DNA自身抗體的研究及其臨床應(yīng)用.ppt

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蘭小鵬簡(jiǎn)介1959 3出生 醫(yī)學(xué)博士 主任技師 教授 南京軍區(qū)福州總醫(yī)院全軍醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心副主任 檢驗(yàn)科主任 中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)會(huì)血栓和止血專家委員會(huì)委員 南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)會(huì)主任委員 南京軍區(qū)器官移植研究所副所長(zhǎng) 福建省醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)會(huì)副主任委員 第二軍醫(yī)大學(xué)和福建醫(yī)科大學(xué)碩士研究生導(dǎo)師 研究方向?yàn)樽陨砻庖卟〉膶?shí)驗(yàn)診斷以及腫瘤的基因治療 獲軍隊(duì)科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)一項(xiàng) 三等獎(jiǎng)一項(xiàng) 四等獎(jiǎng)一項(xiàng) 榮立三等功一次 被評(píng)為南京軍區(qū) 優(yōu)秀中青年科技人才 發(fā)表論文30余篇 參編專著三部 自身免疫病是一大類以產(chǎn)生各種各樣的自身抗體為特征的全身或局部性疾病 如系統(tǒng)性紅斑狼瘡 SLE 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 RA 皮肌炎 硬皮病以及免疫性不孕癥等 其較高的發(fā)病率和嚴(yán)重的危害程度越來(lái)越受到醫(yī)學(xué)界的關(guān)注 由于不同的自身免疫病具有不同的自身抗體譜 因此自身抗體的研究對(duì)自身免疫病的診斷 鑒別診斷 治療及療效監(jiān)測(cè)均有重要的意義 迄今為止 已發(fā)現(xiàn)的自身抗體將近100種 應(yīng)用于臨床的自身抗體也已達(dá)數(shù)十種 新的自身抗體還在不斷的被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用 DNA自身抗體作為一種經(jīng)典的且被廣泛應(yīng)用的自身抗體 在自身免疫病的研究中發(fā)揮了重要的作用 但DNA作為一種特殊的自身抗體 還存在許多未解之謎 因此 人們對(duì)DNA自身抗體的研究和探索始終沒(méi)有停止 本次講座主要討論一下DNA抗原以及其相對(duì)應(yīng)的DNA自身抗體的研究和臨床應(yīng)用 DNA自身抗體的研究進(jìn)展 南京軍區(qū)福州總醫(yī)院全軍檢驗(yàn)中心 CenterforLabMedicinePLA CenterforLabMedicinePLA 蘭小鵬 一 DNA抗原的分子特性 1 DNA分子的基本構(gòu)象 右手雙螺旋 B DNA 左手雙螺旋DNA Z DNA B DNA和Z DNA又稱雙鏈DNA doublestrandedDNA ds DNA 或天然DNA nativeDNA nDNA 單鏈DNA singlestrandedDNA ss DNA 或稱變性DNA 2 DNA分子的抗原特性 不同構(gòu)象的分子之間的抗原性差別甚大 但又彼此交叉 還可互相轉(zhuǎn)變 DNA分子具有多抗原決定簇的特點(diǎn) 與抗體結(jié)合時(shí)的親和力較高 DNA抗原具有多聚陰離子特性 易產(chǎn)生非特異結(jié)合反應(yīng) ds DNA的抗原決定簇存在于ds DNA分子的構(gòu)象之中 DNA抗體與DNA的結(jié)合能力與DNA抗原的分子量有一定的關(guān)系 分子量越大 結(jié)合率越高 只有35bp以上的片段才能有效地與抗ds DNA抗體結(jié)合 DNA抗體與DNA的結(jié)合能力與DNA抗原分子的堿基組成有關(guān) G C含量高的DNA分子更易與抗體結(jié)合 DNA分子中含有某些復(fù)雜或特殊的結(jié)構(gòu)時(shí) 更易與抗體結(jié)合 如含有較多的重復(fù)序列 CpG及甲基胞密啶 mC 二 Ds DNA分子的免疫原性 用常規(guī)的免疫方法 ds DNA一般不能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生相應(yīng)的抗體 來(lái)源于原核生物的ds DNA比真核生物的ds DNA更容易通過(guò)免疫動(dòng)物來(lái)制備抗體 在某些特定的情況下 真核細(xì)胞的ds DNA才具有免疫原性 三 DNA的單克隆自身抗體與常規(guī)的單克隆技術(shù)相比 自身單克隆抗體的制備更為簡(jiǎn)便 不需要人工免疫動(dòng)物 直接將自身免疫病的動(dòng)物模型的脾細(xì)胞或病人的外周血淋巴細(xì)胞與相應(yīng)的瘤細(xì)胞株融合就可建立雜交瘤 采用不同的抗原進(jìn)行篩選 則可獲得多種單克隆抗體 按融合細(xì)胞的來(lái)源不同 DNA抗體的雜交瘤可分為三類 1 鼠 鼠雜交瘤 將近交的SLE小鼠模型的脾細(xì)胞與鼠的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合 2 人 鼠雜交瘤 用SLE病人能分泌DNA抗體的B細(xì)胞與鼠的骨髓瘤細(xì)胞融合 人 人雜交瘤 用SLE病人的外周血淋巴細(xì)胞或脾細(xì)胞與人的骨髓瘤細(xì)胞融合 另外將經(jīng)過(guò)EB病毒轉(zhuǎn)化的SLE病人的B淋巴細(xì)胞進(jìn)行克隆 這種轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞亦可分泌抗ds DNA 此法更為簡(jiǎn)便 因?yàn)榧?xì)胞融合的步驟也不需要了 但這種EB病毒轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的量比較少 人 人DNA雜交瘤及其分泌的抗DNA抗體研究的意義 1 通過(guò)分析單克隆抗體的特異性 可以更進(jìn)一步地了解DNA在SLE中的作用 2 作為抗原 DNA抗體又可誘導(dǎo)抗DNA抗體的獨(dú)特型抗體 這種抗獨(dú)特型有助于研究SLE產(chǎn)生DNA抗體的調(diào)控機(jī)制 3 這種雜交瘤細(xì)胞本身可用于分析與自身抗體的產(chǎn)生有關(guān)的基因結(jié)構(gòu) DNA的單克隆抗體存在的問(wèn)題1 代表性的問(wèn)題 作為一種多抗原決定簇的分子 由其引發(fā)的免疫反應(yīng)包含了許許多多針對(duì)不同抗原決定簇的多克隆抗體 顯然 只針對(duì)一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)決定簇的單克隆抗體 代表不了DNA引起的整個(gè)免疫反應(yīng) 2 單克隆抗體可能因靜電引力與 粘性 分子呈非特異結(jié)合 3 由于不同來(lái)源的分子之間的相似性以及某些在化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上與DNA相似的化合物的存在 使DNA單克隆抗體的交叉反應(yīng)顯得尤為突出 四 DNA抗體的交叉反應(yīng)幾乎所有的DNA單克隆和多克隆抗體既能與ds DNA又可與ss DNA反應(yīng) 而且在多數(shù)情況下 DNA抗體與ss DNA的親和力更高 但是單純針對(duì)ss DNA的抗ss DNA抗體則只能與ss DNA結(jié)合不能與ds DNA結(jié)合 DNA抗體能結(jié)合的分子包括Z DNA 某些人互合成的多核苷酸如poly I poly dT poly dAdT POLY dGdC 等 不少多聚陰離子化合物如心磷脂和其它磷脂 硫酸右旋糖酐 透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素以及硫酸肝素等都可與ds DNA抗體結(jié)合 研究和了解抗DNA的交叉反應(yīng)的臨床意義 1 解釋SLE病人出現(xiàn)梅毒試驗(yàn)陽(yáng)性的現(xiàn)象 2 利用抗ds DNA抗體與硫酸右旋糖酐 DS 的反應(yīng) 可將DS吸附在硝酸纖維素柱上 用來(lái)去除SLE病人血中的抗ds DNA抗體 3 對(duì)抗ds DNA抗體和ds DNA在SLE的發(fā)病機(jī)制中的重新評(píng)價(jià) 傳統(tǒng)的觀點(diǎn) 免疫復(fù)合物沉積學(xué)說(shuō) 新的觀點(diǎn) DNA抗體可能通過(guò)與腎小球某些成分上的抗原的交叉反應(yīng) 或者通過(guò)電荷的作用 直接結(jié)合在腎小球基底膜上 產(chǎn)生阻塞或?qū)е卵a(bǔ)體介導(dǎo)的炎癥和組織損害 五 DS DNA抗體的獨(dú)特型獨(dú)特型 Idiotype Id 通常是指位于抗體可變區(qū)的抗原決定簇 私有Id privateId 只存在于某一種類型抗體中的Id 公共Id publicId 幾種或多種抗體共同擁有的Id 16 6公共Id 在活動(dòng)性的SLE中 有一半以上的病人血清中的DNA抗體帶有的一種公共Id 16 6Id與SLE的活動(dòng)性有關(guān) 病情活動(dòng)時(shí) 16 6Id的滴度上升 反之則下降 SLE病人受損的組織中亦顯示有16 6的沉積 研究16 6Id的重要意義是 16 6Id可以誘導(dǎo)正常的小鼠發(fā)展成SLE 因此SLE極有可能是一種由Id誘導(dǎo)的疾病 兩種假設(shè) 1 6 6Id Ab1 免疫小鼠 刺激產(chǎn)生了抗 16 6Id Ab2 Ab2又可刺激小鼠產(chǎn)生抗 抗 16 6Id Ab3 Ab3則帶有原來(lái)的病理性16 6Id 這種抗體可能就是抗 DNA抗體 后者可導(dǎo)致SLE的發(fā)生 2 針對(duì)16 6Id的抗 16 6Id與自身抗原 DNA 相似 因此 這種抗16 6Id的產(chǎn)生又使小鼠產(chǎn)生抗 抗 6 6Id 后者可與DNA反應(yīng) 六 抗ds DNA的檢測(cè)1 免疫螢光法 IFT 2 放射免疫法 RIA 3 ELISA4 斑點(diǎn)免疫金滲濾法 DIGFA 5 生物芯片法 優(yōu)點(diǎn) 1 目前仍為檢測(cè)抗ds DNA抗體的金標(biāo)準(zhǔn) 2 特異性高3 可同時(shí)檢測(cè)ANA和抗ds DNA抗體 4 可半定量檢測(cè)抗ds DNA抗體 滴度 缺點(diǎn) 1 敏感性不高 2 短膜蟲(chóng)的培養(yǎng)和傳代比較費(fèi)時(shí)費(fèi)事 3 操作方法也比較煩瑣 不易標(biāo)準(zhǔn)化 4 近幾年也有假陽(yáng)性報(bào)道 優(yōu)點(diǎn) 1 敏感性較高 2 可以定量測(cè)定ds DNA抗體 缺點(diǎn) 1 假陽(yáng)性率較高 2 有放射性污染 優(yōu)點(diǎn) 1 方法比較穩(wěn)定 應(yīng)用廣泛 2 可以定量 但多數(shù)情況下只是定性測(cè)定 缺點(diǎn) 1 試劑盒大多為進(jìn)口產(chǎn)品 價(jià)格較高 2 操作步驟較多 比較費(fèi)時(shí) 優(yōu)點(diǎn) 1 快速 簡(jiǎn)便 只需2分鐘 2個(gè)步驟 2 敏感性與ELISA相當(dāng) 特異性與免疫熒光法相近 缺點(diǎn) 不能定量 優(yōu)點(diǎn) 1 高通量 可同時(shí)檢測(cè)多份標(biāo)本 多種自身抗體 2 可定量測(cè)定 缺點(diǎn) 成本較高 可通過(guò)靈活多樣的組合降低成本 流式熒光檢測(cè)儀 Luminex100多功能流式點(diǎn)陣儀 流式熒光檢測(cè)儀 流式熒光技術(shù) 流式熒光技術(shù) 激光激發(fā)熒光的發(fā)光類技術(shù)之一 BeadBased SuspensionArray 基于微珠的 懸浮陣列LiquidChip QIAGEN 液態(tài)芯片 液體芯片 液相芯片F(xiàn)lexibleMulti AnalyteProfilingsystemxMAP多功能多指標(biāo)并行分析系統(tǒng)Bead MicrosphereArray微珠陣列 熒光編碼微球技術(shù) 共價(jià)交聯(lián)技術(shù) 蛋白 核酸反應(yīng)模式 核酸 抗原 抗體 檢測(cè)模式 通過(guò)類似流式細(xì)胞技術(shù) 逐顆分析紅色激光635nm 識(shí)別不同編碼的微球綠色激光532nm 用于檢測(cè)檢測(cè)信號(hào) 檢測(cè)流程 固相反應(yīng)模式 流式熒光反應(yīng)模式 微量標(biāo)本 1次檢測(cè) 100個(gè)指標(biāo) 七 抗ds DNA在SLE診斷和治療監(jiān)測(cè)中的作用1 抗ds DNA是公論的SLE的標(biāo)志抗體 1982年國(guó)際風(fēng)濕病協(xié)會(huì)把抗ds DNA陽(yáng)性列為SLE的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一 2 抗ds DNA在活動(dòng)性SLE的病人中陽(yáng)性率高 可達(dá) 以上 3 抗ds DNA可以作為監(jiān)測(cè)SLE病情的指標(biāo) 4 帶有16 6Id的抗ds DNA可以傳遞SLE 5 去除血液中的抗ds DNA可以使SLE的癥狀得到緩解 謝謝