNA結(jié)合,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,反射式背向二次諧波信號強度由以下公式?jīng)Q定：,由上式可知二次諧波信號強度與介質(zhì)的二階非線性極化率有關(guān)。,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,二階非線性極化率又與材料本身的特性有關(guān)：它反映了介質(zhì)分子的中心對稱性、介質(zhì)分子排列和取向等細微結(jié)構(gòu)。推測有可能乙醇的加入造成的DNA構(gòu)象的轉(zhuǎn)變使得DNA分子的二階非線性極化率(2)發(fā)生變化，繼而導(dǎo)致介質(zhì)的二次諧波加強，實驗結(jié)果再次說明了二次諧波對生物組織的微觀結(jié)構(gòu)的變化極其敏感。,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,在活細胞中，由于細胞本身不滿足非中心對稱結(jié)構(gòu)，每個核苷酸分子產(chǎn)生的二次諧波相互疊加抵消使得我們在實驗中并未觀測到SHG的產(chǎn)生。當加入乙醇分子后，DNA分子表面的電荷特性發(fā)生改變以及分子的螺旋構(gòu)象形態(tài)發(fā)生改變，使得每個分子在同樣入射光的的激發(fā)下所產(chǎn)生的超極化強度與之前相比發(fā)生改變，在我們觀察的生物組織區(qū)域內(nèi)，所有的二次諧波相位一致而相互干涉加強，滿足相位匹配原理，使得我們在加入乙醇后觀察到了SHG。,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,由此，反推基因組DNA和細胞核提取物中SHG的產(chǎn)生，由于在提取這兩種物質(zhì)的過程中添加了乙醇，乙醇的加入也會影響DNA的構(gòu)象，對二次諧波的產(chǎn)生和增強造成一定的影響。,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,總結(jié)：本論文圍繞光學非線性成像技術(shù)在生物組織成像中的應(yīng)用進行展開，討論了基于DNA樣品的二次諧波（SHG）的非線性光學成像，探討了乙醇對DNA光學特性的影響。有助于進一步理解生物組織中DNA二次諧波效應(yīng)的產(chǎn)生機制及其影響因素，對進一步獲取生物組織DNA的細微結(jié)構(gòu)信息，拓寬其在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義和參考價值。,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,研究背景和內(nèi)容,實驗原理、流程和裝置,DNA樣品的SHG成像結(jié)果,討論,總結(jié)和展望,不足與展望：（1）乙醇對DNA二次諧波成像的影響只是做了定性的研究，未來還可以考慮定量方面的研究。（2）還可以考慮其它的化學試劑（如十二烷基硫酸鈉：SDS，乙二胺四乙酸二鈉鹽：EDTA等）對DNA非線性光學特性產(chǎn)生影響，并進行相關(guān)的研究。,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,致謝,本論文是在導(dǎo)師金鷹老師的細心指導(dǎo)和幫助下完成的。在此，我向金鷹老師表示衷心的感謝，感謝他三年來在我的科研、學習和生活上的指導(dǎo)、關(guān)心與幫助！感謝鄧小元老師的幫助與支持，感謝光子中醫(yī)實驗室的其他各位老師對我學習和研究上很多有益的幫助和鼓勵。感謝光子中醫(yī)實驗室的各位同學在我的實驗相關(guān)工作中的關(guān)心與幫助。感謝國家自然科學基金項目/科學部主任基金項目（30940020）對本課題的資助和支持！感謝我的父母及家人在我三年碩士期間對我的長期支持與鼓勵！最后，衷心地感謝各位答辯老師能夠在百忙之中參與我的答辯！,腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像,研究生期間發(fā)表的論文,1、羅冬梅、金鷹等，“腫瘤細胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學成像”光譜學與光譜分析，2012；2、羅冬梅，金鷹等，“人類基因組非冗余Exon/Intron數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建”華南師范大學學報，2010；3、羅冬梅，金鷹等，“腫瘤基因組研究進展”激光生物學報，2009。,ThankYou!,