細胞生物學研究方法.ppt

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第二章.細胞生物學研究方法,顯微成像技術(shù)細胞化學技術(shù)(cytochemistry)細胞培養(yǎng)和細胞融合分離技術(shù)分子生物學方法,顯微成像技術(shù),光學和電子顯微鏡成像原理三個基本要素:①照明系統(tǒng)，②被觀察的樣品，③聚焦和成像的透鏡系統(tǒng)常用的光學顯微鏡普通雙筒顯微鏡(binocularmicroscope)熒光顯微鏡(fluorescencemicroscope)相差顯微鏡(phasecontrastmicroscope)暗視野顯微鏡(darkfieldmicroscope)倒置顯微鏡,光學和電子顯微鏡的基本結(jié)構(gòu),分辨率(resolution),R=0.61λ/nSinαn=聚光鏡和物鏡之間介質(zhì)的折射率.空氣為1.油為1.5;α=樣品對物鏡角孔徑的半角，sinα的最大值為1;λ=照明光源的波長。0.61是一個恒定的參數(shù)，表示成像的點雖被重疊但仍能被區(qū)別的程度數(shù)值孔徑越大，進入物鏡的光越多；介質(zhì)的折射率越大，則數(shù)值孔徑越大，這些都可以使分辨率提高,表2-2電子顯微鏡與光學顯微鏡的基本區(qū)別,,,電子顯微鏡與光學顯微鏡的基本區(qū)別,細胞化學技術(shù)(cytochemistry),酶細胞化學技術(shù)(enzymecytochemistry)通過酶的特異細胞化學反應(yīng)來顯示酶在細胞內(nèi)的定位免疫細胞化學技術(shù)(immunocytochemistry)利用免疫反應(yīng)定位組織或細胞中抗原成分分布的一類技術(shù)。主要分為兩大類:免疫熒光技術(shù)和免疫電鏡技術(shù)。,分離技術(shù),分離技術(shù)是一大類技術(shù)的總稱，包括細胞組分的分離和生物大分子的分離細胞組分的分級分離差速離心:低速高速密度梯度離心:離心介質(zhì)(蔗糖.甘油.氯化銫),,差速離心的原理,密度梯度離心分離溶酶體、線粒體和微體,CsCl密度梯度離心分離DNA,細胞培養(yǎng)(cellculture),在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，培養(yǎng)從機體中取出的細胞，并使之生存和生長的技術(shù)為細胞培養(yǎng)技術(shù)。體外細胞培養(yǎng)的條件物質(zhì)營養(yǎng)生存環(huán)境廢物的排除,原代培養(yǎng)(primaryculture),直接從機體取下細胞、組織和器官后立即進行培養(yǎng),,■細胞系和細胞株(celllineandcellstrain)●細胞系:原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即為細胞系，●細胞株:從一個經(jīng)過生物學鑒定的細胞系由單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法由單細胞增殖形成的細胞群稱細胞株?！鰟游锛毎囵B(yǎng)方法●貼壁培養(yǎng)分散的細胞懸浮在培養(yǎng)瓶中很快(幾十分鐘至幾小時)就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁，貼壁后的細胞形態(tài)形成多態(tài)性，呈單層生長，所以此法又叫單層細胞培養(yǎng)。單層培養(yǎng)的細胞保持接觸抑制(contactinhibition)的特性。懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)的細胞在培養(yǎng)過程中不貼壁，一直懸浮在培養(yǎng)液中生長，如T細胞的培養(yǎng)就是如此。懸浮培養(yǎng)的條件較為復雜，難度也大一些，但是容易同時獲得大量的培養(yǎng)細胞,細胞融合與單克隆抗體技術(shù),細胞融合(cellfusion)指自發(fā)或人工誘導下，兩個不同基因型的細胞或原生質(zhì)體融合形成一個雜種細胞(圖2-33)。單克隆抗體技術(shù)(monoclonalantibodytechnique)1975年英國科學家Milstein和Kohler發(fā)明了單克隆抗體技術(shù)，因此獲得1984年諾貝爾醫(yī)學獎,細胞融合,單克隆抗體技術(shù),動物細胞核移植克隆技術(shù),1997年，英國蘇格蘭羅斯林研究所I.WI.Wilmut等首次成功通過細胞融合技術(shù)利用成年動物徹底分化的體細胞克隆出子代個體，開創(chuàng)了動物體細胞克隆的新時代,分子生物學方法,基因工程技術(shù)(geneengineering)PCR技術(shù)選擇性基因敲除(geneknockout)與敲進(geneknockin)乳腺生物反應(yīng)器技術(shù),基因克隆(genecloning),這項技術(shù)可概括為∶分、切、連、轉(zhuǎn)、選,PCR技術(shù),PCR是英文聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerasechainreaction)的簡稱，是80年代發(fā)展起來的一項具有重大意義的分子生物學技術(shù),轉(zhuǎn)基因敲除小鼠的獲得,利用同源重組(基因打靶)使基因失活的方法基因敲除是一套組合技術(shù)，包括基因重組、細胞分離、轉(zhuǎn)基因等兩個關(guān)鍵技術(shù):體外重組與轉(zhuǎn)基因鼠,基因敲進(knockinofgene),將外源有功能的基因(基因組中原先不存在.或已失活的基因),轉(zhuǎn)如細胞與基因組中的同源序列進行同源重組,插入到基因組中,在細胞內(nèi)獲得表達,稱為基因敲進.,乳腺生物反應(yīng)器技術(shù),乳腺生物反應(yīng)器是根據(jù)細胞生物學中蛋白質(zhì)合成與分選的機理，結(jié)合基因工程技術(shù)、動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)等，利用動物的乳腺分泌某些具有重要價值的基因產(chǎn)物(,胡克和列文虎克發(fā)現(xiàn)細胞的動機是不同的，你對此有何感想?,觀察力和對自然現(xiàn)象的好奇心，以及對事業(yè)的責任感才導致細胞的發(fā)現(xiàn)。,