第2章 植物組織培養(yǎng)技術(shù)

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1、第2章 植物組織培養(yǎng)技術(shù)第二節(jié) 植物組織培養(yǎng)概述一、授課章節(jié)第二節(jié) 植物組織培養(yǎng)概述。二、學(xué)時(shí)安排2學(xué)時(shí)。三、教學(xué)目標(biāo)1掌握植物組織培養(yǎng)的含義。2了解植物組織培養(yǎng)的類型劃分。3理解植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用原理。4掌握植物組織培養(yǎng)的特點(diǎn)和應(yīng)用。四、教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)分析重點(diǎn)：植物組織培養(yǎng)的含義、特點(diǎn)和應(yīng)用。難點(diǎn)：植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用原理。五、教具電化教學(xué)設(shè)備，植物組織培養(yǎng)試管苗。六、教學(xué)方法講授法，多媒體課件。七、教學(xué)過(guò)程.導(dǎo)入前面我們學(xué)習(xí)了有關(guān)植物育種的一些知識(shí)，今天，請(qǐng)看我給同學(xué)們看一樣?xùn)|西(教師拿出試管苗)，問(wèn)同學(xué)們這是什么呢？這就是我們要學(xué)的植物組織培養(yǎng)。II.新課一、植物組織培養(yǎng)的含義植物組織培養(yǎng)

2、是指在無(wú)菌條件下，將離體的植物器官、組織、細(xì)胞以及原生質(zhì)體培養(yǎng)在人工培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，使其長(zhǎng)成完整植株的過(guò)程。由于培養(yǎng)物脫離母株在試管內(nèi)培養(yǎng)，故又稱離體培養(yǎng)、試管培養(yǎng)。二、植物組織培養(yǎng)的類型植物組織培養(yǎng)由于分類依據(jù)不同可劃分為不同的類型。植株培養(yǎng)：對(duì)幼小植株的培養(yǎng)。植物組織培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)對(duì)象器官培養(yǎng)：對(duì)根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等離體器官的培養(yǎng)。組織培養(yǎng)：對(duì)植物體的各部分組織進(jìn)行的培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)：對(duì)單個(gè)細(xì)胞或較小細(xì)胞團(tuán)的培養(yǎng)。原生質(zhì)體培養(yǎng)：對(duì)除去細(xì)胞壁的原生質(zhì)體的培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)方式固體培養(yǎng)：加入瓊脂等凝固劑，使培養(yǎng)基固體化，在此培養(yǎng)基上的培養(yǎng)。液體培養(yǎng)：培養(yǎng)基中不加凝固劑，培養(yǎng)基為液

3、體，在此培養(yǎng)基上的培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)過(guò)程初代培養(yǎng)：將外植體進(jìn)行的第一次培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)：將培養(yǎng)一段時(shí)間的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)的過(guò)程。光培養(yǎng)：培養(yǎng)過(guò)程中需要光照的培養(yǎng)。暗培養(yǎng)：培養(yǎng)過(guò)程中不需要光照的培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)條件三、植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用原理（一）植物細(xì)胞全能性植物細(xì)胞全能性，是指植物體上每個(gè)具有完整細(xì)胞核的植物細(xì)胞，都具有該植物體的全部遺傳信息和產(chǎn)生完整植株的能力。植物的體細(xì)胞一旦脫離所在器官或組織的束縛成為離體狀態(tài)時(shí)，在一定的營(yíng)養(yǎng)、激素和外界條件作用下，就可能表現(xiàn)出全能性，而生長(zhǎng)發(fā)育成為完整的植株。（二）細(xì)胞的分化和形態(tài)建成（三）植物的再生功能四、植物組織培養(yǎng)的特點(diǎn)（一）研究材料來(lái)源單一

4、，無(wú)性系遺傳信息相同（二）試驗(yàn)經(jīng)濟(jì)，管理方便，工作效率高（三）培養(yǎng)條件人為控制，可周年連續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)或生產(chǎn)（四）生長(zhǎng)快，周期短，繁殖率高五、植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用（一）優(yōu)良品種的快速繁殖（二）脫毒及脫毒苗的再繁育（三）植物新品種的培育（四）種質(zhì)資源的保存和交換（五）有用次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)III.作業(yè)1.簡(jiǎn)述植物組織培養(yǎng)的概念和培養(yǎng)類型。2.植物組織培養(yǎng)技術(shù)有哪些特點(diǎn)？3.植物組織培養(yǎng)在生產(chǎn)上有哪些方面的應(yīng)用？ 4.通過(guò)學(xué)習(xí)，你對(duì)植物組織培養(yǎng)技術(shù)是怎樣理解的？第二節(jié) 植物組織培養(yǎng)廠房的設(shè)計(jì)與構(gòu)建一、授課章節(jié)第二節(jié) 植物組織培養(yǎng)廠房的設(shè)計(jì)與構(gòu)建。二、學(xué)時(shí)安排2學(xué)時(shí)。三、教學(xué)目標(biāo)1了解組培工廠的基本結(jié)構(gòu)、

5、各部分結(jié)構(gòu)的具體功能。2理解組培工廠的設(shè)計(jì)原則與總體要求，能夠根據(jù)需要和實(shí)際情況科學(xué)設(shè)計(jì)組培工廠。3掌握廠房的基本組成，儀器設(shè)備配備與設(shè)計(jì)要求。4了解常用儀器與用具的使用方法。四、教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)分析重點(diǎn)：組培工廠的設(shè)計(jì)原則與總體要求。難點(diǎn)：根據(jù)需要和實(shí)際情況科學(xué)設(shè)計(jì)組培工廠。五、教具電化教學(xué)設(shè)備、組培工廠現(xiàn)場(chǎng)或?qū)嶒?yàn)室。六、教學(xué)方法講授法，演示法。七、教學(xué)過(guò)程.導(dǎo)入復(fù)習(xí)：植物組織培養(yǎng)的概念，類型及應(yīng)用。提問(wèn)：細(xì)胞全能性的概念。上次課我們學(xué)習(xí)了植物組織培養(yǎng)的基本知識(shí)，那么從事植物組織培養(yǎng)的生產(chǎn)需要一些基本的儀器和設(shè)備，今天我們來(lái)學(xué)習(xí)植物組織培養(yǎng)的廠房的設(shè)計(jì)與構(gòu)建。II.新課一、植物組織培養(yǎng)廠房的設(shè)

6、計(jì)（一）設(shè)計(jì)原則1.環(huán)境清潔、安靜、遠(yuǎn)離污染源。2.按照工作的目的和規(guī)模決定廠房的設(shè)計(jì)。3.按照自然工作程序先后合理布局，避免生產(chǎn)環(huán)節(jié)倒排。4.經(jīng)濟(jì)實(shí)用，節(jié)能安全。（二）具體要求1.廠房選址時(shí)應(yīng)選擇周圍安靜、陽(yáng)光充足、無(wú)高大建筑物遮擋的環(huán)境；最好在常年主風(fēng)向的上風(fēng)方向，盡量減少污染；要求交通便利，便于產(chǎn)品的運(yùn)送。2.廠房各車間的大小和比例相對(duì)合理，車間的設(shè)計(jì)和設(shè)備的配置、擺放與其功能相適應(yīng)。3.廠房必須滿足3個(gè)基本的需要：生產(chǎn)準(zhǔn)備（器皿洗滌與存放、培養(yǎng)基制備、各種器具的滅菌）、無(wú)菌操作和控制培養(yǎng)。4.廠房的建筑與裝修材料要耐腐蝕，便于消毒和清潔。（三）廠房基本組成廠房根據(jù)結(jié)構(gòu)和應(yīng)用范圍一般設(shè)計(jì)

7、為藥品配制間、洗滌間、培養(yǎng)基制作間、緩沖間、無(wú)菌操作間、試管苗培養(yǎng)間、試管苗馴化移植間。1.藥品配制間（1）任務(wù)：主要用于化學(xué)藥品的儲(chǔ)藏、稱量和溶液的配制。（2）設(shè)計(jì)要求：干燥、通風(fēng)、無(wú)直射光線。房間內(nèi)設(shè)立工作臺(tái)，工作臺(tái)最好用抗鹽堿，耐腐蝕的臺(tái)面，要牢固、平穩(wěn)，具有較好的抗震性能。注意磁力攪拌器與電子天平要分開(kāi)臺(tái)面放置。（3）儀器與用具配置：大型工作臺(tái)、藥品柜、普通冰箱、電子分析天平、托盤天平、磁力攪拌器、容量瓶、燒杯、量筒等。2.洗滌間（1）任務(wù)：洗滌室用于完成玻璃器皿等儀器的清洗、干燥和貯存；外植體的預(yù)處理與清洗；試管苗的出瓶、清洗與整理等工作。（2）設(shè)計(jì)要求：房間內(nèi)應(yīng)寬敞明亮，方便多人同

8、時(shí)操作；配備大型水槽，上下水道要暢通；地面、天花板及墻壁應(yīng)耐濕和便于清潔；應(yīng)有晾干臺(tái)，用于放置洗滌后的培養(yǎng)器皿。（3）儀器與用具配置：水槽、晾干臺(tái)、周轉(zhuǎn)箱、烘箱等。3.培養(yǎng)基制作間（1）任務(wù)：主要負(fù)責(zé)培養(yǎng)基的配制、分裝、包扎和高壓滅菌等工作。（2）設(shè)計(jì)要求：房間寬敞明亮、通風(fēng)良好，方便多人同時(shí)操作；目前滅菌大多采用電加溫，墻體建筑時(shí)要預(yù)先設(shè)計(jì)電路線，確保用電線路和滅菌鍋的用電安全。在滅菌鍋上方的墻壁設(shè)置換氣窗，利于通風(fēng)排氣。地面、墻壁應(yīng)用耐濕材料鋪設(shè)，防水、防潮、防腐蝕。（3）儀器與用具配置：托盤天平、酸度計(jì)、工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、周轉(zhuǎn)箱、儲(chǔ)物柜等。4.緩沖間（1）任務(wù)：防止工作人員進(jìn)出時(shí)帶進(jìn)雜

9、菌。（2）設(shè)計(jì)要求：面積一般23m2為宜；緩沖間應(yīng)安裝紫外燈，用以照射滅菌；配備鞋柜、衣柜、拖鞋，用于工作人員進(jìn)入無(wú)菌操作室前在此更衣?lián)Q鞋，（3）儀器與用具配置：紫外燈、鞋柜、衣柜、工作服等。5.無(wú)菌操作間(接種間)（1）任務(wù)：進(jìn)行植物材料的分離接種及培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移。（2）設(shè)計(jì)要求：接種室宜小不宜大，一般78m2。地面、天花板及四壁要求盡可能密閉光滑，易于清潔和消毒。配置推拉門，以減少開(kāi)關(guān)門時(shí)的空氣擾動(dòng)。房間密閉，干爽安靜，清潔明亮。在適當(dāng)位置吊裝12盞紫外燈，用以照射滅菌。最好安裝一小型空調(diào)，使室溫可控，這樣可使門窗緊閉，減少與外界空氣對(duì)流。（3）儀器與用具配置：超凈工作臺(tái)、紫外燈、空調(diào)機(jī)、醫(yī)用

10、小推車、接種器具消毒器、酒精燈、接種工具、擱物架等。6.試管苗培養(yǎng)間（1）任務(wù)：接種材料的培養(yǎng)生長(zhǎng)。（2）設(shè)計(jì)要求：培養(yǎng)間的大小可根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模和培養(yǎng)架的大小、數(shù)目及其它附屬設(shè)備而定。其設(shè)計(jì)以充分利用空間和節(jié)省能源為原則。高度比培養(yǎng)架略高為宜，周圍墻壁和天花板要求光滑平坦、有絕熱防火的性能。能夠控制光照和溫度，并保持相對(duì)的無(wú)菌環(huán)境；適當(dāng)位置安裝紫外燈進(jìn)行照射滅菌。（3）儀器與用具配置：培養(yǎng)架、空調(diào)機(jī)、光照時(shí)控器、溫度計(jì)、搖床等。7.試管苗馴化移植間（1）任務(wù)：進(jìn)行試管苗的馴化和移植。（2）設(shè)計(jì)要求：通常在日光溫室內(nèi)進(jìn)行，其面積大小根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模而定。要求能夠控溫調(diào)濕、控光通風(fēng)、控菌防蟲。（3）儀器

11、與用具配置：移栽容器、彌霧裝置、遮陽(yáng)網(wǎng)、移栽基質(zhì)等。二、基本儀器設(shè)備和用具（一）滅菌設(shè)備1.濕熱滅菌設(shè)備（高壓蒸汽滅菌鍋）：用于培養(yǎng)基、玻璃器皿以及其它可高溫滅菌用品的滅菌，根據(jù)規(guī)模大小有小型手提式、中型立式、大型臥式等不同規(guī)格；根據(jù)控制方式分為手動(dòng)控制、半自動(dòng)控制和全自動(dòng)控制等不同類型。2.過(guò)濾滅菌設(shè)備（防細(xì)菌濾膜）：防細(xì)菌濾膜的網(wǎng)孔直徑為0.45m以下，當(dāng)溶液通過(guò)濾膜后，細(xì)菌的細(xì)胞和真菌的孢子等因大于濾膜直徑而被阻，在需要過(guò)濾滅菌的液體量大時(shí)，常使用抽濾裝置；液量小時(shí)，可用注射器。主要用于赤霉素、玉米素、脫落酸等不耐熱物質(zhì)的滅菌。3.干熱滅菌設(shè)備：利用高溫烘烤或灼燒的方法進(jìn)行滅菌，包括烘箱

12、（器皿和器械的滅菌）、酒精燈（用于接種工具的滅菌）、接種器械滅菌器等。4.其它滅菌設(shè)備：利用紫外光波、超聲波、臭氧等殺菌，主要用于對(duì)空氣和物體表面進(jìn)行消毒。常用設(shè)備包括紫外燈、超聲波清洗器、臭氧發(fā)生器等。（二）接種設(shè)備與用具1.超凈工作臺(tái)：超凈工作臺(tái)是植物組織培養(yǎng)最常用、最普及的無(wú)菌操作裝置。根據(jù)風(fēng)幕形成的方式可分為水平風(fēng)和垂直風(fēng)兩種；根據(jù)使用方式分為單人單面、雙人單面、雙人雙面等。2.接種工具：外植體接種或培養(yǎng)物繼代轉(zhuǎn)接時(shí)使用的各種工具。常用的有：尖頭鑷：用于分離植物組織等；槍型鑷：用于夾取植物器官繼代轉(zhuǎn)接和外植體接種；解剖剪：用于幼嫩組織、細(xì)胞團(tuán)等剪?。粡濐^剪：用于轉(zhuǎn)接、剪取試管苗莖段等；

13、解剖刀：用于外植體或培養(yǎng)物切割；接種針：用于莖尖剝離和愈傷組織轉(zhuǎn)移；切割盤：用于原球莖、愈傷組織、植物器官等切割分離。3.顯微鏡：包括雙目體視顯微鏡(解剖鏡)、生物顯微鏡、倒置顯微鏡和電子顯微鏡，用于剝離莖尖和進(jìn)行培養(yǎng)物的觀察、分析、拍照等。（三）培養(yǎng)設(shè)備與用具1.培養(yǎng)架：試管苗在培養(yǎng)間里培養(yǎng)時(shí)通常擺放在培養(yǎng)架上。培養(yǎng)架大多由金屬制成，一般設(shè)58層，最低一層離地高約20cm，其他每層間隔30cm左右。培養(yǎng)架長(zhǎng)度根據(jù)日光燈的長(zhǎng)度而設(shè)計(jì)，如采用40W日光燈，則長(zhǎng)1.3m，寬度一般為60cm。2.恒溫振蕩器：用于液體培養(yǎng)時(shí)改善培養(yǎng)過(guò)程的氧氣供應(yīng)狀況。3.光照培養(yǎng)箱：對(duì)于一些對(duì)環(huán)境條件要求特別嚴(yán)格的培

14、養(yǎng)物，可培養(yǎng)在能自動(dòng)調(diào)控溫度、濕度、光照等的智能光照培養(yǎng)箱里。4.培養(yǎng)器皿：根據(jù)培養(yǎng)目的和要求不同，可選用不同類型和規(guī)格的培養(yǎng)容器。（1）三角瓶：主要用于外植體靜置培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)或試管苗繼代培養(yǎng)。規(guī)格有50mL，l00mL，150mL，250mL，500mL等，一般使用l50mL三角瓶。優(yōu)點(diǎn)：其培養(yǎng)面積大，利于組織生長(zhǎng)；透光度好；由于瓶口較小，不易污染。（2）試管：主要用于莖尖培養(yǎng)、液體培養(yǎng)。試管要求口徑大，長(zhǎng)度稍短、以2cm15cm、2.5cm15cm、3cm15cm 為宜。優(yōu)點(diǎn)：占空間少，單位面積容納的數(shù)量多。（3）果醬瓶：主要用于繼代和生根培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：在工廠化大批量生產(chǎn)時(shí)使用，價(jià)格低廉，

15、成本低；口徑較大，便于操作。缺點(diǎn)：污染率較高；透光性稍差。（4）塑料瓶：主要用于蘭科植物的培養(yǎng)。有100mL、150mL、200mL、250mL的規(guī)格。優(yōu)點(diǎn)：密封好、透氣性差、瓶?jī)?nèi)濕度大；質(zhì)輕，便于操作，不易破損，污染率低；長(zhǎng)方盒形的培養(yǎng)株數(shù)多，且疊摞起來(lái)節(jié)約空間。缺點(diǎn)：可重復(fù)利用性較差。（四）稱量設(shè)備與用具1.天平：用于進(jìn)行瓊脂、蔗糖和各種藥品的稱量，需要有稱量微量元素和植物激素等的分析天平；稱量大量元素、蔗糖和瓊脂等的托盤天平等不同精度的天平。2.燒杯：用于配制培養(yǎng)基母液時(shí)溶解各種化合物，規(guī)格有501000mL不等。3.量筒：用于量取不同體積的液體，規(guī)格有501000mL不等。4.試劑瓶：

16、用于貯存不同容量的溶液，規(guī)格有501000mL不等。5.移液管：用于吸取各種用量較少的母液，規(guī)格有0.110mL不等。6.容量瓶：用于配制培養(yǎng)基母液時(shí)進(jìn)行定容，規(guī)格有501000mL不等。（五）環(huán)境控制設(shè)備與用具1.空調(diào)機(jī)：自動(dòng)控制植物組織培養(yǎng)廠房的溫度，為培養(yǎng)物提供最適宜的溫度條件。2.冰箱：用于母液和某些試劑的貯存及培養(yǎng)材料的保鮮或與處理等。3.光照時(shí)控器：用于自動(dòng)控制培養(yǎng)間的光照時(shí)間。（六）其它設(shè)備與用具1.磁力攪拌器：磁力攪拌器用于加速攪拌難溶的物質(zhì)，如各種化學(xué)物質(zhì)等。磁力攪拌器還可加熱，加快物質(zhì)的溶解。2.蒸餾水發(fā)生器或純水機(jī)：用于制備配制母液和培養(yǎng)基的蒸餾水或去離子水。3.藥品柜：

17、用于存放各種化學(xué)藥品。4.加熱設(shè)備：制備固體培養(yǎng)基時(shí)需加熱使固化劑溶化，因此需要加熱設(shè)備如液化氣灶、電爐、恒溫水浴鍋等。5.pH計(jì)：用于精確測(cè)量和調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，大規(guī)模生產(chǎn)中一般用精密pH試紙代替。III.作業(yè)1.植物組織培養(yǎng)廠房的設(shè)計(jì)原則和要求有哪些？2.植物組織培養(yǎng)的工藝流程是怎樣的？3.組建一個(gè)植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)車間應(yīng)包括哪幾部分，各部分的設(shè)計(jì)要求以及主要功能是什么？4.植物組織培養(yǎng)需要哪些基本設(shè)備，各有何作用？第三節(jié) 植物組織培養(yǎng)操作技術(shù)（1）一、授課章節(jié)第三節(jié) 植物組織培養(yǎng)操作技術(shù)（1）。二、學(xué)時(shí)安排2學(xué)時(shí)。三、教學(xué)目標(biāo)1掌握組培的一般工作程序。2掌握不同類型培養(yǎng)器皿和用具的洗滌技術(shù)

18、。3了解常用消毒滅菌方法的原理，掌握其操作技術(shù)，能根據(jù)物品種類正確選用消毒滅菌方法。四、教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)分析重點(diǎn)：常用的消毒滅菌技術(shù)。難點(diǎn)：滅菌和消毒的區(qū)別及無(wú)菌意識(shí)的樹(shù)立。五、教具電化教學(xué)設(shè)備。六、教學(xué)方法講授法，演示法。七、教學(xué)過(guò)程.導(dǎo)入提問(wèn)：植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的基本構(gòu)成。本次課主要介紹的是植物組織培養(yǎng)洗滌和消毒滅菌技術(shù)。II.新課一、洗滌技術(shù)植物組織培養(yǎng)除了要對(duì)培養(yǎng)材料和接種用具進(jìn)行嚴(yán)格消毒外，各種用具更要求洗滌清潔，因?yàn)楦鞣N滅菌方法的有效作用時(shí)間都是以材料或用具清潔為前提的。（一）洗滌液1.洗衣粉、洗潔精洗滌液 適用于玻璃器皿和金屬類器具的洗滌。2.鉻酸洗滌液 由重鉻酸鉀和濃硫酸混合而成

19、，屬?gòu)?qiáng)氧化劑，對(duì)無(wú)機(jī)離子、灰塵效果好，對(duì)油污無(wú)效。鉻酸洗滌液的配制：稱取重鉻酸鉀50g，加入1L蒸餾水，加熱攪拌至完全溶解；冷卻后注入90mL濃硫酸，混合均勻即可。剛配好的洗液是棕紅色，反復(fù)使用至變成青褐色則失效?！咀⒁馐马?xiàng)】（1）配制時(shí)重鉻酸鉀溶液一定要冷卻后才能加濃硫酸，且只能把濃硫酸緩慢加入重鉻酸鉀溶液中，決不能將重鉻酸鉀溶液或蒸餾水倒入濃硫酸中。（2）由于鉻酸洗滌液具有極強(qiáng)的氧化能力和腐蝕作用，故不要用手直接接觸洗滌液。（二）各類器皿和用具的洗滌方法1.新的玻璃器皿：使用前先用1%稀鹽酸浸泡1224h用毛刷蘸洗衣粉水刷洗干凈流水沖洗34次最后用蒸餾水沖淋1遍晾干（或烘干）后備用。2.已

20、用過(guò)的培養(yǎng)器皿：除去容器內(nèi)的殘?jiān)詠?lái)水沖洗浸泡在洗衣粉水中1530min用毛刷刷洗干凈流水沖洗34次最后用蒸餾水沖淋1遍晾干（或烘干）后備用。3.已被霉菌等雜菌污染的器皿：121高溫高壓蒸汽滅菌30min趁熱倒去殘?jiān)詠?lái)水沖洗浸泡在洗衣粉水中1530min用毛刷刷洗干凈流水沖洗34次最后用蒸餾水沖淋1遍晾干（或烘干）后備用。4.移液管、量筒等量器：鉻酸洗滌液中浸泡2h以上取出后在流水中沖洗30min蒸餾水沖淋1次晾干（或烘干）后備用。5.載玻片和蓋玻片：洗滌液中浸泡數(shù)小時(shí)水洗綢布擦干放在95%的灑精中備用。6.解剖刀、鑷子、剪刀等：新購(gòu)置金屬器皿因其上有潤(rùn)滑油或防銹油，用蘸有四氯化碳的棉布擦去

21、油脂，再用濕布擦凈，干燥備用。每次使用后先用洗衣粉水刷洗，再用酒精擦拭。二、滅菌與消毒技術(shù)（一）滅菌與消毒的區(qū)別1有菌和無(wú)菌的范疇有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，至少它的表面都是有菌的。無(wú)菌的范疇是：經(jīng)高溫灼燒或一定時(shí)間蒸煮過(guò)后的物體，經(jīng)其他理化滅菌方法處理后的物體一般可認(rèn)為是無(wú)菌的。2.滅菌與消毒的區(qū)別滅菌是指用物理或化學(xué)方法殺死物體表面和孔隙內(nèi)一切微生物或生物體。消毒是指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用。由滅菌和消毒的含義可以看出，二者的主要區(qū)別是：滅菌是把所有有生命的物質(zhì)全部殺死；而消毒主要?dú)⑺阑蛞种莆矬w表面的微生物，但芽孢、厚垣孢子一般不會(huì)

22、死亡。（二）常用的消毒滅菌方法（三）消毒滅菌技術(shù)1.環(huán)境消毒：方法主要有空氣過(guò)濾滅菌、紫外線照射消毒、噴霧消毒和熏蒸消毒等。空氣過(guò)濾滅菌：成規(guī)模的植物組織培養(yǎng)車間可采用空氣過(guò)濾系統(tǒng)對(duì)整個(gè)環(huán)境進(jìn)行空氣過(guò)濾滅菌，這種方法投入較高，操作要求比較嚴(yán)格，一般較少采用。組織培養(yǎng)中普遍采用的是對(duì)無(wú)菌操作的微環(huán)境進(jìn)行空氣過(guò)濾滅菌，如超凈工作臺(tái)的局部無(wú)菌環(huán)境。紫外線照射消毒：利用紫外光波照射滅菌，細(xì)菌吸收紫外線后，蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，引起細(xì)菌的染色體變異，造成死亡。緩沖間、接種間、培養(yǎng)間等均可采用紫外線照射消毒，一般照射2030min。噴霧消毒：利用70%75%的酒精或0.2%的新潔爾滅對(duì)環(huán)境進(jìn)行噴霧，既

23、可以起到直接殺死環(huán)境中微生物的作用，又可以使飄浮的塵埃降落，防止塵埃上附著的雜菌污染培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料。熏蒸消毒：利用加熱焚燒、氧化等方法，使化學(xué)藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴(kuò)散到空氣中，以殺死空氣和物體表面的微生物。常用熏蒸劑是甲醛，熏蒸時(shí)，按2mLm3用量，將甲醛置于廣口容器中，加0.2g/m3高錳酸鉀氧化揮發(fā)。熏蒸時(shí)，房間可預(yù)先噴濕，關(guān)閉緊密，24h后打開(kāi)門窗通風(fēng)。2.用具的消毒滅菌：根據(jù)用具種類不同分別采用干熱滅菌、濕熱滅菌、浸泡消毒、擦拭消毒等方法。干熱滅菌：利用烘箱進(jìn)行烘烤滅菌的方法，適用于各種玻璃器皿和器械的滅菌消毒。方法是將清洗后的玻璃器皿和器械妥為包扎，放入箱內(nèi)，將箱溫控制在150170，

24、烘烤120min，即可達(dá)到滅菌效果。在干熱條件下，細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞抗熱性大為提高，故能源消耗大，又浪費(fèi)時(shí)間，所以目前多采用濕熱滅菌代替，接種工具也可采用消毒器烘烤和酒精燈外焰灼燒的方法消毒。濕熱滅菌：適用于培養(yǎng)基、玻璃器皿、棉塞、布制品及金屬用具等的滅菌，一般滅菌掌握在0.10.15MPa壓力下2030min。浸泡消毒：在無(wú)菌操作時(shí)，把鑷子、剪子、解剖刀等浸入70%75%的酒精中浸泡，使用之前取出在酒精燈外焰上灼燒，待冷卻后使用。擦拭消毒：接種用具及超凈工作臺(tái)表面等使用前可用70%酒精或0.10.2%新潔爾滅溶液進(jìn)行擦拭消毒。3.培養(yǎng)基滅菌：培養(yǎng)基滅菌一般采用濕熱滅菌，特殊情況下采用過(guò)濾無(wú)菌。濕

25、熱滅菌：采用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌。過(guò)濾滅菌：主要針對(duì)一些不能處于高溫高壓環(huán)境的物質(zhì)，如GA3、IAA、ABA（脫落酸）、ZT（玉米素）、部分維生素、多數(shù)抗生素和酶。過(guò)濾滅菌的原理是細(xì)菌濾膜的網(wǎng)孔直徑為0.45m以下，當(dāng)溶液通過(guò)濾膜后，細(xì)菌的細(xì)胞和真菌的孢子（直徑1m以上）等因大于濾膜網(wǎng)孔直徑而被阻。4.外植體消毒：從外界或室內(nèi)選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物，因此，植物材料必須經(jīng)嚴(yán)格的表面消毒處理。接種的植物材料叫做外植體。外植體的消毒要求比較嚴(yán)格，既要能有效殺滅微生物，又要保證植物組織盡量少受傷害。外植體一般采用浸泡消毒的方法，具體方法在以后課程中講授。III.作業(yè)1.不同的培養(yǎng)器皿

26、怎樣選擇與洗滌？2.植物組織培養(yǎng)環(huán)境如何進(jìn)行消毒滅菌？3過(guò)濾滅菌的技術(shù)原理？第三節(jié) 植物組織培養(yǎng)操作技術(shù)（2）一、授課章節(jié)第三節(jié) 植物組織培養(yǎng)操作技術(shù)（2）。二、學(xué)時(shí)安排2學(xué)時(shí)。三、教學(xué)目標(biāo)1掌握培養(yǎng)基的作用。2掌握培養(yǎng)基中生長(zhǎng)調(diào)控物質(zhì)的作用。3了解培養(yǎng)基的類型。四、教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)分析重點(diǎn)：培養(yǎng)基的基本成分。難點(diǎn)：培養(yǎng)基中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的作用。五、教具電化教學(xué)設(shè)備。六、教學(xué)方法講授法，演示法。七、教學(xué)過(guò)程.導(dǎo)入培養(yǎng)基是進(jìn)行植物組織培養(yǎng)的基質(zhì)，進(jìn)行植物組織培養(yǎng)必須掌握培養(yǎng)基的基本知識(shí)，今天我們就學(xué)習(xí)培養(yǎng)基的種類和基本成分。II.新課三、培養(yǎng)基制備技術(shù)（一）配制培養(yǎng)基的目的配制培養(yǎng)基的目的是人為提供

27、離體培養(yǎng)材料的營(yíng)養(yǎng)源。配制的不同培養(yǎng)基，是為滿足不同類型植物材料對(duì)營(yíng)養(yǎng)的不同需要。沒(méi)有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項(xiàng)新的培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)，首先必須找到一種合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。（二）培養(yǎng)基的種類1.培養(yǎng)基的種類劃分培 養(yǎng) 基 種 類固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入一定量凝固劑，使其成為固體狀態(tài)。根據(jù)形態(tài)液體培養(yǎng)基：培養(yǎng)基中沒(méi)有凝固劑為液體狀態(tài)。根據(jù)培養(yǎng)階段根據(jù)培養(yǎng)進(jìn)程根據(jù)營(yíng)養(yǎng)水平初代培養(yǎng)基：初代培養(yǎng)階段所用的培養(yǎng)基。繼代培養(yǎng)基：繼代培養(yǎng)階段所用的培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基：在基本培養(yǎng)基中加入適宜的植物激素和有機(jī)附加物的培養(yǎng)基。基本培養(yǎng)基：只含有無(wú)機(jī)鹽、蔗糖、維生素和水等最基本

28、成分的合成培養(yǎng)基。如Ms、White、Nitsch、N6等培養(yǎng)基。誘導(dǎo)培養(yǎng)基：初代培養(yǎng)時(shí)誘導(dǎo)外植體生長(zhǎng)與脫分化的培養(yǎng)基。增殖培養(yǎng)基：繼代培養(yǎng)中促進(jìn)培養(yǎng)物快速增殖的培養(yǎng)基，也稱擴(kuò)繁培養(yǎng)基。生根培養(yǎng)基：誘導(dǎo)試管苗生根的培養(yǎng)基。2.常用培養(yǎng)基的配方和特點(diǎn) 目前已公開(kāi)報(bào)道的基本培養(yǎng)基有許多種類，各有不同的特點(diǎn)和適用范圍，在植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)中應(yīng)根據(jù)不同的植物種類和培養(yǎng)部位及不同的培養(yǎng)目的選用不同的培養(yǎng)基。常用的培養(yǎng)基配方：表1 常用培養(yǎng)基配方含量（mg/L） MS（1962）B5（1968）White（1943）SH（1972）Knudson C（1946）VW（1949）N6（1974）(NH4)2S

29、04NH4N03KN03Ca(N03)24H20CaCl22H20Ca3(PO4)21650l900440134250015080200250020050010005005252004632830166MgS047H20KH2PO4NaH2P04H20Na2SO4Na2EDTA37017037.325015037.3720172004001525025025025018540037.3FeSO47H20Fe2(SO4)3KClFe2(C4H4O6)327.827.82.56520252827.8NH4H2PO4MnSO4H20MnS044H20ZnSO47H20H3B03KINa2Mo042H

30、20MoO3CuSO45H20CoCl26H2022.38.66.20.830.250.0250.025102.03.00.750.250.0250.025531.50.750.0010.01300101.05.01.00.10.20.17.57.54.43.81.60.8鹽酸硫胺素VBl煙酸鹽酸吡哆醇VB6肌醇甘氨酸0.10.50.51002.0101.01.01000.10.30.135.05.05.0100010.50.52蔗糖pH300005.8200005.5200005.6300005.8200005.8200005.5500005.8表2 常用基本培養(yǎng)基的特點(diǎn)基本培養(yǎng)基種類設(shè)計(jì)由

31、來(lái)特點(diǎn)適用范圍MS1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細(xì)胞而設(shè)計(jì)無(wú)機(jī)鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液；它的硝酸鹽和銨鹽含量較其他培養(yǎng)基為高，比例也比較合適，不需要添加更多的有機(jī)附加物。廣泛地用于植物的器官、花藥、細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)B51968年由Gamborg等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計(jì)除含有較高的鉀鹽外，還含有較低的氨態(tài)氮和較高的鹽酸硫胺素適合雙子葉植物，尤其木本植物的培養(yǎng)White1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計(jì)無(wú)機(jī)鹽數(shù)量較低，提高了MgSO4的濃度適于生根培養(yǎng)SH1972年由Schenk和Hidebrandt設(shè)計(jì)鹽分濃度較高，銨態(tài)氮含量較低，鹽酸硫胺素和硝酸鉀含

32、量較高在不少單子葉和雙子葉植物的組培中應(yīng)用效果較好Knudson C1922年由Knudson為蘭科種子培養(yǎng)而設(shè)計(jì)，后經(jīng)多次改良成分簡(jiǎn)單，不能滿足大多數(shù)植物組織細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)適用于蘭科植物種子培養(yǎng)和萌發(fā)VWVacin 和Went 在1949年設(shè)計(jì)培養(yǎng)基的總離子強(qiáng)度稍低些，磷以磷酸鈣的形式供給適用于氣生蘭的組培N61974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計(jì)成分較簡(jiǎn)單，KN03和(NH4)2S04含量高適用于單子葉植物花藥培養(yǎng)，廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他植物的花藥培養(yǎng)（三）培養(yǎng)基的組成培養(yǎng)基主要有水、無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)物、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、培養(yǎng)基的支持材料五大類組成。1.水 水是植

33、物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過(guò)程的介質(zhì)和溶媒。它是生命活動(dòng)過(guò)程中不可缺少的物質(zhì)。配制培養(yǎng)基母液時(shí)要用蒸餾水，以確保母液及培養(yǎng)基成分的精確性，防止貯藏過(guò)程發(fā)霉變質(zhì)，大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)可用自來(lái)水。但在少量研究上盡量用蒸餾水，以防成分的變化引起不良效果。2.無(wú)機(jī)元素(1)大量元素指濃度大于0.5 mmolL的元素，有N，P，K，Ca，Mg，S等。常由KN03、NH4NO3、KH2P04、NaH2P04、KCl、MgS047H20、CaCl22H20等化合物來(lái)提供。(2)微量元素指濃度小于0.5 mmolL的元素，F(xiàn)e，B，Mn，Cu，Mo，Co等。鐵是一些氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶、過(guò)氧化氫酶等的組成成

34、分。同時(shí)，它又是葉綠素形成必要的。培養(yǎng)基中的鐵對(duì)胚的形成、芽的分化和幼苗轉(zhuǎn)綠有促進(jìn)作用。在制作培養(yǎng)基時(shí)不用Fe2(S04)3和FeCl3(因其pH在5.2以上，易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀)，而用FeS047H20和Na2-EDTA結(jié)合成螯合物使用。B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物組織培養(yǎng)中不可缺少的元素，缺少這些物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育異常。3.有機(jī)化合物(1)糖類：這類有機(jī)物的作用一是培養(yǎng)物賴以生長(zhǎng)的碳源；二是使培養(yǎng)基維持一定的滲透壓。 種類：常用的有蔗糖、葡萄糖、果糖，麥芽糖、半乳糖、甘露糖等在組織培養(yǎng)中也有應(yīng)用。 使用濃度：一般在23。在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，可用食用的綿白糖代替。（

35、2）維生素類：這類化合物在植物細(xì)胞中主要以各種輔酶的形式參與多種代謝活動(dòng)，對(duì)生長(zhǎng)、分化等有很好的促進(jìn)作用。 種類：硫胺素(維生素B1)、吡哆醇(維生素B6)、煙酸(維生素B3，又稱維生素PP)、泛酸(維生素B5)、生物素(維生素H)、鈷胺素(維生素B12)、葉酸(維生素B11）等。 使用濃度：0.11.0 mg/L(3)肌醇(環(huán)己六醇)： 作用：在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用；參與細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的構(gòu)建；能促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)以及胚狀體和芽的形成；對(duì)組織和細(xì)胞的繁殖、分化有促進(jìn)作用。 使用濃度：一般為1OO mgL。(4)氨基酸： 作用：是很好的有機(jī)氮源，可被細(xì)胞直接吸收利用。 常用種類：甘氨酸、精

36、氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。有時(shí)應(yīng)用水解乳蛋白（LH）或水解酪蛋白（CH），但由于它們營(yíng)養(yǎng)豐富，極易引起污染。如在培養(yǎng)中無(wú)特別需要，以不用為宜。(5)天然復(fù)合物：其成分比較復(fù)雜，大多含氨基酸、激素、酶等一些復(fù)雜化合物。它對(duì)細(xì)胞和組織的增殖與分化有明顯的促進(jìn)作用，但對(duì)器官的分化作用不明顯。它的成分大多不清楚，所以一般盡量不使用。 椰乳 是椰子的液體胚乳。它是使用最多、效果最大的一種天然復(fù)合物，一般使用濃度在1020。它在愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)中有促進(jìn)作用。在馬鈴薯莖尖分生組織和草莓微莖尖培養(yǎng)中起明顯的促進(jìn)作用，但莖尖組織的大小若超過(guò)1 mm時(shí)，椰乳就不發(fā)生作用。 香蕉 用量為

37、150200 g/L。主要在蘭花的組織培養(yǎng)中應(yīng)用，對(duì)原球莖增殖有明顯促進(jìn)效果，并有利于壯苗與生根。 馬鈴薯 去掉皮和芽后，加水煮30 min，經(jīng)過(guò)過(guò)濾，取其濾液使用。用量為150200 gL。添加后可得到健壯的植株。4.植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì) 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)是培養(yǎng)基的關(guān)鍵性物質(zhì)，對(duì)植物組織培養(yǎng)起著決定性作用，控制著培養(yǎng)物的脫分化、再分化和形態(tài)建成。（1）生長(zhǎng)素類： 作用：在組織培養(yǎng)中，生長(zhǎng)素主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織形成，誘導(dǎo)根的分化和促進(jìn)細(xì)胞分裂、伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。 種類及活性：常用種類有IAA(吲哚乙酸)、NAA(萘乙酸)、IBA(吲哚丁酸)、2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)等。作用能力的強(qiáng)弱順序?yàn)椋?

38、，4-DNAAIBAIAA。 穩(wěn)定性：IAA是天然存在的生長(zhǎng)素，高溫高壓易被破壞，也易被細(xì)胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解，故要避光貯存，過(guò)濾滅菌。其他3種生長(zhǎng)素為人工合成，耐高溫高壓，不易被分解破壞。特別是NAA穩(wěn)定性好，活性較高，價(jià)格低廉，所以應(yīng)用最普遍。 溶解性：生長(zhǎng)素不溶于水，IAA、NAA、IBA配制時(shí)可先用少量95酒精助溶。2，4-D可用0.1 molL的NaOH或KOH助溶。（2）細(xì)胞分裂素類： 作用：誘導(dǎo)芽的分化促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長(zhǎng)，細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素相互作用，當(dāng)組織內(nèi)細(xì)胞分裂素生長(zhǎng)素的比值高時(shí)，誘導(dǎo)愈傷組織或器官分化出不定芽。促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大。抑制根的分化。因此，細(xì)胞分裂素

39、多用于誘導(dǎo)不定芽的分化、莖、苗的增殖，而避免在生根培養(yǎng)時(shí)使用。 種類及活性：這類激素是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA(6-芐氨基嘌呤)、Kt(激動(dòng)素)、Zt(玉米素)等。作用能力的強(qiáng)弱順序是：ZT6-BAKT，常用的是人工合成的、性能穩(wěn)定的、價(jià)格適中的6-BA。 溶解性：細(xì)胞分裂素不溶于水，也不溶于酒精，一般可溶于0.1mol/L的鹽酸或NaOH溶液中。（3）赤霉素(GA)：有20多種，培養(yǎng)基中添加的是GA3，主要用于促進(jìn)幼苗莖的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，促進(jìn)不定胚發(fā)育成小植株；此外，赤霉素還用于打破休眠，促進(jìn)種子、塊莖、鱗莖等提前萌發(fā)。一般在器官形成后，添加赤霉素可促進(jìn)器官或胚狀體的生長(zhǎng)。赤霉素溶于酒精，配制

40、時(shí)可用少量95酒精助溶。赤霉素不耐熱，高壓滅菌后將有70-100失效，應(yīng)當(dāng)過(guò)濾滅菌。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用量甚微，一般用mgL表示濃度。在組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用濃度，因植物的種類、部位、時(shí)期、內(nèi)源激素等的不同而異，一般生長(zhǎng)素濃度的使用為0.055 mgL，細(xì)胞分裂素0.0510 mgL。5.培養(yǎng)基的其他成分(1)瓊脂：在固體培養(yǎng)時(shí)瓊脂是最好的固化劑。瓊脂是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營(yíng)養(yǎng)。瓊脂能溶解在90以上熱水中，成為溶膠，冷卻至40即凝固為固體狀凝膠。瓊脂的用量在610 gL之間。一般瓊脂以顏色淺、透明度好、潔凈的為上品。瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工方式有關(guān)

41、外，還與高壓滅菌時(shí)的溫度、時(shí)間、pH等因素有關(guān)，長(zhǎng)時(shí)間的高溫會(huì)使凝固能力下降，過(guò)酸過(guò)堿加之高溫會(huì)使瓊脂發(fā)生水解，喪失凝固能力。時(shí)間過(guò)久，瓊脂變褐，也會(huì)逐漸喪失凝固能力。加入瓊脂的固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基相比，優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)便，通氣問(wèn)題易于解決，便于經(jīng)常觀察研究等，缺點(diǎn)是培養(yǎng)物的吸收面積?。桓鞣N養(yǎng)分在瓊脂中擴(kuò)散較慢，影響?zhàn)B分的充分利用；培養(yǎng)物排出的一些代謝廢物，聚集在吸收表面，對(duì)組織產(chǎn)生毒害作用。(2)抗生物質(zhì)：抗生物質(zhì)有青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，用量在520 mgL之間。添加抗生物質(zhì)可防止菌類污染，減少培養(yǎng)中材料的損失?？股馗饔衅湟志V，要加以選擇試用，也可兩種抗生素混用。但應(yīng)當(dāng)注意抗生素對(duì)

42、植物組織的生長(zhǎng)也有抑制作用。（3）抗氧化物：培養(yǎng)基中添加抗氧化物是為了抑制外植體和培養(yǎng)物褐變。常用的抗氧化劑有半胱氨酸、維生素C、檸檬酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等。（4）活性炭：活性炭有很強(qiáng)的吸附作用，它可以吸附非極性物質(zhì)和色素等大分子物質(zhì)，包括瓊脂中所含的雜質(zhì)，培養(yǎng)物分泌的酚類、醌類物質(zhì)及激素等。通常使用濃度為0.110gL。培養(yǎng)基中添加活性炭的作用：防止褐化；促進(jìn)生根；降低玻璃苗的產(chǎn)生頻率；活性炭在胚胎培養(yǎng)中也有一定作用。但是，活性炭具有副作用：吸附培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)；削弱瓊脂的凝固能力，添加時(shí)須注意。III.作業(yè)1.培養(yǎng)基的作用是什么？2.培養(yǎng)基一般包括哪些基本成分？3. 培養(yǎng)基中

43、添加的植物生長(zhǎng)調(diào)控物質(zhì)有哪些？ 各有什么作用？第三節(jié) 植物組織培養(yǎng)操作技術(shù)（3）一、授課章節(jié)第三節(jié) 植物組織培養(yǎng)操作技術(shù)（3）。二、學(xué)時(shí)安排2學(xué)時(shí)。三、教學(xué)目標(biāo)1掌握培養(yǎng)基母液的配制技術(shù)。2掌握培養(yǎng)基的配制、分裝包扎技術(shù)。3掌握培養(yǎng)基高壓滅菌技術(shù)。4掌握無(wú)菌操作技術(shù)。四、教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)分析重點(diǎn)：1培養(yǎng)基母液配制。2培養(yǎng)基的制備技術(shù)。3培養(yǎng)基的高壓蒸汽滅菌。4無(wú)菌操作技術(shù)。難點(diǎn)：1培養(yǎng)基母液、培養(yǎng)基配制的計(jì)算。2無(wú)菌操作技術(shù)步驟的剖析。五、教具電化教學(xué)設(shè)備、試管苗、接種工具、培養(yǎng)基。六、教學(xué)方法講授法，模擬實(shí)驗(yàn)法。七、教學(xué)過(guò)程.導(dǎo)入提問(wèn)：培養(yǎng)基的作用。復(fù)習(xí)：培養(yǎng)基的基本成分。II.新課（四）培養(yǎng)

44、基的配制1.培養(yǎng)基母液的配制：所謂母液是欲配制培養(yǎng)液的濃縮液，也稱貯備液。母液配制的目的一是方便快速配制培養(yǎng)基，二是保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性及配制時(shí)的快速移取。（1）母液配制方法單配法：將培養(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。一般mg/mL表示。混配法：將幾類營(yíng)養(yǎng)成分按配方中的用量擴(kuò)大一定倍數(shù)稱量，分別溶解后各類混合在一起定容到一定體積配成混合母液。（2）母液配制流程確定培養(yǎng)基配方確定母液種類計(jì)算稱量溶解混合定容分裝貼標(biāo)簽冰箱保存記錄（3）母液配制要求母液濃縮倍數(shù)：大量元素1020倍；微量元素100200倍；鐵鹽100倍；有機(jī)物100200倍。選用蒸餾水，分析純或化學(xué)純?cè)噭?，防止沉淀。?/p>

45、素母液濃度：0.51mg/mL，1次配成50mL或100mL（4）藥品用量的計(jì)算：配制母液時(shí)藥品用量(mg)=配方用量(mg)濃縮倍數(shù)制備容量（L）（5）母液配制技術(shù) 以MS培養(yǎng)基為例，配制過(guò)程如下：表1 MS培養(yǎng)基母液配制（單位：mg/L）母液種類成分規(guī)定量擴(kuò)大倍數(shù)稱取量母液體積(mL)配1L培養(yǎng)基吸取量(mL)大量元素KNO3NH4N03MgSO47H20KH2P04CaCl22H2O190016503701704401019000165003700170044001000100微量元素MnS044H20ZnS047H20H3B03KINa2Mo042H20CuS045H20CoCl26H

46、2022.38.66.20.830.250.0250.025100223086062083252.52.5l00010鐵鹽Na2EDTAFeS044H2037.327.810037302780100010有機(jī)物甘氨酸鹽酸硫胺素鹽酸吡哆醇煙酸肌醇2.00.10.50.510010020010505010000100010大量元素母液 配成濃縮10倍的母液。用感量0.01g托盤天平按表2-4稱取藥品，分別加入100mL左右蒸餾水中，再用磁力攪拌器攪拌促進(jìn)溶解，然后倒入1000mL容量瓶中，再加水定容至刻度，成為10倍母液。注意Ca2+和SO42、PO43易發(fā)生沉淀，因此CaCl22H2O充分溶解后

47、最后加入。微量元素母液 配成濃縮100倍的母液。用感量0.0001g分析天平按表2-4準(zhǔn)確稱取藥品后，分別溶解，混合后加水定容至1000mL。鐵鹽母液 配成濃縮100倍的母液，用感量0.01g托盤天平按表2-4稱取藥品，分別溶解，混合后加水定容至1000mL。有機(jī)物母液 配成濃縮100倍的母液。用感量0.001g分析天平按表2-4分別稱取藥品，溶解，混合后加水定容至1000mL。每種激素必須單獨(dú)配成母液，濃度一般配成0.51mgmL，用時(shí)根據(jù)需要取用。多數(shù)激素難溶于水，要先溶于特定溶劑，然后才能加水定容。具體方法為：IAA、IBA、GA、NAA等先溶于少量95的酒精中，再加水定容到一定體積；2

48、，4-D可用少量0.1mol/L的NaOH溶解后，再加水定容到一定體積；Kt和BA先溶于少量0.1mol/L的HCl中再加水定容。（6）母液的保存 將配制好的母液分別倒入試劑瓶中，貼好標(biāo)簽，在標(biāo)簽上注明母液名稱，配制倍數(shù)與日期。然后放入冰箱內(nèi)4低溫保存，用時(shí)再按比例稀釋。2.培養(yǎng)基的配制（1）培養(yǎng)基配制工藝流程確定培養(yǎng)基配方及用量計(jì)算母液用量移取母液定容玻璃器皿洗滌調(diào)節(jié)pH分裝培養(yǎng)基熬制高壓滅菌干燥稱取瓊脂、蔗糖封口標(biāo)識(shí)、記錄（2）培養(yǎng)基制備的操作步驟確定培養(yǎng)基配方及用量：根據(jù)培養(yǎng)對(duì)象、培養(yǎng)目的等，通過(guò)查閱資料及咨詢等確定培養(yǎng)基配方，然后據(jù)外植體的數(shù)量和試驗(yàn)處理的多少確定培養(yǎng)基的用量。稱取瓊脂

49、、蔗糖：用托盤天平分別稱取0.6%1%的瓊脂、2%3%的蔗糖。培養(yǎng)基熬制：量取純凈水放入加熱容器，純凈水的體積應(yīng)少于所配制培養(yǎng)基體積，約占終體積的2/33/4，加入稱量好的瓊脂和糖，接通電源加熱。邊加熱邊攪拌，防止糊底和溢出，至完全溶化。母液取用量的計(jì)算：基本培養(yǎng)基配方成分母液取用量（mL）=1000濃縮倍數(shù)制備培養(yǎng)基的體積（L）；生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)母液取用量（mL）=配方中的濃度（mg/L)母液濃度（mg/mL) 制備培養(yǎng)基體積（L）移取母液：根據(jù)計(jì)算出的母液用量，按大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成分、植物激素的順序?qū)⒛敢喝〕觯旌?。定容：將母液混合液加入到瓊脂完全溶化的培養(yǎng)基中，攪拌混勻，并加水

50、定容到所需體積。調(diào)節(jié)pH：用酸度計(jì)或精密pH試紙測(cè)試培養(yǎng)基溶液的pH(5.56.8)，偏堿滴加0.1mol/L的HCl調(diào)整，偏酸滴加0.1mol/L的NaOH調(diào)整，直到達(dá)到配方要求值。分裝：用乳膠管把配制好的培養(yǎng)基趁熱分裝到培養(yǎng)瓶中，100150mL的培養(yǎng)瓶每瓶裝入3035mL左右的培養(yǎng)基，分裝時(shí)數(shù)量要均勻、合適，培養(yǎng)基不沾附瓶口和瓶壁。封口：用合適的封口材料和線繩包扎。標(biāo)識(shí)與記錄：封裝好的培養(yǎng)基做好標(biāo)記放到高壓滅菌鍋中準(zhǔn)備滅菌。3.培養(yǎng)基的高壓滅菌加水：滅菌鍋加水至淹沒(méi)電熱絲（或高低水位線之間）。裝鍋：將培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)器械放入高壓滅菌鍋。密封：封閉高壓滅菌鍋各出氣口。加壓：接通電源加壓至0.0

51、5MPa。排氣：斷開(kāi)電源，打開(kāi)排氣閥，排冷氣至壓力為0MPa。穩(wěn)壓：接通電源，繼續(xù)加壓至0.1MPa開(kāi)始計(jì)時(shí)，保壓在0.10.15Mpa維持2030min，此時(shí)溫度在121125。降壓：穩(wěn)壓時(shí)間到，關(guān)閉電源自然冷卻至壓力為0MPa。出鍋：開(kāi)鍋后取出培養(yǎng)基冷卻，貯存于37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)24h無(wú)雜菌生長(zhǎng)，可保存?zhèn)溆谩?.培養(yǎng)基配制、分裝和滅菌時(shí)注意的問(wèn)題（1）培養(yǎng)基熬制時(shí)邊煮邊攪拌，防止糊底。用旺火煮開(kāi)，再用文火加熱，直至瓊脂全部融化。（2）配制培養(yǎng)基一定按母液順序依次加入。（3）熬制培養(yǎng)基過(guò)程中，先放入難溶解的瓊脂及有機(jī)附加物（馬鈴薯、香蕉等），最后加入藥劑混合液，因混合液中的有機(jī)物遇熱時(shí)間長(zhǎng)

52、易分解失效。（4）多數(shù)植物適宜的pH在5.66.5，而培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌pH一般會(huì)降低0.20.3個(gè)單位，故調(diào)節(jié)pH時(shí)應(yīng)比選定pH提高0.20.3個(gè)單位。（5）分裝培養(yǎng)基時(shí)，注意不能將培養(yǎng)基溶液噴灑到瓶壁口處，容易落菌污染。（6）滅菌過(guò)程中須完全排除鍋內(nèi)冷水汽，使鍋內(nèi)全部是熱水蒸汽，滅菌才能徹底。（7）培養(yǎng)基滅菌嚴(yán)格按要求時(shí)間進(jìn)行，如超過(guò)時(shí)間，培養(yǎng)基成分發(fā)生變化易失效。（8）培養(yǎng)基滅菌后，立即取出擺平冷卻。取出過(guò)晚凝固差，影響接種轉(zhuǎn)苗質(zhì)量。四、無(wú)菌操作（接種）技術(shù)接種是指把無(wú)菌的植物材料切割，經(jīng)無(wú)菌操作手序，放到培養(yǎng)基上的全部操作過(guò)程。它是組織培養(yǎng)過(guò)程中易于污染的一個(gè)環(huán)節(jié)，接種操作必須在無(wú)菌條件

53、下進(jìn)行。在接種前30min打開(kāi)無(wú)菌操作間和超凈工作臺(tái)的紫外燈進(jìn)行環(huán)境滅菌。照射20min后關(guān)閉紫外燈，打開(kāi)風(fēng)機(jī)使超凈工作臺(tái)處于工作狀態(tài)。接種人員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實(shí)驗(yàn)服，并換穿拖鞋等。接種人員上工作臺(tái)后，用70%75%酒精擦拭雙手，然后擦拭工作臺(tái)面。用70%75%酒精擦拭接種工具并反復(fù)灼燒。進(jìn)行外植體表面滅菌與接種：將外植體35個(gè)為一組放入70%75%的酒精溶液浸潤(rùn)1060S取出后再放入2%的次氯酸鈉溶液浸泡1015min用無(wú)菌水反復(fù)沖洗35次（1min/次）放入無(wú)菌吸水紙上吸干水分，進(jìn)行適當(dāng)切割打開(kāi)已準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基瓶蓋或封口膜，在酒精燈無(wú)菌圈內(nèi)接入外植體封口。如此反復(fù)操作，直到全部

54、外植體接種完成。注意工具用后及時(shí)滅菌，避免交叉污染。接種完畢，清理干凈工作臺(tái)。標(biāo)識(shí)接種材料并放入培養(yǎng)間培養(yǎng)。III.作業(yè)1.欲配制500毫升MS培養(yǎng)基大量元素母液，需硝酸鉀多少克？2.如何制備MS培養(yǎng)基？3.如何進(jìn)行無(wú)菌操作？第四節(jié) 植物組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)一、授課章節(jié)第四節(jié) 植物組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)。二、學(xué)時(shí)安排2學(xué)時(shí)。三、教學(xué)目標(biāo)1掌握植物組培快繁的流程。2掌握植物組培快繁的程序。四、教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)分析重點(diǎn)：植物組培快繁的程序。難點(diǎn)：初代培養(yǎng)中誘導(dǎo)外植體生長(zhǎng)與分化途徑。五、教具電化教學(xué)設(shè)備, 各培養(yǎng)階段的試管苗。六、教學(xué)方法講授法，演示法。七、教學(xué)過(guò)程.導(dǎo)入本次課主要介紹的是植物組織培養(yǎng)快

55、速繁殖技術(shù)。II.新課一、植物組培快繁的流程母體材料 外植體的選擇 外植體的處理 外植體的表面消毒 外植體的接種 初代培養(yǎng) 繼代培養(yǎng)（多次循環(huán)） 壯苗與生根培養(yǎng) 試管苗馴化與移栽二、植物組培快繁的程序（一）外植體的選擇1.外植體選擇的原則選擇優(yōu)良的種質(zhì) 外植體一定要選擇具有該品種典型特征、遺傳性穩(wěn)定、生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲害的優(yōu)良植株。選擇生理狀態(tài)良好的材料 盡量選擇幼嫩的、生理狀態(tài)良好的材料。選擇生長(zhǎng)旺盛、再生能力強(qiáng)的材料 在生長(zhǎng)季節(jié)選擇年幼的材料，這樣的材料生長(zhǎng)旺盛、再生力強(qiáng)，接種成功率高。選擇來(lái)源豐富的材料 為了建立一個(gè)高效而穩(wěn)定的組培快繁體系，需反復(fù)試驗(yàn)，所以一定要選用來(lái)源豐富的材料。選擇合

56、適的外植體大小 適宜的外植體大?。呵o尖分生組織0.20.5mm，莖段長(zhǎng)帶12個(gè)節(jié)，葉片0.5cm0.5cm。2.外植體的選擇就無(wú)菌短枝扦插、叢生芽培養(yǎng)來(lái)說(shuō)，木本植物、能形成莖段的草本植物以采取莖尖和莖段比較適宜；有些草本植物植株短小或沒(méi)有顯著的莖，可用葉片、葉柄、花萼、花瓣作外植體。（二）外植體的處理將采來(lái)的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細(xì)洗干凈，洗時(shí)可加入洗衣粉清洗，然后再用自來(lái)水沖凈洗衣粉水。洗滌結(jié)束后，進(jìn)入無(wú)菌操作室進(jìn)行消毒接種。（三）外植體的表面滅菌按照無(wú)菌操作技術(shù)中介紹的方法，打開(kāi)電源使超凈工作臺(tái)處于工作狀態(tài)，將接種工具、消毒的玻璃器皿、無(wú)菌水、配制好的滅菌劑等放入超凈工作臺(tái)

57、，接種員做好準(zhǔn)備進(jìn)入無(wú)菌操作室，點(diǎn)燃酒精燈，對(duì)接種工具進(jìn)行灼燒滅菌。外植體每35個(gè)為一組放入7075的酒精中浸泡1060S取出后放入2的次氯酸鈉溶液浸泡1015min用無(wú)菌水反復(fù)沖洗35次用已滅菌的剪刀或解剖刀將外植體切割到適當(dāng)大小，準(zhǔn)備接種。（四）外植體的接種先打開(kāi)已準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基瓶蓋或封口膜，將三角瓶?jī)A斜拿在手中，使瓶口靠近酒精燈火焰，并將瓶口在火焰上方轉(zhuǎn)動(dòng)灼燒數(shù)秒鐘。然后用鑷子夾取一塊切好的外植體送入瓶?jī)?nèi)，輕輕插在培養(yǎng)基上。將葉片背面接觸培養(yǎng)基，莖尖、莖段要按其生長(zhǎng)極性的上下端，正放在培養(yǎng)基上。外植體接種以每瓶放一枚組塊為宜。接完種后，將瓶口在火焰上再灼燒數(shù)秒鐘，蓋上瓶蓋或封口膜。然后再

58、接下一瓶，直到全部接種完畢。最后做好記錄，注明處理材料的物種名稱、處理方法、接種日期等。（五）培養(yǎng)1.培養(yǎng)條件（1）溫度 溫度是植物組織培養(yǎng)中的重要因素，大多數(shù)植物組織培養(yǎng)都在2327之間進(jìn)行，一般采用25土2。（2）光照 主要表現(xiàn)在光強(qiáng)和光照時(shí)間方面。組織培養(yǎng)中多采用20003000Lx的光強(qiáng)，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。（3）濕度 影響組織培養(yǎng)的濕度包括以下兩個(gè)方面：培養(yǎng)容器內(nèi)的濕度和培養(yǎng)室內(nèi)環(huán)境的濕度。一般要求培養(yǎng)室內(nèi)要保持7080的相對(duì)濕度。（4）培養(yǎng)基的pH 不同的植物對(duì)培養(yǎng)基最適pH的要求是不同的。大多數(shù)植物適宜的pH在5.66.5之間，一般培養(yǎng)基皆要求5.8。（5）滲

59、透壓 培養(yǎng)基中由于有無(wú)機(jī)鹽類、蔗糖等化合物，因此，會(huì)影響滲透壓的變化。通常12個(gè)大氣壓對(duì)植物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，2個(gè)大氣壓以上對(duì)植物生長(zhǎng)有阻礙作用。（6）氣體 氧氣是組織培養(yǎng)中必需的因素，瓶蓋封閉時(shí)要考慮通氣問(wèn)題，可用附有濾氣膜的封口材料。接種時(shí)應(yīng)避免把外植體全部埋入培養(yǎng)基中，以免造成缺氧。2.培養(yǎng)程序初代培養(yǎng)初代培養(yǎng)旨在獲得無(wú)菌材料和無(wú)性繁殖系。即接種某種外植體后，最初的幾代培養(yǎng)。初代培養(yǎng)建立的無(wú)性繁殖系包括：莖梢、芽叢、胚狀體和原球莖等。（1）頂芽和腋芽的發(fā)育頂芽和腋芽在離體培養(yǎng)中都可被誘導(dǎo)而生長(zhǎng)發(fā)育。從芽萌發(fā)變?yōu)橛字?，幼枝繼續(xù)生長(zhǎng)，形成新的頂芽和側(cè)芽。再將新形成的芽切割下來(lái)繼續(xù)培養(yǎng)，反復(fù)萌生新的枝條，在很短的時(shí)間內(nèi)重復(fù)芽枝苗的再生過(guò)程，就能生產(chǎn)出許多再生小植株。（2）不定芽的發(fā)育由外植體產(chǎn)生不定芽，通常首先要經(jīng)脫分化過(guò)程，形成愈傷組織的細(xì)胞。然后經(jīng)再分化形成器官原基。多數(shù)情況下它先形成芽，后形成根。即外植體產(chǎn)生愈傷組織產(chǎn)生不定芽產(chǎn)生植株。（3）體細(xì)胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育