生物實驗 免疫共沉淀

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1、完成《WB實戰(zhàn)指南》后，朋友曾央分享點免疫共沉淀方面的咚咚；當時不得不回絕。因為，WB指南是基于這些年的回復的匯總，基本上方方面面的問題都有提及，只需要做些串聯(lián)；而論及coIP，目前在國內(nèi)還不太普及，盡管它已經(jīng)是生化領域最基本的技術之一。因此，再想寫這么個長篇頗耗時間，于我的時間和精力太為難；不過，今天是個特殊的日子，湊湊熱鬧吧?！耍绻谀承┓矫娉晒α?，必然在另外一面有虧欠，也許這就是上帝的公允吧?！谧约鹤钌瞄L的地方找點成功的感覺吧，當然我的失敗也只是因為沒有更多的時間。。。哎！扯遠了 玩coIP也玩了5年多了，因為上手就是最難的B蛋白結(jié)合量多少的變化（假定IP A蛋白）而非檢測B

2、蛋白的有無，說句吹牛皮的話，在我們這個小領域三家最強的lab唯有我們敢于通篇基于這種檢測手段，所以，對于coIP算是非常得有心得了。以下論述基于最難的B蛋白結(jié)合水平變化的檢測，所以部分實驗操作非?？燎螅粚W會這個，其他就是小菜了；所以，這也算一個進階篇。 一.樣品的制備。 如《WB指南》，在這里我最強調(diào)從制備樣品開始的一致性。如果不觸及細胞的凋亡或死亡，那么任何處理組樣品和ctrl最后的終體積應該保持一致；如果細胞有大量凋亡或死亡，可以通過比對標準體積對樣品的體積粗略定量后再加裂解液，一般可以把誤差控制在WB的檢出范圍以下，基本保持樣品的均一；組織樣品可以通過稱重添加相應體積比的裂解液。

3、裂解液的配方可以采用《WB指南》里給出的，原配方如下：20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors（0.5M PMSF) 此裂解緩沖液裂解條件相對溫和，適合后續(xù)的coIP分析。 “不過”用它做coIP有明顯的缺陷； 要理解此配方的缺陷，我們先聊聊如何在coIP實驗中“作偽”。 偽造結(jié)果，也分為單純性造假和技術型偽造。撇去前者，從技巧上來講，如果要想獲得設定、預想的相互作用結(jié)果，可以從幾個角度著手——此類結(jié)果可重復。 a.在低鹽離子裂解液中進行IP。

4、 很多蛋白復合體對鹽濃度敏感，但敏感性有強弱之別。通常來說，真實存在著的蛋白復合體能耐受生理鹽（0.15M）或更高濃度，即在生理鹽濃度下不會解體。具體如，某種CDK和Cyclin其牢固程度能耐受0.8-1.0M以上的高鹽而不解體，即使其抑制蛋白CKI能耐受0.6M以上高鹽。因此，了解一個蛋白復合體對鹽濃度的耐受，既是一個幫助判斷蛋白復合體是否真實存在的一個重要依據(jù)，更是一個非常重要的生化數(shù)據(jù)；對某些體外生化反應的蛋白原料的純化制備也是很重要的輔助依據(jù)。例如，純化有生物活性的CDK和Cyclin，如果采用鹽濃度漂洗，則最低需0.6M以上以解離CKI。所以，在生化領域的coIP分析中，很多實驗體

5、系的鹽濃度是比生理鹽濃度更高的。當然，不排除某些弱相互作用需要生理鹽濃度，但這種情況不多見；也容易跟瞬時的相互作用混淆，某些實驗中的弱相互作用實際是由于生化反應的瞬時性，且缺乏有效的截留、富集手段，諸如酶和底物。 很多非生化領域的，喜歡在生理鹽或更低鹽濃度下進行coIP，這大大增加了假陽性的幾率——很多蛋白間非特異性的黏粘被記錄下來。這也成為了獲得“設定的”相互作用的有效手段。 b.過表達。 現(xiàn)在已經(jīng)存世的相當多的實驗論文和數(shù)據(jù)，其蛋白復合體相互作用的數(shù)據(jù)是通過過表達，甚至原核GST pulldown獲得的；筆者認為，在閱讀這類文獻時，大家要特別小心，多長一個心眼——即始終抱懷疑的態(tài)度。

6、并非說一定不可取，但是有一點很明確，這樣的數(shù)據(jù)送到我們手里，首先我們會要求對方補充內(nèi)源性蛋白相互作用的證據(jù)，否則該結(jié)果一律不采信。 在《WB指南》里面我提過，血清中豐富的BSA可以被任意抗體識別（其實也是一種相互作用），那么同理高豐度的兩種或多種蛋白人為拼湊到一起，為什么不可以非特異性的黏粘或者發(fā)生弱的相互作用呢？ 因此，如果想要“特定”的相互作用，可以考慮過表達所有的蛋白，就是核蛋白結(jié)合胞漿蛋白甚至膜表面受體也不稀奇。 c.不添加NP40一類表面活性劑，削弱對非特異性結(jié)合的拮抗。 NP40除可以在膜上穿孔外，也可以有效的拮抗非特異性的蛋白相互作用，提高coIP的特異性。因此，減少或不

7、添加NP40也可以輔助“預期”目的。 實際上，掌握a、b兩點技巧，基本上可以“無往而不勝”——徹底搞定一切“想要的”相互作用。 基于以上的原因，如果想獲得切實可靠的相互作用數(shù)據(jù)，那么裂解液的選取相當講究。 1.首先鹽濃度至少0.15M或以上。 鹽濃度主要指Na鹽濃度。有人會問為什么不是鉀鹽？因為鉀鹽會更容易跟某些試劑（或離子）形成沉淀，諸如SDS，因此在某些情況下，鉀鹽會對后續(xù)的某些實驗帶來未知的麻煩，所以一般鹽濃度指Na鹽。鹽濃度過低對某些與染色體結(jié)合較牢的蛋白的抽提（非破膜的溫和裂解）效率也較差，可能會丟失部分信息；而鹽濃度過高又會造成某些相互作用較弱的復合體解體，因此，通常選

8、擇0.15——0.3M做細胞裂解。純化蛋白通常選取0.6M以上進行IP。 小技巧：最初幾遍的漂洗buff要和IP時的鹽濃度相同。經(jīng)驗上，純化蛋白時，若用低鹽裂解細胞、高鹽漂洗去雜質(zhì)，蛋白丟失較多；所以，一般如前所述。當然，也可以高鹽裂解低鹽漂洗，但是對除雜質(zhì)不利。 2.通常IP體系中NP40含量0.2——0.5%。NP40在0.5——1.0%時，染色體很容易析出（很黏，成膠狀會裹住beads，同時粘下很多蛋白），用這樣的裂解液破碎細胞則可能需要超聲。通常由于習慣上避免增加不必要的操作，所以在非必要的情況下，選擇前述的濃度區(qū)間。 3.可適當添加EDTA，螯合金屬離子保護DNA和蛋白。特殊情

9、況下還可選擇添加EGTA，螯合Ca2+研究鈣相關蛋白。此外，裂解液中甘油濃度一般介于15%-20%之間。 4.很多市售或自制的裂解液過于溫和，需要考慮采用機械或者超聲等手段提高裂解效率（超聲要慎用，可能破壞弱的相互作用）。但是，有些時候裂解液的凍融又可能影響某些弱的相互作用，所以不太建議凍融裂解液——即最好裂解液制備好后立即進行coIP。當然，如果證實凍融無影響可考慮將蛋白樣品保存-80度待用，這對實驗日程的安排會更平易。 5.裂解產(chǎn)物的蛋白濃度越高越好。前幾日回復一貼子，不知道出于什么動因該LZ主動稀釋裂解樣品的蛋白濃度再IP，所幸不是做coIP。上面提到過表達會制造相互作用的假象，反過

10、來說蛋白濃度過稀，某些相互作用就測不到（不一定是弱的相互作用）。因此，細胞的裂解效率會直接影響實驗的結(jié)果。通常細胞裂解產(chǎn)物的蛋白濃度可達7-8mg/ml左右，但是更常規(guī)的現(xiàn)象是達不到這種濃度；當然不是說低于7-8mg/ml就不能進行coIP，只是需要考慮這一因素。因此，在多數(shù)情況下要盡可能避免稀釋你的細胞裂解液。 【補充1】： 切記！實驗要先有結(jié)果再來挑戰(zhàn)極限！ 在不少人的提問給出的流程中，其開始的樣品量往往是以6 well或者60mm dish為單位的；不否認某些蛋白或復合體確實可以在如此苛刻的條件下完成coIP。但是，更多的時候不是這樣子的。以我自己研究的復合體為例，其內(nèi)源性IP最低

11、起始細胞數(shù)是40-50% confluence的145mm dish；比這個數(shù)目更低，實驗結(jié)果就很不穩(wěn)定甚至無信號。當某些藥品、試劑非常昂貴時，鄙人才會勉為其難。否則，一律2 dishes 100% confluence，可以elute成30ul跑兩次；相互作用微弱時，15ul僅跑一次；再弱，多養(yǎng)幾塊板（CE增加抗體和beads仍可保持不變，因此只浪費培養(yǎng)基總比浪費一個冗長的時間走麥城要好）。后續(xù)若為質(zhì)譜分析，需考慮小規(guī)模量產(chǎn)。 二、IP前的準備工作： coIP:分為內(nèi)源性蛋白的相互作用和非內(nèi)源性蛋白相互作用（后者包括外源蛋白之間以及外源拖內(nèi)源蛋白）。 非內(nèi)源性蛋白的相互作用，主要是

12、通過過表達來實現(xiàn)，通常為簡化實驗、提高IP效率會讓外源蛋白帶上標簽（tagged；這也是沒有相應的可用于IP的內(nèi)源蛋白抗體之前唯一可行的方案），因此就tag的使用而言存在很多小技巧。 a.His-tagged主要用于純化蛋白。有些人喜歡用His-tagged蛋白然后進行coIP，實際上它存在潛在的隱患。當初鄙人用Sigma a-His（鼠單抗；免費廣告）WB外源蛋白發(fā)現(xiàn)CE里面一塌糊涂（帶型漂亮就是非常多的帶），那時候還抱怨這個抗體特異性不好。后來，當了解到很多蛋白會有富含histidine的domain以后，恍然大悟，恰恰是因為效價非常好，所以很多內(nèi)源性的蛋白都被該抗體識別。同理，如果用N

13、i-NTA beads去PD His-tagged的蛋白，完全有可能PD那些內(nèi)源性的富含histidine domain的蛋白，造成coIP的假象，而這樣的蛋白還非常多。 那么，當初開發(fā)His tag的主要目的，個人認為主要是可以用廉價的化學試劑洗脫，且Ni-NTA beads這類非抗體類的beads成本低廉，可大量工業(yè)生產(chǎn)。因此，用這個tag去生產(chǎn)有活性的蛋白是首選。 b.tandem-tagged不能用于分析鈣調(diào)信號通路。tandem tag實際上從成本角度和His tag差不多，洗脫試劑價格低廉，因此可用于大規(guī)模PD之后的質(zhì)譜分析，能獲取最全面的相互作用的信息。然后由于其中包含鈣調(diào)蛋

14、白相互作用domain，天然會結(jié)合鈣信號相關蛋白，從而干擾或掩蓋靶蛋白與鈣信號蛋白之間的相互作用，有一定的應用局限。當然，筆者不太清楚近年來該方法有無改進，但正是由于引入鈣調(diào)domain才實現(xiàn)了降低成本的目的，因此猜測可能性不大。 c.Myc、HA、Flag-tagged： Myc仍然會有天然的干擾，應用略有局限；相較后兩者是人工合成專門用于tagged蛋白（有相應的專利，因此目前無論抗體或交聯(lián)好的beads價格都非常昂貴），因此干擾最小、最常用。如需進一步細致區(qū)分，a-Flag效價比a-HA略高，因此更適合IP。當然，公司仍在努力尋找效價更好的a-HA以及IP HA的抗體（Flag系Si

15、gma專利，因此目前只能忍受其過高的定價）。那么，之前頗流行的a-HA鼠源單抗（其clone名稱為12CA5）為何被潛在地摒棄了？ 原因大概是：該克隆株可以輕易獲取，流傳甚廣，因此可以取腹水自制；效價不高，特異性很差。尤其是特異性的問題，用該抗體去交聯(lián)的beads做coIP，隱患很大（可以輕易PD非常濃的非特異性蛋白）——因此，購買商品化a-HA beads時，請仔細閱讀產(chǎn)品說明（避開12CA5系列）。 還有GST等等，不一一列舉了。 d.tag的位置。將tag構建到蛋白的N端還是C端，也是一個潛在的能夠影響coIP結(jié)果的因素。比如，分泌蛋白的N端通常有分泌信號肽，如果將tag構建到N端

16、，則外泌時會被信號肽酶連同信號肽一起切除；所以這時必須構建在C端。再如，多數(shù)蛋白的C端是疏水區(qū)，有的時候?qū)ag構建在C端會影響蛋白原來的空間結(jié)構，如恰好C端同時是相互作用的結(jié)構域，某些時候還可能被遮蔽，從而干擾相互作用。因此，通常構建質(zhì)粒的時候是N端、C端tagged同時分別構建，以備萬一。 內(nèi)源性蛋白的相互作用，主要依靠抗體IP，WB或者質(zhì)譜分析。另外一條途徑，是用外源性蛋白的coIP指代內(nèi)源性蛋白，上文提到的tandem-tag技術的目的就是為了實現(xiàn)這種可能。它的核心是將外源性蛋白的過表達降低極低水平用于模擬體內(nèi)環(huán)境。實際上，在構建外源過表達體系的時候，通?？梢缘玫揭幌盗斜磉_水平差

17、異的穩(wěn)定單克隆，可以通過進一步篩選獲得外源與內(nèi)源相加與原內(nèi)源蛋白水平相當?shù)募毎辏ㄔ诩毎{(diào)控承受的范圍以內(nèi)，內(nèi)源性蛋白水平會因為相應的外源蛋白表達而適當下調(diào)），這樣的細胞株可以用于模擬內(nèi)源性蛋白的相互作用；因為理論上未改變細胞的生理特異，相應的生命過程仍受內(nèi)源因素調(diào)控。 當然構建相應的細胞株需要轉(zhuǎn)染并篩選，又因為要控制表達量水平，篩選工作耗時更長；并且細胞狀態(tài)會因為傳代過多而有些改變。因此，絕對的內(nèi)源性蛋白的相互作用仍是一個不可或缺的數(shù)據(jù)，尤其對一個新發(fā)現(xiàn)的蛋白復合體。 IP內(nèi)源性蛋白首先要確認相應的抗體是否能夠用于IP。能夠用于IP的抗體，通常其識別區(qū)域恰是天然狀態(tài)下靶蛋白暴露于外的區(qū)段

18、，常為疏水性結(jié)構域；因此在自己制備抗體的時候要更多考慮這個因素，至于商品化的要仔細閱讀說明。 在確定抗體可以用于IP A蛋白以后，抗體投入量如何掌握呢？通常情況下0.1ug-3ug較常用（純化的抗體），其變化取決于抗體的效價，但通常未知情況下0.5ug或1ug是最常用。一般如果樣品易制備則盡量用樣品過飽和抗體，讓投入抗體能物盡其用；相反，通常1ug抗體已經(jīng)是過量的。 另外一個需要考慮的因素是B蛋白的大小，尤其B蛋白已知。當B蛋白分子量接近55KDa或24KDa附近的時候，問題會比較復雜。因為在最后一步洗脫的過程，很容易將輕鏈和重鏈帶入到IP終產(chǎn)物，它將嚴重干擾實驗結(jié)果。 解決

19、方案： 1. IP外源tagged-A蛋白，洗脫盡量用相應的peptide，一方面提高特異性，另一方面由于洗脫條件溫和，重鏈和輕鏈脫落也會較少；在IP前，尤其對于新Flag、HA beads可以用washing buffer或者低pH Glycine-HCl漂洗一下beads，把結(jié)合不牢的重鏈和輕鏈先洗掉。此外，F(xiàn)lag、HA-beads通常是鼠抗，那么IB B蛋白的抗體應該選用兔抗。 針對beads的新舊，反過來說，采用再生的舊beads有利于避免輕重鏈的干擾，且IP前的封閉可以省去——不要指望高鹽、酸洗能徹底去除已經(jīng)非特異結(jié)合到beads上的雜質(zhì)，通常這些蛋白都比較黏。高鹽、大量純

20、化蛋白時，采用再生的beads可以獲取即便銀染，背景仍非常干凈的高純度蛋白樣品。 2. IP內(nèi)源性蛋白，尤其最后涉及低pH Glycine-HCl洗脫或者SDS LB煮beads（后者重、輕鏈更嚴重），如B蛋白為60KDa即能與55KDa重鏈分開時，且抗體效價許可的前提下，降低抗體投入量會顯著減弱重、輕鏈信號，從而不會使得B蛋白信號不致被重鏈信號吞沒；若有條件再配合交錯抗體種屬來源，即IP A蛋白的抗體為兔抗，IB B蛋白用兔抗以外任何一種諸如鼠抗、羊抗；反之亦然。即使交錯抗體的種屬，實際上當重輕鏈脫落過多時（尤其是重鏈），在IB的時候它符合《WB實戰(zhàn)指南》提到的雜蛋白過濃會非特異結(jié)合任

21、意抗體，這在coIP的實驗結(jié)果分析中要格外小心。有人會說可以用未免疫的IgG做陰性對照，但是偶爾會發(fā)生一些未知意外，恰好IgG的重鏈沒有顯影（畢竟這不是抗原抗體特異性結(jié)合）?！綛TW：偶爾這樣的結(jié)果還能重復出來，但是反過來IP B蛋白，IB A蛋白可能就100%失敗。所以，當?shù)鞍追肿恿拷咏?、輕鏈的時候，下結(jié)論要格外小心，除嚴格陰性、陽性對照外，reverse IP的結(jié)果也很重要。最好加一個不相干的蛋白的同種屬的抗體做陰性對照】 beads封閉和樣品的preclear： 如果采用新beads，beads的封閉就顯得非常必要。封閉用1-5mg/ml BSA（ChIP還要加魚精DNA）扔b

22、uffer里一直靜置就好了；若臨時添加可考慮翻轉(zhuǎn)半小時；樣品preclear用protein A beads翻轉(zhuǎn)半小時。實際經(jīng)驗，雜蛋白若是很黏怎么處理都只是相對好一些。所以，IP、漂洗的鹽濃度影響更大。 coIP： 抗體劑量上文提過了；其他flag、protein A等等beads一般用10ul足夠了，偶爾根據(jù)需要微調(diào)，諸如過表達純化蛋白?？傊?，一般CE的成本較低，若用CE飽和抗體、beads，只要你抗體、beads和操作始終一致，最后IP的A蛋白能保證一致，結(jié)果有效。 干粉狀的beads用IP buffer充分溶脹后離心去beads的碎片；其他液態(tài)的不需要此過程?，F(xiàn)在市售的商品化

23、beads如sigma flag可不需要IP buffer漂洗直接IP，未發(fā)現(xiàn)對coIP結(jié)果的明顯干擾。通常，再生的beads由于放置-20度延長保存期需要加入大量甘油，不漂洗直接使用不容易把beads分勻，從而造成不同tube間初始差異，這時候會對IP結(jié)果影響很大。 用抗體做內(nèi)源性IP時，個人喜歡抗體2hr+beads 1hr，抗體孵育可過夜；beads不超過3hrs（含flag等等標簽蛋白IP情況）。這里面提到一個細節(jié)，就是先加beads還是先加抗體。在某些情況下，CE離心去除細胞碎片后的上清是一個剛好的溶解平衡體系，添加其他物質(zhì)如beads這類可作為沉淀凝結(jié)核的物質(zhì)會破壞原本的溶解平衡

24、；它可能類似水蒸氣凝結(jié)成雨水或雪花需要灰塵作為凝結(jié)核，其結(jié)果就是讓一些原本溶解完全的蛋白發(fā)生沉淀。那么，beads翻轉(zhuǎn)越久蛋白會沉淀越多，而這種沉淀無法靠漂洗去除干凈，最終進入sample從而可以檢測到任意蛋白的結(jié)合。因此，限制beads翻轉(zhuǎn)孵育時間非常關鍵；通常beads孵育1-2hr已經(jīng)充分結(jié)合了。 做IP的beads其物理性質(zhì)跟吸附DNA的或諸如Ni-NTA之類的差異很大，不需要高速離心，通常臺式小離心機4-5K、30sec就足夠了；有時候忘記了，靜置較久beads已自然沉降甚至不需要離心。在這種情況下，不必要的高速離心只會給beads施加巨大的離心力，次數(shù)多了beads通通碎裂，嚴重

25、影響再生beads的質(zhì)量——避免一些不必要的操作；當然不打算重復使用就無所謂了。 。。。 Beads再生： 商品化的beads尤其抗體交聯(lián)的，因為抗體和專利的原因價格相對昂貴，那么回收beads并再生就顯得非常必要。保管得好（防霉變），beads可以重復用20-30次。 再生beads沒有什么特別的，常做生化柱層析的，那簡直就是家常便飯。IP用beads的再生，也無非就是高鹽接酸洗再高鹽，最后用IP漂洗buffer復性，加甘油和NaN3扔-20度長期保存。 高鹽即3M NaCl；酸洗，就是可用做elution buffer的0.1M pH3.0的Glycine-HCl。IP

26、beads尤其抗體交聯(lián)的，由于昂貴再加實驗和回收過程的損失一般體積不大，所以Biorad公司一種小型塑料的柱層析管用來再生beads最合適（它是一次性的，但僅僅用于再生beads可以無限重復使用）；而常規(guī)的玻璃生化層析柱即便最小號的也太大，黏壁損失會很大，beads再生幾次可能就全損失了。 再生操作就類似做DNA大抽的KIT，加液體到層析柱、控制流速讓其一滴滴流下；再生質(zhì)量可以通過改變酸、鹽的體積控制，希望干凈點多加一些、多洗幾遍。 唯一需要注意的，由于再生流程通常要耗費半天時間，beads太少不值得操作且再生次數(shù)越多黏壁損失也越多；所以，通常都是等回收的舊beads積攢到一定體積再一次性

27、操作。前文提過，IP用的beads通常不需要離心就會自然沉降，而積攢舊beads通常是一個很漫長的過程，那么等到?jīng)Q定再生的時候，beads可能因為靜置過久而已經(jīng)壓擠得非常結(jié)實；直接重懸beads轉(zhuǎn)移到層析柱里，你會發(fā)現(xiàn)液體根本流不下來。因此，對于靜置很久的舊beads通常在回收前一天高速翻轉(zhuǎn)過夜，這時候再把beads轉(zhuǎn)移到層析柱中就會相對疏松，酸、鹽洗滌就會比較流暢。同樣的原因，再生過程中通常就是流速越來越慢，再生次數(shù)多的舊beads其內(nèi)含的灰塵、顆粒也較多，可能最后液體就不滴了；這時候只能用槍反復吹吸、松松beads。當然，這些問題都只在beads體積較大的時候時明顯，如果本來就不足1ml，

28、以上就全是廢話。 PS:此篇更新會相當慢，盡量不太監(jiān)，請見諒——先留個爪 有感于壇友對本文的關注： 【近況】：非常抱歉最近一直沒更新，原因主要有二。 1. 思路中斷。這篇要全新寫，通盤的概念是有的，但對于每個細節(jié)以及內(nèi)容的銜接很模糊，很難下筆；因為即使勉強著述，按個人行文的習慣，前后修改等于重寫，時間需要很久。 2. 最近忙于結(jié)尾自己的手頭課題，拼盡全力追求進度，連續(xù)多日工作14-16小時以上，身體已多次出現(xiàn)過勞體征；還要應付研究以外的工作，實在無暇顧及這邊。 目前，我優(yōu)先保證問題的回復。 exciting news: paper accepted! BTW:個人還是喜歡先回復再寫一個總結(jié)，因為接觸到的問題會比較全面，諸如最近好幾個人提問時，給出了詳細的流程，這很好；可是當我看到第一步，就知道下面不用細看了?？赡芎芏嗳硕枷矚g在刀尖上跳舞玩心跳，不過我個人還是喜歡穩(wěn)穩(wěn)當當先有結(jié)果再來跳舞——為什么很多人起始細胞量只有6孔板、60mm dish，大家都喜歡這么虐待自己嘛——讓心靈承受一次次實驗無信號的打擊?。浚?？??？ 因此，我也知道在制備CE那一部分需要補充強調(diào)的東西。