微生物誘變育種致遺傳物質損傷強度測定 umu法征求意見稿編制說明
《微生物誘變育種致遺傳物質損傷強度測定 umu法征求意見稿編制說明》由會員分享,可在線閱讀,更多相關《微生物誘變育種致遺傳物質損傷強度測定 umu法征求意見稿編制說明(13頁珍藏版)》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。
1《微生物誘變育種致遺傳物質損傷強度測定 umu 法》國家標準編制說明(征求意見稿)一、 任務來源本國家標準的制定任務列入國家標準化管理委員會 2017 年第三批國家標準制修訂計劃,項目編號“20171811-T-424 ”。該標準由由中國標準化研究院提出并歸口,由 清華大學等單位承擔該標準的制定任務。二、目的和意義基于 SOS 響應系統(tǒng)國內(nèi)外開發(fā)了多種環(huán)境毒性物質和致癌物質的快速定量檢測方法。這些方法的原理是致癌物質通常會引起 DNA 損傷,而細胞在發(fā)生 DNA 損傷時會誘導 SOS 系統(tǒng)響應。DNA 損傷程度越高,SOS 響應越強。將 SOS 系統(tǒng)調(diào)控基因與指示基因相融合,通過檢測指示基因編碼蛋白活性或信號強度,即可得到 SOS 基因的表達強度,表征 DNA 損傷強度和環(huán)境致癌物質濃度。具體方法有 SOS chromotest, ADP1_recA_lux, umu-test 等。其中 umu-test 因準確度高被廣泛采用。國際標準 ISO 13829-2000 用 umu-test 測定水及廢水的遺傳毒性。國內(nèi)還沒有類似標準出現(xiàn)。基于以上種種情況,我們建立了一種快速、可靠的 DNA 損傷檢測方法同時確立了一種類似標準。三、標準制訂原則1、標準編寫遵循 GB1.1-2009《標準化工作導則 第 1 部分:標準的結構和編寫規(guī)則》的有關要求。2、標準編寫內(nèi)容參考的相關標準,包括:GB/T 20001.4-2015 標準編寫規(guī)則 第 4 部分GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法;YY/T 0588-2005 流式細胞儀ISO 13829-2000 水質 用 UMU 試驗法測定水和廢水的遺傳毒性3、法律、法規(guī)及文件《中華人民共和國標準化法》《中華人民共和國標準化法實施條例》2《國家標準化體系建設發(fā)展規(guī)劃(2016—2020 年) 》《深化標準化工作改革方案》四、標準主要技術內(nèi)容本標準方法屬于生物技術范疇,主要用于微生物誘變育種致遺傳物質損傷強度測定,采用方法是 umu-test 和 FACS-umu-test 法。基于 umu-test 原理,選擇 β-半乳糖苷酶的熒光底物,并以碘化丙啶(PI)作為檢測死細胞的熒光染料,結合流式細胞儀,構建單個活細胞水平的胞內(nèi) DNA 損傷強度定量手段。本標準規(guī)定了微生物誘變育種的術語和定義、原理、測試微生物及傳代、儀器設備及器具、化學誘變、紫外或等離子體誘變、umu-test 測試、umu-test 檢測、umu-test 結果計算和表示、umu-test 精確度、umu-test 有效準則、umu-test 測試報告及 FACS-umu-test 測試程序。五、工作過程1、成立工作組《微生物誘變育種致遺傳物質損傷強度測定 umu 法》項目組 2016 年接到編制任務,開展資料收集、分析和試驗工作。 、2、調(diào)查研究工作首先研究了國際標準《ISO 13829-2000 水質 用 UMU 試驗法測定水和廢水的遺傳毒性》 (英文版) ,了解了國外 umu 試驗的相關要求。通過試驗證實了 FACS-umu-test方法中熒光底物的選擇、流式細胞儀測定胞內(nèi)熒光素含量的可行性;通過 FACS-umu-test 測試了不同誘變方法對活細胞的 DNA 損傷強度;比較了 FACS-umu-test 方法和ADP1_RecA_Lux 方法測定結果(。3、編寫過程說明為了使編制的標準能更好的適用微生物誘變育種致遺傳物質損傷強度測定,在2016 年 10 月提出了標準討論提綱,確定了編制原則和主要內(nèi)容。該標準于 2017 年 10月在全國標準信息公共服務平臺上進行公示,于 2019 年 2 月召開專家會,聽取專家意見。六、方法驗證及結果方法驗證 1:FACS-umu-test 試驗方法的建立驗證材料:熒光素-2-β-D-吡喃半乳糖苷溶液,氯化氫,c(HCl)=1mol/l,氫氧化鈉 c(NaOH)=1 mol/l,二甲基亞砜(DMSO),TGA 培養(yǎng)基,磷酸緩沖液 pH(7.0±0.2),3鄰硝基-β-D-半乳糖苷溶液,碘化丙啶溶液驗證過程:熒光底物的選擇:熒光素 2-β-D-吡喃半乳糖苷(Fluorescein di-beta-D-galactopyranoside, FDG)本身不具有熒光,其被 β-半乳糖苷酶水解后的產(chǎn)物熒光素具有熒光。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一種 DNA 熒光染料,只能進入失去細胞膜選擇通透性的細胞,即死細胞中,因此可以用于區(qū)分活死細胞。通過在 2 mM 的FDG 中,37 ℃水浴中處理 2 min,使得 FDG 快速、均一的進入每個細胞。進入細胞的FDG 被 β-半乳糖苷酶水解產(chǎn)生熒光素,在一定時間內(nèi)測定,熒光素的濃度和 β-半乳糖苷酶活性成正比。但是由于流式細胞儀只能測定胞內(nèi)的熒光物質,因此最主要的問題是如何保證產(chǎn)生的熒光素不泄露到胞外。前期研究表明,在 5 ℃下,熒光素的跨膜速率比 37 ℃降低 200 倍以上,而 β-半乳糖苷酶的反應速率只降低了 10 倍。為驗證低溫對防止熒光素泄露的作用,測定原始菌株和 ARTP 處理 1 min 的菌株在冰上反應和 37 ℃條件下反應,產(chǎn)生的熒光素的泄露程度。取反應不同時間兩種溫度條件下的菌液,利用 0.22 ?m 的過濾膜過濾菌體,利用熒光分光光度計測定胞外熒光素濃度。圖 1.在冰上和 37 ℃條件下胞外熒光素的濃度隨反應時間變化(n=3)驗證結果:如圖 1 顯示,冰上反應,在反應時間增加到 90 min 時,胞外的熒光素濃度仍保持在很低水平。而 37 ℃條件下反應,胞外熒光素濃度隨反應時間增加而不斷增大,說明隨熒光素在胞內(nèi)產(chǎn)生,不斷泄露到胞外。以上結果說明,冰上反應能有效的防止熒光素的泄露。方法驗證 2:流式細胞儀測定胞內(nèi)熒光素含量驗證過程:利用流式細胞儀測定胞內(nèi)熒光素含量,首先通過前向角散射光 FSC 和側向角散射光 SSC 圈出目標菌體。前向角散射光與細胞相對大小有關,前向角散射光4設為線性,前向角散射光太大,有可能是由于多個細胞粘連在一起,前向角散射光過小,有可能是細胞碎片或者雜質,因此都需要在測定中去除。設置 FSC 的閾值為100,以去除雜質的影響。通過畫門圈出目標細胞,以去除多細胞粘連對結果的影響,如圖 2 所示。對圈出細胞進行分析。首先只用 PI 染色,測定 FL-1 通道和 FL-3 通道的熒光值,在 FL-1 坐標軸上圈出 PI 染色細胞,其 FL-1 通道熒光值較低,作為 FL-1 通道背景值(圖 3a) 。 4圖 2 流式細胞儀目標細胞的劃定驗證結果:通過測定 FDG 染色的細胞,作為 FL-3 通道的背景值,即 PI 染色陰性細胞(圖 3b) 。對 FDG 和 PI 染色細胞進行測定,如圖 4 所示。測定結果分為 4 個區(qū)域,其中 R1 和 R2 為死細胞,R3 為熒光素熒光背景值,可能為雜質或不具有 β-半乳糖苷酶活性的細胞,予以扣除。R4 為目標細胞群,用于后續(xù)分析。如圖 4 所示,R4中的每一個點的橫坐標,即 FL-1 通道的熒光值,表示單個活細胞內(nèi),在反應 60 min后的相對熒光素熒光值。相對熒光素熒光值與體內(nèi)的 β-半乳糖苷酶活性成正比,β- 半乳糖苷酶活性表征了細胞的 SOS 誘導水平。利用流式細胞儀的 Cell Quest 分析可以得到突變庫所有活細胞的相對熒光素熒光值的平均值,而突變庫的 SOS 誘導系數(shù)定義為Fi。????=????/?????? 其中 Am 為突變庫中所有活細胞的平均相對熒光素熒光值,而 Amc 為原始細胞或5陰性對照的活細胞的平均相對熒光素熒光值。通過定義突變庫的 SOS 誘導系數(shù) Fi,可以對不同突變庫的 SOS 誘導水平進行比較。Fi 值越高表示突變庫的 DNA 損傷強度越大。6圖 3.3 流式細胞儀 FL1-H 和 FL3-H 陰性細胞的劃分FL1-HFL3-H圖 4.流式細胞儀測定結果(R1,R2 ,PI 陽性細胞,為死細胞;R3,熒光素陰性細胞,未表達 β-半乳糖苷酶活性;R4,目標細胞群,具有 β-半乳糖苷酶活性的活細胞)方法驗證 3:FACS-umu-test 定量檢測不同誘變方法對活細胞的 DNA 損傷強度驗證材料:熒光素-2-β-D-吡喃半乳糖苷溶液,氯化氫,c(HCl)=1mol/l,氫氧化鈉c(NaOH)=1 mol/l,二甲基亞砜(DMSO),TGA 培養(yǎng)基,磷酸緩沖液 pH(7.0±0.2),鄰硝基-β-D- 半乳糖苷溶液,碘化丙啶溶液方法驗證 2.1:定量表征 ARTP 對活細胞的 DNA 損傷強度7驗證過程:常壓室溫等離子體(Atmospheric and room temperature plasma,ARTP)作為一種新興的誘變手段,具有操作快速、簡單,安全,突變率高等優(yōu)勢,目前已經(jīng)被成功應用于包括細菌,真菌,藻類在內(nèi)超過 40 種微生物的誘變育種。用 FACS-umu-test 方法定量測定單位活細胞誘導系數(shù)隨 ARTP 誘變時間的變化。圖 2.1 ARTP 處理不同時間構建的突變庫的 SOS 誘導系數(shù)(n=3)驗證結果:不同 ARTP 處理所產(chǎn)生的 SOS 誘導系數(shù)測定結果顯示(圖 2.1) ,當ARTP 處理時間在 30 s 到 75 s 范圍內(nèi),隨著 ARTP 處理時間的增長,突變庫的 SOS 誘導水平增加,即突變庫中活細胞的胞內(nèi) DNA 損傷強度增大。當 ARTP 處理時間超過75 s 時,繼續(xù)增大 ARTP 處理時間,突變庫的 SOS 誘導水平增加并不明顯,SOS 誘導系數(shù)的最大值為 2.79 ± 0.15。方法驗證:2.2 定量檢測 UV 對活細胞的 DNA 損傷強度驗證過程:UV 照射可以造成多種 DNA 損傷,包括 DNA 與蛋白質的交聯(lián),氧化性 DNA 損傷以及單鏈的 DNA 斷裂損傷。FACS umu test 方法測定了 UV 照射不同時間對活細胞的 DNA 損傷強度變化,結果如圖 2.2 所示。8圖 2.2 UV 照射不同時間的 SOS 誘導系數(shù)(n=3)驗證結果:隨 UV 照射時間的增加,活細胞的 SOS 誘導系數(shù)增大,UV 造成的DNA 損傷強度增加。但 UV 構成的突變庫的 SOS 誘導系數(shù)同樣存在最大值。在 UV 照射 13 min 時 SOS 誘導系數(shù)最大,為 1.66±0.11,明顯低于 ARTP 的最大 SOS 誘導系數(shù)。超過該照射時間,SOS 誘導系數(shù)不再增大,說明活細胞對 UV 造成的 DNA 損傷同樣存在容忍極限。方法驗證 2.3:定量檢測 4-NQO 對活細胞的 DNA 損傷強度驗證過程:4-硝基喹啉-1-氧化物(4-Nitroquinoline-N-Oxide,4-NQO)的代謝物為4-乙酰氨基喹啉-1-氧化物,該物質可以共價加合到脫氧鳥苷酸的 C8 位和 N2 位,以及脫氧腺苷酸的 N6 位從而形成 DNA 共價加合物。另外 4-NQO 同樣能造成 DNA 的氧化損傷,或者造成 DNA 單鏈斷裂。利用基于 FACS unu-test 法定量測定了不同 4-NQO 處理劑量對 DNA 的損傷強度,如圖 2.3 所示。9圖 2.3 不同 4-NQO 劑量的 SOS 誘導系數(shù)(n=3)驗證結果:不同 4-NQO 處理劑量造成的 SOS 誘導系數(shù)變化趨勢與 ARTP,UV 相似。在低劑量下,隨劑量增加,SOS 誘導系數(shù)增大,當 4-NQO 處理劑量超過 0.8 μg/ml后,隨 4-NQO 濃度增加,SOS 誘導系數(shù)不再增大。4-NQO 的最大誘導系數(shù)為 1.50 ± 0.13。方法驗證 2.4:定量檢測 MNNG 對活細胞的 DNA 損傷強度驗證過程:N-甲基-N′- 硝基-N- 亞硝基胍(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG)主要造成 DNA 的甲基化損傷,可以使 DNA 上的所有氧原子和大部分的氮原子發(fā)生甲基化。最主要的甲基化產(chǎn)物為 N7 甲基鳥嘌呤,甲基磷酸三酯, O6 甲基鳥嘌呤和 N3 甲基腺嘌呤。MNNG 不直接造成 DNA 的斷裂損傷,但通過堿基切除修復和核苷酸切除修復會造成 DNA 的鏈斷裂。利用基于 FACS-unu-test 法定量測定了不同 MNNG誘變劑濃度對單個活細胞的 DNA 損傷強度(圖 2.4) 。10圖 B.4 不同 MNNG 劑量的 SOS 誘導系數(shù)(n=3)驗證結果:如圖 2.4 所示,隨 MNNG 濃度的增加,SOS 誘導系數(shù)呈現(xiàn)了與前三種誘變方法相同的趨勢。MNNG 造成 DNA 損傷引起的最大 SOS 誘導系數(shù)值為 1.58 ± 0.07。驗證結果 2.5:不同誘變方法的活細胞內(nèi) DNA 損傷的比較驗證過程:通過測定 ARTP,紫外照射,兩種常用化學誘變劑 4-NQO 和 MNNG的 SOS 誘導系數(shù),可以看出不同誘變劑量下引起的 SOS 誘導系數(shù)均存在最大值,達到該最大值后繼續(xù)增加誘變劑量,SOS 誘導系數(shù)不再增加。對于不同的誘變方法,SOS誘導系數(shù)的最大值也不同,ARTP 的最大 SOS 誘導系數(shù)高于其他三種誘變方法(圖 2.5)。11圖 2.5 不同誘變方法的最大 SOS 誘導系數(shù)(n=3)驗證結果:將對照樣品的平均胞內(nèi)熒光素相對熒光強度設為標準值,統(tǒng)計了各種突變方法在最大 SOS 誘導系數(shù)的誘變劑量下,構成的突變庫中相對熒光強度高于該標準值的細胞的比例。ARTP,UV,4-NQO 和 MNNG 四種誘變方法分別為 35%, 26%, 17%,和 16.5%。 方法驗證 3.:FACS-umu-test 方法與 ADP1_RecA_Lux 方法測定結果的比較驗證材料:熒光素-2-β-D-吡喃半乳糖苷溶液,氯化氫,c(HCl)=1mol/l,氫氧化鈉 c(NaOH)=1 mol/l,二甲基亞砜(DMSO),TGA 培養(yǎng)基,磷酸緩沖液 pH(7.0±0.2),鄰硝基-β-D-半乳糖苷溶液,碘化丙啶溶液驗證過程:ADP1_RecA_Lux 是一種常用的 DNA 毒性檢測方法,該檢測方法使用Acinetobacterbaylyi ADP1 作為模式菌株,來自 Photorhabdus luminescens 的生物發(fā)光基因 luxCDABE 作為報告基因,將其與 SOS 系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)基因 recA 進行融合,導入到Acinetobacterbaylyi ADP1 的基因組。當細胞發(fā)生 DNA 損傷時,誘導 SOS 系統(tǒng)的響應,recA 表達,其表達強度可以通過生物發(fā)光信號進行檢測。相對發(fā)光強度定義為光強度除以細胞的光密度(OD 600) ,誘導系數(shù) Fi 定義為樣品的相對發(fā)光強度除以沒有毒性處理的對照樣品的相對生物發(fā)光強度。將 ADP1_RecA_Lux 方法應用于檢測 ARTP 對DNA 的損傷強度。驗證結果:ADP1_RecA_Lux 方法對 ARTP 不同時間的 DNA 損傷結果顯示(圖3.1) ,在 ARTP 處理時間不高于 90 s 時,隨著處理時間的增長,樣品中總細胞的 SOS12誘導系數(shù)增加,ARTP 對 DNA 損傷強度增大。當 ARTP 處理時間增加到 105 s 時,樣品中總細胞的 SOS 誘導系數(shù)反而降低,而用流式細胞儀的測定結果顯示,ARTP 處理時間為 105 s 時,其對胞內(nèi) DNA 的損傷程度持續(xù)增高達到最大值。兩種測定方法結果的差異主要是由于采用流式細胞儀的方法,我們檢測的是突變庫中活細胞的 DNA 損傷,而 ADP1_RecA_Lux 方法我們檢測的是樣品中總細胞的DNA 損傷,包括活細胞和由于 ARTP 處理而造成死亡的細胞。這些死細胞在細胞密度測量時同樣有貢獻。當 ARTP 處理時間低于 90 s 時,ARTP 作用劑量較低,對菌體的致死率低,因此少量的死細胞對細胞密度測定結果影響不大。而當 ARTP 處理時間達到 105 s 時,ARTP 對細胞的致死率升高,大量的死細胞對細胞的光密度測定影響較大,而死細胞通常具有較低的發(fā)光強度,因此造成相對發(fā)光強度的下降,影響 SOS 誘導系數(shù)的測定結果。而基于 unu-test 的流式細胞儀測定方法,通過 PI 染色可以排除死細胞的影響。圖 3.1 ARTP 處理后 3 h 和 6h 用 ADP1_RecA_Lux 方法檢測 ARTP 處理不同時間的 SOS 誘導系數(shù)(n=3 )采用 ADP1_RecA_Lux 方法檢測得到的最大 SOS 誘導系數(shù)值為 1.49 ± 0.25,低于基于 unu-test 的流式細胞儀測定結果。這主要是由于 ADP1_RecA_Lux 方法中選用 recA作為 SOS 響應檢測基因, recA 編碼的蛋白作為 DNA 同源重組的重要相關蛋白,其在SOS 未誘導的菌體中具有較高的含量,導致 ADP1_RecA_Lux 測定方法的背景值較高。而隨著 ARTP 處理時間的增加,死細胞的增多導致相對發(fā)光強度的進一步降低,因此造成了采用 ADP1_RecA_Lux 方法測得的 SOS 誘導系數(shù)較流式細胞儀方法低。七、與有關的現(xiàn)行法律、法規(guī)和強制性國家標準的關系13本標準符合國家現(xiàn)行法律、法規(guī)、規(guī)章和強制性國家標準的要求。本標準的實施不涉及對現(xiàn)行標準的廢止情況。八、標準屬性的建議本標準為推薦性國家標準。九、貫徹國家標準的要求和措施建議標準發(fā)布實施后,建議由標準編制單位組織有關生產(chǎn)、檢驗、設計等單位進行宣傳貫徹。十、其他應予說明的事項無其他事項說明。- 配套講稿:
如PPT文件的首頁顯示word圖標,表示該PPT已包含配套word講稿。雙擊word圖標可打開word文檔。
- 特殊限制:
部分文檔作品中含有的國旗、國徽等圖片,僅作為作品整體效果示例展示,禁止商用。設計者僅對作品中獨創(chuàng)性部分享有著作權。
- 關 鍵 詞:
- 微生物 誘變 育種 遺傳物質 損傷 強度 測定 umu 征求意見 編制 說明
裝配圖網(wǎng)所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網(wǎng)友學習交流,未經(jīng)上傳用戶書面授權,請勿作他用。
鏈接地址:http://appdesigncorp.com/p-551468.html