《DNA的粗提取與鑒定》教案

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1、優(yōu)選精品文檔 共享共進(jìn)共贏 DNA勺粗提取與鑒定 【考試說(shuō)明要求】 1 .制備和應(yīng)用固定化酶(A) 2 .酵母細(xì)胞的固定化(B) 【課堂活動(dòng)】 [基礎(chǔ)回顧] 一、實(shí)驗(yàn)原理 1. DNA的溶解性 DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同,利用這一特點(diǎn),選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度 (如2mol/L)就能使DNA充分溶解,而使雜質(zhì)沉淀,或者相反(DNA在濃度為0.14mol/L的NaCl溶液中,溶解應(yīng)最小),以達(dá)到分離目的。 此外,DNA不溶于酒精溶液,但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。利用這一原理,可以將DNA與 蛋白質(zhì)進(jìn)一步的分離。 2. DNA對(duì)酶、高溫

2、和洗滌劑的耐受性 蛋白酶能水解蛋白質(zhì),但是對(duì)DNA沒(méi)有影響。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60—80°C的高溫,而DNA在 80oC以上才會(huì)變性。洗滌劑能夠瓦解細(xì)胞膜,但對(duì)DNA沒(méi)有影響。 3. DNA的鑒定 在沸水浴條件下,DNA遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色,因此二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。 二、實(shí)驗(yàn)材料的選取 凡是含有DNA的生物材料都可以考慮,但是使用DNA含量相對(duì)較高的生物組織,成功的可能性更大,如皿(原因:DNA含量豐富,材料易得,雞血細(xì)胞吸水易脹破)。若用動(dòng)物組織如豬肝,則需研磨。 三、過(guò)程 1 .破碎細(xì)胞,獲取含DNA的濾液 動(dòng)物細(xì)胞的破碎比較容易,以雞血細(xì)胞為例,在雞血細(xì)胞

3、液中加入一定量的蒸儲(chǔ)水,同時(shí)用玻璃棒攪 拌,過(guò)濾后收集濾液即可。如果實(shí)驗(yàn)材料是植物細(xì)胞,需要先用洗滌劑溶解細(xì)胞膜。例如,提取洋蔥的DNA時(shí),在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽行充分的攪拌和研磨,過(guò)濾后收集研磨液。 注息: ①為什么加入蒸儲(chǔ)水能使雞血細(xì)胞破裂? 蒸儲(chǔ)水對(duì)于雞血細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種低滲液體,水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi),使血細(xì)胞脹裂,再加上攪拌的機(jī)械作用,就加速了雞血細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂),從而釋放出DNA ②加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么? 洗滌劑是一些離子去污劑,能溶解細(xì)胞膜,有利于DNA的釋放;食鹽的主要成分是NaCl,有利于DNA 的溶解。 ③如果研磨不

4、充分,會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響? 研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放不完全,提取的DNA量變少,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,導(dǎo)致看不到絲狀沉 淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。 ④此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分? 可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)。 2 .去除濾液中的雜質(zhì) 方案一的原理是DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同;方案二的原理是蛋白酶分解蛋白質(zhì),不分 解DNA;方案三的原理是蛋白質(zhì)和DNA的變性溫度不同。 注息: ①為什么反復(fù)地溶解與析出DNA,能夠去除雜質(zhì)? 用高鹽濃度的溶液溶解DNA能除去在高鹽中不能溶解白雜質(zhì);用低鹽濃度使DNA析出,能除去溶解 在低鹽溶液

5、中的雜質(zhì)。因此,通過(guò)反復(fù)溶解與析出DNA就能夠除去與DN夠解度不同的多種雜質(zhì)。 ②方案二與方案三的原理有什么不同? 方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白,從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開(kāi);方案三利用的是DN府口蛋白質(zhì) 對(duì)高溫耐受性的不同,從而使蛋白質(zhì)變性,與DNA^離(60?75C的恒溫水浴保溫10?15min)。 3 .DNA的析出與鑒定 將處理后的溶液過(guò)濾,加入與濾液體積出皂、冷卻的酒精溶液,靜置2?3min,溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絲 狀物,這就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌,卷起絲狀物,并用濾紙吸取上面的水分。 取兩支20ml的試管,各加入物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液

6、5ml,將絲狀物放入其中一支試管 中,用玻璃棒攪拌,使絲狀物溶解。然后,向兩支試管前%加入4ml的二苯胺試劑?;旌暇鶆蚝?,將試管置于其生中加熱5min,待試管冷卻后,比較兩支試管溶液顏色的變化,看看溶解有DNA的溶液是否變避。 四、五浦項(xiàng)一 1.以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí),每100ml血液中需要加入3g檸檬酸鈉防止血液凝固。 2,加入洗滌劑后,動(dòng)作要輕緩、柔和,否則容易產(chǎn)生大量的泡沫,不利于后續(xù)步驟地操作。加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí),動(dòng)作要輕緩,以免DNA分子的斷裂,導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。 3 .二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用,否則會(huì)影響鑒定的效果。 4 .DNA的溶解度與NaCl溶液濃度的

7、關(guān)系: 當(dāng)NaCl溶液濃度低于0.14mol/L時(shí),隨濃度的升高,DNA的溶解度降低;當(dāng)NaCl溶液濃度高于 0.14mol/L時(shí),隨濃度升高,DNA的溶解度升高。 5 .盛放雞血細(xì)胞液的容器,最好是塑料容器。雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的DNA,容易被玻璃容器吸附, 由于細(xì)胞內(nèi)DNA的含量本來(lái)就比較少,再被玻璃容器吸附去一部分,提取到的DNA就會(huì)更少。因此,實(shí) 驗(yàn)過(guò)程中最好使用塑料的燒杯和試管,這樣可以減少提取過(guò)程的DNA的損失。 [診斷檢測(cè)] 1 .下列圖示中能反映DNA溶解度與NaCl溶液濃度之間關(guān)系的是: NNCI 儂鑿 md/L) A、 OJ* ■ NC1 戢心

8、2 .在DNAg提取的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,得到白絲狀物主要成分就是DNA依據(jù)是 A.絲狀物易溶于2mol/L的氯化鈉溶液中 B.絲狀物溶解后,遇二苯胺(沸水?。┳兯{(lán)色 C.絲狀物能在約為O.14mol/L氯化鈉溶液中析出 D.加酒精可使溶解的絲狀物再被析出 3 .在“DNA勺粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)中,向5mL血細(xì)胞液中加入20mL蒸儲(chǔ)水的目的是 A.使血細(xì)胞破裂B.防止血液凝固C.析出DNAD.使蛋白質(zhì)與DN的離 4 .在NaCl溶液中反復(fù)溶解、析出并過(guò)濾,就能除去DNA容液中的雜質(zhì)的理由不包括() A.用高濃度鹽溶液溶解DNA能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì) B.用低濃度鹽溶液使DNAW出

9、,能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì) C.反復(fù)操作就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì) D.反復(fù)操作就能夠使各種雜質(zhì)變性而沉淀析出 [典例引路] 在采用雞血為材料對(duì)DNA進(jìn)行粗提取的實(shí)驗(yàn)中,如果需要進(jìn)一步提取雜質(zhì)較少的DNA可以依據(jù)的原理是 () A.在物質(zhì)的量濃度為0.14mol/L的氯化鈉溶液中DNA的溶解度最小 B.DNA遇二苯胺在沸水浴的條件下會(huì)變成藍(lán)色 C.DNA不溶于酒精而細(xì)胞中的一些物質(zhì)易溶于酒精 D.質(zhì)量濃度為0.1g/mL的檸檬酸鈉溶液具有抗凝血作用 有關(guān)DNA粗提取的操作,錯(cuò)誤的是 A.向溶解DNA的燒杯中加蒸儲(chǔ)水的目的是漂洗DNA 8. DNA和雜質(zhì)分

10、子在95%的冷酒精中溶解度存在差異 C.提取植物細(xì)胞DNA時(shí)需在研缽中加入洗滌劑和氯化鈉等試劑 步驟 具體措施 分析 選材、制備 雞血細(xì)胞液 雞血+擰檬酸鈉 用離心機(jī)離心,再放 冰箱內(nèi)靜置 雞血紅細(xì)胞,白細(xì)胞都具 行細(xì)胞核.含大垃DNA] 檸檬酸鈉f抗凝劑)使血 液分層,血細(xì)胞處于底部 提取血細(xì) 胞核物質(zhì) ①雞血細(xì)胞液+蒸 摘水,快速沿一個(gè)方 向攪拌Emm ②紗布過(guò)濾 ①血細(xì)胞吸水漲破.快速 攪抻加速血細(xì)胞破裂 ②過(guò)濾得到佟染色質(zhì)的 謔液.送出細(xì)胞膜、細(xì)胞 器等破碎結(jié)構(gòu) 溶解 BNA ①注液+ ZhmW'L的 Nj心溶液10ml j(攪拌) ②紗布過(guò)濾不溶雜

11、質(zhì) 高鹽溶液溶解DNA,去 除不溶于高鹽溶液的雜 質(zhì) 折出含 DNA的 黏稠物 溶液十蒸儲(chǔ)水.輕輕 攬抨,析出絲狀物(直. 至小內(nèi)增加為止) NCI溶液相當(dāng)于被稀稀到 Ql lrmL'L,這一濃度 F IJNA 的溶解度最低而析出 過(guò)濾 多層紗布過(guò)濾 得到含DNA的茹稠物 DNA黏稠 物再溶解 2 tn ol/L NaCl 溶 液 20mL+上述黏稠物 f溶解 高鹽溶液溶解DNA.再 次去除不溶于高鹽溶液 的雜質(zhì) 過(guò)渡 用2層紗布過(guò)濾 濾液中含DNA,去除不 溶雜質(zhì) 提取含雜質(zhì) 較少的IJNA 上述濾液+冷卻的 95 %酒精 50mL 析出DNA.去

12、除溶于 95%冷酒精的雜質(zhì) DNA鑒定 絲狀物十。.015mol/L NaCl 溶液 5mL + ML二聚胺,沸水浴 5mm對(duì)照組不加此 狀物 ①試管1和試管2的自 變量是有無(wú)絲狀物,因變 量為有無(wú)淺藍(lán)色出現(xiàn) ②0, 015 mol/L NaCl 溶 液溶解DNA D.提取動(dòng)物細(xì)胞 DNA時(shí)可用雞血與蒸儲(chǔ)水混合后用玻璃棒攪拌 [歸納總結(jié)] 1.雞血細(xì)胞的DNA提取 2 .實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵 ⑴取材不用哺乳動(dòng)物的血細(xì)胞(由于成熟紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核)。 (2)獲取DNA時(shí)要向雞血細(xì)胞液加入足量的蒸儲(chǔ)水,以便使細(xì)胞膜和核膜破裂,把核內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)。 (3)實(shí)驗(yàn)中的攪拌,除最后一次攪拌

13、 外,其余攪拌均要朝一個(gè)方向。并且,在析出DNA、DNA再溶解和提取中,各步驟攪拌都要輕緩,玻璃棒不要直插燒杯底部,防止DNA分子斷裂。 3 .此實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有幾次使用蒸儲(chǔ)水?幾次過(guò)濾,幾次析出,幾次攪拌? 答:整個(gè)實(shí)驗(yàn)共“兩次蒸儲(chǔ)水,三次 過(guò)濾,兩次析出” ①兩次蒸儲(chǔ)水 第一次:細(xì)胞吸水脹破 第二次:使DNA黏稠物析出 ②三次過(guò)濾 第一次:DNA存在于濾液里 第二次:DNA被留在紗布上 第三次:DNA存在于濾液里 過(guò)濾時(shí)使用的紗布層數(shù)與需用濾液或黏稠物有關(guān),第二次要用其濾出的黏稠物有關(guān),所以要使用多層紗布, 第一次和第三次均要用其濾液,使用 的紗布為1—2層 ③兩

14、次析出 第一次:用0.14mol/L的NaCl溶液,含雜質(zhì)多 第二次:用冷卻的95%的酒精 4 .預(yù)冷的酒精溶液具有的優(yōu)點(diǎn) ①抑制核酸水解酶活性,防止DNA 降解。 ②降低分子運(yùn)動(dòng)易于形成沉淀析出。 ③低溫有利于增加DNA分子柔韌 性,減少斷裂。 5 .評(píng)價(jià):觀察彳提取的DNA1色,如果不是白色絲狀物,說(shuō)明DNA中的雜質(zhì)較多;二苯胺鑒定出現(xiàn)藍(lán)色說(shuō) 明實(shí)驗(yàn)基本成功,如果不呈現(xiàn)藍(lán)色,可能所提取的DNA含量低,或是實(shí)驗(yàn)操作中出現(xiàn)錯(cuò)誤,需要重新制備 本實(shí)驗(yàn)提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質(zhì) 6 .酒精的使用 ①觀察花生種子子葉細(xì)胞脂肪顆粒時(shí),用體積分?jǐn)?shù)為50%

15、的酒精洗去浮色 ②葉綠體色素的提取和分離實(shí)驗(yàn)中,用無(wú)水酒精作有機(jī)溶劑提取色素 ③制作洋蔥根尖細(xì)胞裝片時(shí),用鹽酸和酒精的混和液對(duì)根尖進(jìn)行解離 ④DNA粗提取過(guò)程中,用體積分?jǐn)?shù)為95%的冷卻酒精可以進(jìn)一步純化DNA ⑤70%勺酒精用于消毒,如果酒的制作 [變式訓(xùn)練] (多選)下列DNA粗提取的實(shí)驗(yàn)操作中,經(jīng)離心或過(guò)濾后取上清液或?yàn)V液的有 A.在新鮮雞血中加入適量的檸檬酸鈉,混合均勻后離心 B.在盛有血細(xì)胞的塑料燒杯中加蒸儲(chǔ)水,快速攪拌后過(guò)濾 C.在2mol/L的氯化鈉溶液中放入絲狀物,輕輕攪拌后過(guò)濾 D.在溶有DNA的氯化鈉溶液中緩緩加入蒸儲(chǔ)水,輕輕攪拌后過(guò)濾 [當(dāng)堂反饋]

16、 1 .下列關(guān)于DNA粗提取與鑒定的說(shuō)法中,正確的是 A.析出DNA時(shí)要緩慢地加蒸儲(chǔ)水,當(dāng)析出黏稠物時(shí)即不再加水 B.在探究洗滌劑對(duì)植物細(xì)胞DNA提取的影響實(shí)驗(yàn)中,自變量是洗滌劑和食鹽 C.提取的DNA溶解后加入二苯胺試劑即可染成藍(lán)色 D.將含有DNA的濾液放在60c?75c的恒溫水浴箱中保溫后過(guò)濾,能去除蛋白質(zhì)雜質(zhì) 2 .(多)"DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)中,將含有一定雜質(zhì)的DNA絲狀物分別放入體積為2mL 的四種溶液中,經(jīng)攪拌后過(guò)濾,獲得4種濾液,含DNA$少的是 1 蒸儲(chǔ)水中 攪拌后過(guò)濾 濾?夜E 2 2mol/L的NaCl溶液 攪拌后過(guò)濾 濾?夜F 3

17、O.14mol/L的NaCl溶液中 攪拌后過(guò)濾 濾?夜G 4 冷卻的95%的酒精溶液中 攪拌后過(guò)濾 濾?夜H A.濾液EB.濾液FC.濾液GD.濾液H 3 .在DNA勺粗提取與鑒定試驗(yàn)中,有兩次DNA勺沉淀析出,其依據(jù)的原理是 ①DNABNaCl的物質(zhì)的量的濃度為O.14mol/L時(shí),溶解度最低②DNAB冷卻的體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精中能沉淀析出 A.兩次都是①B.兩次都是② C.第一次是①,第二次是②D.第一次是②,第二次是① 4 .(多選)有關(guān)DNA?提取的操作,正確的是 A.盛放雞血細(xì)胞液的容器最好是塑料容器 B.將雞血細(xì)胞液與蒸儲(chǔ)水混合,用玻璃棒沿一個(gè)方向快速

18、攪拌,釋放DNA C.向溶解DNA勺燒杯中加蒸儲(chǔ)水的目的是漂洗DNA D.用漏斗和濾紙過(guò)濾析出的DNA得到DNA占稠物 5.在《DNA粗提取》實(shí)驗(yàn)中,為得到含DNA的黏稠物,某同學(xué)進(jìn)行了如下操作: ①在新鮮雞血中加入適量的檸檬酸鈉,經(jīng)離心后,除去血漿留下血細(xì)胞備用。 ②取5—10mL血細(xì)胞放入50mL的塑料燒杯中,并立即注入20mid.015mol/L的氯化鈉溶液,快速攪拌5min后經(jīng)濾紙過(guò)濾,取得其濾液。 ③濾液中加人40mL2mol/L的氯化鈉溶液,并用玻璃棒一個(gè)方向快速攪拌lmin。 ④上述溶液中緩緩加人蒸儲(chǔ)水,同時(shí)用玻璃棒沿一個(gè)方向不停地輕輕攪拌,同時(shí)加蒸儲(chǔ)水,直到溶液中

19、出 現(xiàn)絲狀物為止,再進(jìn)行過(guò)濾而得到含DNA的黏稠物。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果是:所得含DNA的黏稠物極少,導(dǎo)致下一步實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行。 請(qǐng)指出并改正該同學(xué)的實(shí)驗(yàn)操作上的三個(gè)錯(cuò)誤:(3分) (標(biāo)明濃度);提取含雜質(zhì)較少的 DNA的 (2分) DNA ,而用動(dòng)物的肝臟組織作為 (2)按正確操作提取和過(guò)濾黏稠物后,再溶解黏稠物所用的溶劑為 方法是。 (3)鑒定DNA的試劑是試劑,DNA鑒定時(shí)對(duì)照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置方法為。 (4)采用?;蜓虻难鹤鰧?shí)驗(yàn),取材方便,但即使正確操作也無(wú)法提取到實(shí)驗(yàn)材料,實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好,原因是,實(shí)驗(yàn)中最好增加一步驟為。 (10分)(1)0.015mol/L的氯化鈉溶液應(yīng)改為蒸儲(chǔ)水

20、;濾紙應(yīng)改為紗布;直到溶液中出現(xiàn)絲狀物為止應(yīng)改 為直到溶液中絲狀物不再增加為止(每項(xiàng)1分) (2)2mol/L的NaCl溶液加入冷卻的、體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精 (3)二苯胺 向試管中只加0.015mol/L的NaCl溶液和二苯胺試劑,不加DNA,沸水浴 (4)哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞核研磨 ①提取雞血細(xì)胞的細(xì)胞核物質(zhì)將制備好的雞血細(xì)胞液5mL?10mL注入到50mL燒杯中。向燒杯中加入 蒸儲(chǔ)水20mL,同時(shí)用玻璃棒充分?jǐn)嚢?min,使血細(xì)胞加速破裂。然后,用放有紗布的漏斗將血細(xì)胞液過(guò)濾至500ml.取其濾液。 ②溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA各氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為2mol/L40m

21、L加入到濾液中,并用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌1min,使其混合均勻,這時(shí)DNA^溶液中呈溶解狀態(tài) ③析出含DNA的粘稠物沿?zé)瓋?nèi)壁緩緩加入蒸儲(chǔ)水,同時(shí)用玻璃棒不停地輕輕攪拌,這時(shí)燒杯中有絲狀物 出現(xiàn),注意觀察絲狀物呈什么顏色。繼續(xù)加入蒸儲(chǔ)水,溶液中出現(xiàn)的粘稠物會(huì)越來(lái)越多。當(dāng)粘稠物不再增加時(shí)停止加入蒸儲(chǔ)水(這時(shí)溶液中氯化鈉的物質(zhì)的量濃度相當(dāng)于0.14mol/L) ④濾取含DNA的粘稠物用放有多層紗布的漏斗,過(guò)濾步驟3中的溶液至500mL的燒杯中,含DNA的粘稠 物被留在紗布上 ⑤將DNA的粘稠物再溶解取1個(gè)50mL燒杯,向燒杯內(nèi)注入氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為2mol/L的溶液 20mL用鈍頭鐐子將紗布上的粘稠物夾至氯化鈉溶液中,用玻璃擇不停地?cái)嚢?,使粘稠物盡可能多地溶解于溶液中 ⑥過(guò)濾含有DNA的氯化鈉溶液取1個(gè)100mL燒杯,用放有兩層紗布的漏斗過(guò)濾步驟5中的溶液。取其濾 液,DNA溶于濾液中 ⑦提取含雜質(zhì)較少的DNA在上述濾過(guò)的溶液中,加入冷卻的、酒精的體積分?jǐn)?shù)為95%的溶液50mL(使用 冷卻的酒精,對(duì)DNA的凝集效果較佳),并用玻璃棒攪拌,溶液中會(huì)出現(xiàn)含雜質(zhì)較少的絲狀物。用玻璃棒將絲狀物卷起,并用濾紙吸取上面的水分。這種絲狀物的主要成分就是DNA ⑧DNA的鑒定 6 / 5

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